Rôle du récepteur rénal aux androgènes dans les différences entre les sexes dans le métabolisme de l'ammoniac

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Automne N. Harris et al

Résumé

Il existe des différences entre les sexes dans le métabolisme et la structure de l'ammoniac rénal, dont beaucoup sont médiées partestostérone. Le but de la présente étude était de déterminer le rôle de l'expression rénale dela testostéronerécepteur canonique, récepteur aux androgènes (AR), dans ces dimorphismes sexuels. Nous avons étudié des souris avecun rein-délétion AR spécifique [KS-AR-knockout (KO)] générée à l'aide de techniques Cre/loxP ; les souris témoins étaient des compagnons de litière Cre-négatifs (type sauvage). Chez les souris mâles mais pas femelles, KS-AR-KO a augmenté l'excrétion d'ammoniac, ce qui a éliminé les différences entre les sexes. Bien que la taille structurelle rénale soit généralement parallèle à l'excrétion d'ammoniac, KS-AR-KO a diminuéun reinla taille, la densité volumique du tubule proximal cortical et la hauteur des cellules du tubule proximal cortical chez les mâles - ni l'une ni l'autre n'ont été modifiées chez les femelles et la densité volumique du canal collecteur n'a pas été modifiée chez les deux sexes. L'analyse de la protéine clé impliquée dans la manipulation de l'ammoniac a montré chez les souris mâles que KS-AR-KO augmentait à la fois l'expression de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK) et du cotransporteur Na þ -K þ -2Cl (NKCC2) et diminuait l'échangeur Na þ/H þ expression de l'isoforme 3 (NHE3) et du cotransporteur électrogène Na þ -bicarbonate 1 (NBCe1)-A. Chez les souris femelles, KS-AR-KO n'a pas modifié ces paramètres. Ces effets se sont produits même si KS-AR-KO n'a pas modifié le plasmatestostérone, l'apport alimentaire ou le sérum Na þ, K þ ou HCO3 de manière significative dans les deux sexes. En conclusion, les voies de signalisation dépendantes de l'AR chez les hommes, mais pas chez les femmes,reinsrégulent l'expression de PEPCK et NKCC2 et conduisent aux différences sexuelles dans l'excrétion d'ammoniac. Effets opposés sur NHE3 et NBCe1-Une expression limite probablement l'ampleur des changements d'excrétion d'ammoniac. Comme AR n'est pas présent dans le membre ascendant épais, l'effet de KS-AR-KO sur l'expression de NKCC2 est indirect. Enfin, la RA médiatise la plus grandeun reinla taille et la densité volumique des tubules proximaux chez les mâles par rapport aux souris femelles.

NOUVEAU & REMARQUABLELes dimorphismes sexuels dans le métabolisme de l'ammoniac impliquent des voies de signalisation dépendantes des récepteurs aux androgènes (AR) chez l'homme, mais pas chez la femme,reinsqui conduisent à une modification du tubule proximal (PT), de la phosphoénolpyruvate carboxykinase et de l'expression du cotransporteur Na þ -K þ -2Cl du membre ascendant épais. Réponses adaptatives dans l'échangeur Na þ/H þ 3 et le cotransporteur électrogène Na þ -bicarbonate 1-Une expression limite l'ampleur de l'effet sur l'excrétion d'ammoniac. Enfin, la plus grande taille de rein et la densité de volume PT chez les souris mâles sont le résultat de la signalisation androgène PT via AR.

mots clés : acide-base ; ammoniac; récepteur aux androgènes; différences sexuelles;testostérone

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INTRODUCTION

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 % de la réponse aux stimuli exogènes (10-16). La dérégulation de l'homéostasie acido-basique affecte directement pratiquement tous les principaux systèmes d'organes, accélère la progression de la maladie rénale chronique et est corrélée à une mortalité accrue (17-19).

Nos études ont montré qu'il existe d'importants effets sexuels sur le métabolisme de l'ammoniac et sur la structure rénale. Le rein masculin excrète moins d'ammoniac que le rein féminin et ce malgré le fait que le rein masculin soit plus gros et ait un plus grand volume cortical que le rein féminin (20). Cette différence dans l'excrétion d'ammoniac est en corrélation avec des variations dans de multiples aspects rénaux, y compris plusieurs enzymes impliquées dans la génération et le recyclage de l'ammoniac, dans la taille des tubules proximaux, dans la branche ascendante épaisse de l'anse de Henle (TAL) Naþ -Kþ ​​- 2Cl - l'expression du cotransporteur (NKCC2), et dans la taille des cellules intercalées du canal collecteur et l'expression de la glycoprotéine Rhésus (Rh) (20). Enfin, il existe des différences entre les sexes dans la réponse à la charge acide (21). Beaucoup de ces différences entre les sexes sont inversées par l'orchidectomie grâce à un mécanisme abrogé par la physiologie.testostéroneremplacement, suggérant qu'ils impliquenttestostéronevoies de signalisation dépendantes (22).

La voie canonique par laquelletestostéronemédie les effets biologiques implique la liaison au récepteur des androgènes (AR) (23, 24). L'expression de la protéine AR et de l'ARNm a été observée dans les reins des hommes et des femmes depuis des décennies (25–28). Nous avons récemment montré que la protéine AR est exprimée spécifiquement dans le tubule proximal et que l'expression n'était détectable ni dans le TAL ni dans le canal collecteur (22), où il existe des différences sexuelles connues dans les protéines impliquées dans la manipulation de l'ammoniac. Nos études ont en outre montré que l'expression AR du tubule proximal était présente dans les reins masculins et féminins, l'expression étant environ deux fois plus importante dans le rein masculin que dans le rein féminin (22). Ces observations suggèrent que la RA peut médier certains, mais pas tous, des effets du sexe sur la structure rénale et sur la production et le transport d'ammoniac. Ils soulèvent également la question du rôle de la RA dans le rein féminin.

Ainsi, le but de la présente étude était de déterminer le rôle de l'AR rénal dans la médiation de ces dimorphismes sexuels identifiés dans le métabolisme rénal de l'ammoniac et la structure rénale. Étant donné que l'activation de l'AR a de nombreux effets biologiques, qui peuvent modifier indirectement l'homéostasie acido-basique et donc la manipulation de l'ammoniac, l'interprétation des études utilisant l'inhibition pharmacologique de l'AR et/ou la suppression globale de l'AR est compliquée. Par conséquent, la présente étude a utilisé des souris avec une délétion AR spécifique au rein [KS-AR-knockout (KO)] générée à l'aide de techniques Cre-loxP. Nous avons comparé des souris Cre-positives avec leurs compagnons de litière Cre-négatifs pour déterminer l'effet de KS-AR-KO. Des souris mâles et femelles ont été évaluées pour permettre de comprendre le rôle de la RA chez les deux sexes.

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MÉTHODES

Animaux

Nous avons utilisé des souris avec des sites loxP flanquant l'exon 2 du gène AR (ARflfl/flfl), qui ont été décrits précédemment (29–31). Nous avons induit la suppression de l'AR du rein entier en reproduisant des souris exprimant la Cre-recombinase sous le contrôle du promoteur Pax-8 (Pax8Cre ; 32). Les souris KS-AR-KO étaient ARflfl/flfl, Pax8-Cre þ ; les souris témoins étaient ARflfl/flfl, Pax8-Cre. Toutes les souris étaient sur la souche de fond C57/Bl6. Nous avons génotypé toutes les souris à l'aide d'ADN extrait d'échantillons de pinces de queue. Les souris utilisées dans ces expériences étaient des souris adultes mâles et femelles âgées de -4 mois. Les souris ont été maintenues sur un régime alimentaire standard pour rongeurs (18 % de protéines, Harlan Teklad, Madison, WI) avec un accès gratuit à l'eau. L'Université de Floride et les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux du système de santé des anciens combattants de la Floride du Nord et de la Géorgie du Sud ont approuvé tous les protocoles relatifs aux animaux. L'élevage d'animaux a été effectué à l'Université de Floride du Collège de médecine du cancer et de la génétique Transgenic Animal Core Facility par du personnel qualifié.

Expériences de cage métabolique

Les souris ont été placées dans des cages métaboliques pendant 3 jours et nourries avec un régime normal en poudre (18 % de protéines, Harlan Teklad) mélangé 1:1 avec de l'eau. La consommation alimentaire quotidienne a été mesurée et des échantillons d'urine quotidiens 24-h ont été collectés. Des échantillons d'urine ont été recueillis dans des tubes contenant de l'huile minérale équilibrée en eau pour empêcher l'évaporation et la perte de molécules de gaz. Le volume quotidien d'urine et le pH ont été enregistrés. Les échantillons d'urine ont été stockés à - 20 degré jusqu'à ce qu'ils soient analysés plus avant.

Analyse de sang

Le sang a été obtenu par canulation de l'aorte abdominale chez des souris anesthésiées à l'isoflurane, aspiré dans une seringue héparinée et immédiatement analysé pour les concentrations de Naþ, K þ et de bicarbonate à l'aide d'un analyseur microanalytique des gaz sanguins Siemens (RAPIDLab 348 Analyzer, Siemens, Munich, Allemagne ). La testostérone sérique a été mesurée au Centre de recherche sur le dosage et l'analyse des ligands de la reproduction de l'École de médecine de l'Université de Virginie (ELISA de testostérone de souris IBL America, Minneapolis, MN)

Analyse urinaire

L'ammoniac urinaire a été mesuré à l'aide d'une modification d'un kit disponible dans le commerce (A7553, Pointe Scientific, Canton, MI), comme décrit précédemment (20, 33). Le pH de l'urine a été mesuré à l'aide d'une électrode micro-pH (ROSS semi-micro pH, Orion 8103BN, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). L'excrétion d'acide titrable a été déterminée en utilisant des techniques standard décrites précédemment (20, 33).

Anticorps

Le tableau 1 montre les anticorps utilisés dans cette étude, leurs fournisseurs et leurs numéros de catalogue/identification.

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Préparation de protéines

Les animaux ont été anesthésiés avec de l'isoflurane inhalé et les reins ont été rincés par perfusion cardiaque in vivo avec du PBS (pH 7,4) contenant 6,000 U/L d'héparine Na et 120 mg/L de lidocaïne. Le rein droit a été retiré rapidement et le cortex, la médullaire externe et la médullaire interne ont été isolés sur une platine froide sous un microscope à dissection. Les échantillons ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide et conservés congelés à - 80 degré jusqu'à leur utilisation. Les tissus ont été homogénéisés dans le réactif d'extraction de protéines tissulaires T-PER (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) à l'aide de pilons à microtubes (USA Scientific, Ocala, FL), et les protéines ont été extraites conformément aux recommandations du fabricant. Une aliquote a été utilisée pour la quantification des protéines totales à l'aide d'un test d'acide bicinchoninique (BCA), et le reste a été stocké congelé à 80 degrés jusqu'à utilisation.

Procédures d'immunoblot Dix microgrammes de protéine rénale ont été soumis à une électrophorèse sur un PAGE ReadyGel à 10 % (Bio-Rad, Hercules, CA). Les gels ont été transférés par électrophorèse sur des membranes de nitrocellulose, bloqués avec 5 g/dL de lait écrémé en poudre dilué dans du tampon Blotto (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA et 0,05 % Tween 20, pH 7,6) et incubés à 4 C pendant la nuit. avec l'anticorps primaire dans le lait écrémé en poudre. L'équivalence de chargement et de transfert a été évaluée avec la coloration Ponceau S et en évaluant l'expression de la protéine domestique b-actine. Après avoir été lavées, les membranes ont été exposées à un anticorps secondaire (IgG anti-lapin de chèvre, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) conjugué à de la peroxydase de raifort à une dilution de 1:5,000. Les sites de réaction anticorps-antigène ont été visualisés à l'aide d'une chimiluminescence améliorée (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) et d'un système d'imagerie numérique Kodak Image Station 440CF. Dans des expériences sélectionnées, les transferts ont été dépouillés. La densité de bande a été normalisée de telle sorte que la densité moyenne dans une région (cortex ou moelle externe) dans le tissu de type sauvage (WT) mâle était de 100. Les deux sexes (mâle et femelle) et les deux génotypes (WT et KO) ont été chargés sur le même gel pour ces expériences. L'absence de saturation a été confirmée en examinant la distribution de l'intensité des pixels dans tous les immunoblots.

Procédures d'immunoblot

Dix microgrammes de protéine rénale ont été soumis à une électrophorèse sur un PAGE ReadyGel à 10 % (BioRad, Hercules, CA). Les gels ont été transférés par électrophorèse sur des membranes de nitrocellulose, bloqués avec 5 g/dL de lait écrémé en poudre dilué dans du tampon Blotto (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA et 0,05 % Tween 20, pH 7,6) et incubés à 4C pendant la nuit avec l'anticorps primaire dans du lait écrémé en poudre. L'équivalence de chargement et de transfert a été évaluée avec la coloration Ponceau S et en évaluant l'expression de la protéine domestique b-actine. Après avoir été lavées, les membranes ont été exposées à un anticorps secondaire (IgG anti-lapin de chèvre, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) conjugué à la peroxydase de raifort à une dilution de 1:5,000. Les sites de réaction anticorps-antigène ont été visualisés à l'aide d'une chimiluminescence améliorée (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) et d'un système d'imagerie numérique Kodak Image Station 440CF. Dans des expériences sélectionnées, les transferts ont été dépouillés. La densité de bande a été normalisée de telle sorte que la densité moyenne dans une région (cortex ou moelle externe) dans le tissu de type sauvage (WT) mâle était de 100. Les deux sexes (mâle et femelle) et les deux génotypes (WT et KO) ont été chargés sur le même gel pour ces expériences. L'absence de saturation a été confirmée en examinant la distribution de l'intensité des pixels dans tous les immunoblots.

Préparation de tissus pour l'immunohistochimie

Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane inhalé. Les reins ont été préservés par perfusion cardiaque in vivo avec du PBS (pH 7,4) contenant 6,000 U/L d'héparine Na et 120 mg/L de lidocaïne suivis de periodate-lysine-2 % de paraformaldéhyde, coupé transversalement en plusieurs tranches de 2- à 3- mm d'épaisseur, puis immergé pendant 24–30 h à 4 degrés dans le même fixateur. Des échantillons de rein de chaque animal ont été inclus dans de la cire de polyester à base de distéarate de polyéthylène glycol 400 (Polysciences, Warrington, PA) avec 10 % d'1- hexadécanol et des sections de 2- mm d'épaisseur ont été coupées et montées sur de la gélatine. diapositives.

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Immunohistochimie

L'immunolocalisation de la glycoprotéine B de la famille Rh (Rhbg), de la glycoprotéine C de la famille Rh (Rhcg), de l'isoforme 3 de l'échangeur Naþ/Hþ (NHE3), de la glutamine synthétase (GS), du NKCC2 et de l'AR a été réalisée à l'aide des procédures d'immunoperoxydase décrites précédemment (20, 22, 34–37). En bref, les sections ont été déparaffinées dans de l'éthanol, réhydratées, chauffées dans Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) à 88 ° C pendant 30 min, puis à 96 degrés pendant 30 min, refroidies pendant 30 min et rincées dans du PBS. L'activité peroxydase endogène a été bloquée en incubant des coupes dans 3 % de H2O2 dans de l'eau distillée pendant 45 min. Les coupes ont été bloquées pendant 15 min avec un bloc protéique sans sérum (Dako Cytomation) puis incubées pendant une nuit à 4 C avec l'anticorps primaire. Les coupes ont été lavées dans du PBS, incubées pendant 30 min avec une IgG de cheval anti-lapin conjuguée à la peroxydase (ImmPRESS, Vector Laboratories, Burlingame, CA), lavées à nouveau avec du PBS, puis exposées à la diaminobenzidine pendant 5 min. Les coupes ont été lavées à l'eau distillée, déshydratées au xylène, montées et observées au microscope optique. Des comparaisons de marquage ont été faites entre les sections de la même expérience d'immunohistochimie. Les coupes ont été examinées sur un microscope Zeiss Axio Imager A2 équipé d'une optique DIC et photographiées à l'aide d'un appareil photo numérique couleur Axiocam 305 et du logiciel Zen 2.3 (Zeiss).

L'immunolocalisation de la phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK) a été réalisée à l'aide de procédures d'immunoperoxydase modifiées, comme décrit précédemment (20, 22, 38– 40). En bref, les coupes ont été déparaffinées à l'éthanol, réhydratées, chauffées dans Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) à 96 C pendant 60 min, refroidies pendant 30 min et rincées dans du PBS. L'activité peroxydase endogène a été bloquée par incubation des coupes dans 3 % de H2O2 dans du méthanol pendant 45 min. Les sections ont été traitées avec du 00,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min. Les sections ont ensuite subi plusieurs lavages dans du PBS contenant 1 % de BSA, 0 0,05 % de saponine et 0,2 % de gélatine, suivis d'un blocage pendant 15 minutes avec un bloc de protéines sans sérum (DAKO Cytomation), puis incubés pendant une nuit à 4 C avec un anticorps primaire. Les coupes ont été lavées dans du PBS contenant 0,1 % de BSA, 0,05 % de saponine et 0,2 % de gélatine, puis du PBS et incubées pendant 60 min avec une IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à la peroxydase (MACH2, Biocare Medical, Concord, CA), lavé à nouveau dans du PBS, puis exposé à la diamino-benzidine pendant 5 min.

Contrôle négatif

Chaque expérience d'immunohistochimie comprenait une section qui a été exposée aux procédures d'immunomarquage sans anticorps primaires pour s'assurer que l'étiquette était due uniquement à la liaison des anticorps primaires.

Analyse morphométrique

La densité volumique du tubule proximal dans le cortex et la bande externe de la médulla externe ainsi que le canal collecteur dans le cortex et la bande interne de la médulla externe ont été déterminées à l'aide de techniques standard de comptage de points décrites précédemment (20–22, 41 ).

Immunohistochimie quantitative

L'immunohistochimie quantitative a été réalisée comme nous l'avons précédemment décrit et validé (20, 22, 33, 37, 42). Les segments de tubules proximaux ont été étudiés dans des sections marquées dans des conditions identiques dans la même expérience d'immunomarquage par un observateur aveugle au groupe de traitement. Les segments de tubule proximaux spécifiques mesurés étaient le tubule contourné proximal initial (PCT), défini comme des segments PCT continus avec la capsule de Bowman, le tubule droit proximal (PST) dans le rayon médullaire et le PST dans la bande externe de la moelle externe. Nous avons utilisé des micrographies numériques haute résolution prises de champs sélectionnés au hasard du cortex rénal et de la bande externe de la moelle externe à l'aide d'un microscope Zeiss Axio Imager A2 équipé d'un appareil photo numérique couleur Axiocam 305 et du logiciel Zen 2.3 (Zeiss) sans aucune technique d'amélioration de l'imagerie. . À l'aide du logiciel ImageJ (v, 1.34j, National Institutes of Health, Bethesda, MD), nous avons mesuré l'intensité des pixels sur une ligne droite tracée de la lumière du tubule à travers une cellule individuelle. Ces données ont ensuite été analysées à l'aide d'un logiciel personnalisé exécuté dans Microsoft Excel 2016. L'intensité nette à chaque pixel de la ligne a ensuite été déterminée comme la différence entre l'intensité absolue et l'intensité moyenne du pixel de fond mesurée à l'extérieur de la cellule. L'expression cellulaire totale a été déterminée en intégrant l'intensité nette des pixels dans toute la cellule. La hauteur des cellules a été déterminée comme la distance en pixels entre les bords apical et basolatéral des cellules et convertie en longueur absolue à l'aide d'une détermination calibrée de la taille des pixels individuels. Un minimum de 15 cellules individuelles d'au moins quatre photomicrographies de chaque rein ont été analysées. Les données de toutes les cellules examinées d'un type de segment de tubule proximal donné ont été moyennées pour produire un seul point de données par animal pour l'analyse statistique.

Nous avons déterminé la taille des cellules intercalées de type A et l'expression des protéines spécifiques aux cellules, comme décrit précédemment (20, 22). En bref, nous avons obtenu des micrographies numériques à haute puissance de la bande interne de la moelle externe de coupes de tissus ayant subi une immunohistochimie pour le marqueur intercalé spécifique aux cellules Rhbg ou Rhcg. Les cellules intercalées individuelles ont été circonscrites à l'aide du logiciel ImageJ (v. 1.34j, National Institutes of Health). La taille des cellules a été déterminée comme le nombre de pixels dans les régions délimitées et convertie en surface en utilisant une mesure calibrée de pixels par micromètre. L'intensité de l'immunomarqueur à chaque pixel a été déterminée comme la différence entre l'intensité absolue du pixel et l'intensité de fond moyenne, et l'intensité de l'immunomarqueur unicellulaire a été déterminée en intégrant l'intensité nette du pixel dans la cellule à l'aide d'un logiciel personnalisé exécuté dans Microsoft Excel 2016.

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RÉSULTATS

Vérification de la suppression de l'AR spécifique du rein

Le blocage pharmacologique de l'AR ou la délétion globale induit une grande variété de changements phénotypiques (43), qui pourraient indirectement altérer les réponses structurelles rénales et ammoniacales. Pour éviter ces problèmes, nous avons généré des souris KS-AR-KO en utilisant les techniques Cre loxP. Nous avons confirmé l'efficacité de la délétion rénale AR par immunohistochimie (Fig. 1). Chez les souris WT, l'immunohistochimie a montré un immunomarqueur nucléaire AR limité au tubule proximal ; ceci était similaire à nos découvertes dans le rein de souris normal (22). Dans le rein KO, il n'y avait pas d'immunomarqueur AR détectable présent dans l'un ou l'autre sexe (Fig. 1). Ces résultats montrent la génération de souris avec une délétion rénale AR.

analyse statistique à l'aide du logiciel SPSS (26.2) et de Microsoft Excel 2016.

Étant donné que la testostérone a de nombreux effets extrarénaux, qui pourraient éventuellement altérer indirectement les mécanismes rénaux acido-basiques, nous avons envisagé la possibilité que KS-AR-KO puisse modifier les taux plasmatiques de testostérone ou d'estradiol. Cependant, les concentrations plasmatiques de testostérone et d'œstradiol ne différaient pas significativement entre les souris WT et KO des deux sexes (tableau 2).

Caractérisation physiologique de la suppression de l'AR spécifique au rein Le poids corporel était plus élevé chez les souris mâles WT que chez les souris femelles WT malgré l'absence de différence entre les sexes dans l'apport alimentaire, comme indiqué précédemment (22), ce qui correspond aux effets extrarénaux connus du sexe sur le poids corporel. Cependant, KS-AR-KO n'a pas modifié l'apport alimentaire quotidien ni le poids corporel chez les deux sexes (tableau 2).

Le poids des reins était significativement plus élevé chez les souris WT mâles que chez les souris WT femelles (Fig. 2), ce qui est similaire à ce que nous avons précédemment rapporté chez les souris normales (22). KS-AR-KO a diminué de manière significative le poids des reins chez les souris mâles KS-AR-KO, dans la mesure où le poids des reins mâles KS-AR-KO ne différait pas significativement du poids des reins femelles WT ou KS-AR-KO (Fig. 2) . Chez les souris femelles, KS-AR-KO n'a pas modifié significativement le poids des reins. Ainsi, l'effet du sexe sur le poids des reins nécessite l'expression de l'AR dans le rein masculin.

Ni les concentrations plasmatiques de Naþ, de K þ ni de bicarbonate ne différaient significativement entre les souris WT et KS-AR-KO pour les deux sexes (tableau 2). La clairance de l'urée, utilisée comme marqueur du taux de filtration glomérulaire, ne différait pas significativement entre les souris WT et KS-AR-KO dans les deux sexes (tableau 2).

Excrétion nette d'acide

L'excrétion nette d'acide implique deux processus : l'excrétion d'ammonium (NH4þ ) et l'excrétion d'acide titrable. Chez les souris mâles, KS-AR-KO a augmenté de manière significative l'excrétion d'ammoniac, ce qui a éliminé la différence entre les sexes dans l'excrétion d'ammoniac (Fig. 2). L'excrétion d'ammoniac n'a pas été significativement modifiée chez les souris femelles par KS-AR-KO. L'excrétion d'acide titrable n'a pas été significativement modifiée par KS-AR-KO chez les deux sexes (tableau 2). Le pH urinaire a été significativement diminué par KS-AR-KO chez les souris mâles mais pas chez les souris femelles (tableau 2); cependant, l'effet de KS-AR-KO sur l'excrétion d'ammoniac a persisté après examen statistique du pH de l'urine (P <0.001 par="" anova).="" ainsi,="" l'ar="" du="" tubule="" proximal="" induit="" des="" différences="" sexuelles="" dans="" l'excrétion="" d'ammoniac="" chez="" les="" souris="" mâles,="" mais="" sa="" suppression="" n'a="" eu="" aucun="" effet="" significatif="" sur="" l'excrétion="" d'ammoniac="" chez="" les="" souris="">

Effet de la suppression de l'AR spécifique du rein sur la structure du tubule proximal

Les tubules proximaux représentent une plus grande proportion du volume cortical dans le rein masculin que dans le rein féminin, et cela dépend de la testostérone (20, 22). Ainsi, nous avons déterminé les effets de la suppression de KS-AR chez les souris mâles et femelles sur la structure des tubules proximaux. En utilisant l'immunomarqueur PEPCK comme marqueur spécifique du tubule proximal, l'immunohistochimie a montré qualitativement que KS-AR-KO diminuait la proportion du cortex qui était le tubule proximal (Fig. 3A). L'analyse quantitative, utilisant des techniques formelles de comptage de points (41), a montré que KS-AR-KO diminuait de manière significative la densité volumique des tubules proximaux dans le cortex des mâles, ce qui est parallèle au changement de poids des reins (Fig. 3B). En revanche, dans la bande externe de la moelle externe, KS-AR-KO n'a pas modifié de manière significative la densité volumique des tubules proximaux chez les souris mâles (Fig. 3B). Chez les souris femelles, KS-AR-KO n'a pas modifié qualitativement la proportion du cortex qui était le tubule proximal (Fig. 3A) et n'a pas modifié quantitativement la densité volumique du tubule proximal dans le cortex ou la médulla externe (Fig. 3B). La différence de sexe dans la densité de volume des tubules proximaux corticaux présente chez les souris WT n'était pas présente chez les souris KS-AR-KO. Ainsi, dans le rein masculin, AR médie les différences entre les sexes dans la densité de volume des tubules proximaux dans le cortex. Dans la moelle externe, l'expression de l'AR ne semble pas influencer la densité volumique des tubules proximaux chez les deux sexes.

Ces changements dans la structure des tubules proximaux chez les souris mâles KS AR-KO semblent impliquer des changements dans la taille des cellules. Chez les souris mâles, KS-AR-KO a diminué de manière significative la hauteur des cellules du tubule proximal dans le PCT et le PST cortical, c'est-à-dire dans tout le cortex (Fig. 3C). La hauteur des cellules dans le PST dans la moelle externe n'a pas été modifiée de manière significative (Fig. 3C). Ces résultats sont parallèles aux résultats de densité volumique. La suppression de l'AR spécifique du rein chez les souris femelles n'a pas modifié la hauteur des cellules du tubule proximal dans le PCT, le PST cortical ou le PST dans la moelle externe, ce qui correspond à l'absence d'effet sur la densité volumique et la taille totale du rein dans le rein femelle (Fig. 2B).

Le poids du rein, la densité volumique du tubule proximal cortical et la hauteur des cellules dans le PCT et le PST cortical étaient tous plus élevés dans le rein masculin WT que dans le rein féminin WT, ce qui correspond à nos observations précédentes (20, 22). Chez les souris mâles KS-AR-KO, cette différence de sexe n'existait plus et chacun de ces paramètres ne différait pas significativement de celui observé chez les souris femelles WT ou KS-AR-KO. Ainsi, les différences entre les sexes dans le poids des reins, la densité de volume du tubule cortical proximal et la hauteur des cellules dans le PCT et le PST cortical dépendent de l'expression de l'AR.

Effet de la suppression de l'AR spécifique du rein sur la structure du conduit collecteur

Il existe des différences importantes entre les sexes dans le canal collecteur, la densité de volume du canal collecteur étant plus élevée dans la proportion du cortex ou de la médulla externe qui collectait le canal chez les souris mâles ou femelles (Fig. 4A). L'analyse morphométrique quantitative a montré que le KS-AR-KO ne modifiait pas de manière significative la densité du volume du canal collecteur dans le cortex ou la médulla externe chez les deux sexes (Fig. 4B). Ainsi, l'AR rénal n'intervient pas dans le dimorphisme sexuel dans la densité volumique du canal collecteur.

Expression d'enzymes ammoniacogènes Les résultats de l'excrétion nette d'acide montrent que la délétion de l'AR spécifique du rein augmente l'excrétion d'ammoniac chez les souris mâles même si elle diminue la densité volumique des tubules proximaux et la hauteur des cellules dans le cortex. Cela indique que les effets sur l'excrétion d'ammoniac ne peuvent pas être attribués simplement à l'hypertrophie des tubules proximaux entraînant une augmentation de la genèse de l'ammoniac et sont plutôt le résultat d'effets distincts et spécifiques sur la genèse de l'ammoniac et/ou le transport de l'ammoniac. Ainsi, nous avons ensuite examiné les protéines clés impliquées dans la genèse de l'ammoniac et dans le transport de l'ammoniac.

La PEPCK est une enzyme clé du tubule proximal nécessaire à la genèse de l'ammoniac et se trouve exclusivement dans le tubule proximal du rein (16, 44). Chez les souris mâles, KS-AR-KO a augmenté de manière significative l'expression corticale de PEPCK ; il n'y avait aucun effet de KS-AR-KO chez les souris femelles (Fig. 5A). L'augmentation de l'expression de PEPCK chez les souris mâles KS-AR-KO a éliminé la différence de sexe chez les souris WT (Fig. 5A). L'examen de l'expression des immunomarqueurs PEPCK a montré que les souris mâles KS-AR-KO avaient une plus grande intensité d'immunomarqueurs PEPCK dans le PCT et le PST cortical que les souris WT (Fig. 5B). Dans la bande externe de la moelle externe, il n'y avait aucune différence détectable dans l'intensité de l'immunomarqueur PEPCK (Fig. 5B). L'immunohistochimie quantitative de souris mâles a montré que KS-AR-KO augmentait significativement l'intensité de l'immunomarqueur PEPCK à la fois dans le PCT et le PST cortical, mais pas dans la bande externe de la moelle externe (Fig. 5C). Ainsi, chez les souris mâles, mais pas chez les souris femelles, l'expression AR du tubule proximal diminue l'expression de PEPCK dans les segments du tubule proximal cortical, mais pas dans le PST dans la moelle externe.

Le tubule proximal a une capacité de recyclage d'ammoniac impliquant GS (37, 42, 45, 46). Ni chez les souris mâles ni chez les souris femelles, KS-AR-KO n'a modifié de manière significative l'expression de GS (Fig. 5D). Ainsi, l'AR rénal ne semble pas moduler l'expression de GS.

Effet de la suppression de l'AR spécifique du rein sur l'expression de NBCe1

NBCe1 est une protéine membranaire intégrale du tubule proximal jouant un rôle majeur dans la réabsorption du bicarbonate filtré qui régule également le métabolisme de l'ammoniac (47–49). Deux variantes d'épissage de NBCe1, NBCe1-A et NBCe1-B, sont présentes dans le rein de la souris (50, 51). En utilisant un anticorps pan-NBCe1, qui reconnaît les deux variantes de NBCe1, nous avons constaté que KS-AR-KO diminuait de manière significative l'expression corticale de NCBe1 dans le rein masculin, mais pas féminin (Fig. 6A).

Effet de la suppression de l'AR spécifique du rein sur les transporteurs d'ammoniac L'excrétion rénale d'ammoniac implique un transport coordonné de NH3/NH4þ par des protéines membranaires spécifiques (10, 16, 52). Cela implique des transporteurs dans le tubule proximal (NHE3), le TAL de l'anse de Henle (NKCC2) et l'immunomarqueur du canal collecteur n'était pas détectable dans les segments du tubule proximal médullaire externe (Fig. 6C), comme indiqué précédemment (48). Nous avons ensuite utilisé une analyse immunohistochimique quantitative pour quantifier les changements spécifiques au segment dans l'expression de NBCe1-A. Cela a montré que KS-AR KO chez les souris mâles diminuait l'expression de NBCe1-A dans le PCT et le PST cortical, c'est-à-dire dans tout le cortex (Fig. 6D). Ainsi, l'expression de l'AR régule le tube cortical proximal NBCe1-Une expression dans le rein masculin mais pas dans le rein féminin.

(Rhbg et Rhcg). Les différences entre les sexes dans l'excrétion d'ammoniac sont en corrélation avec les différences dans l'expression de chacun d'entre eux (6, 20), et la testostérone régule l'expression à la fois de NHE3 et de NKCC2 (22). NKCC2 médie la réabsorption d'ammoniac TAL (10, 16, 52). Chez les souris mâles, KS-AR-KO a augmenté de manière significative l'expression de la protéine NKCC2 à l'aide d'une analyse par immunotransfert ; chez les souris femelles, il n'y avait pas de changement significatif (Fig. 8). Ce changement d'expression chez les souris mâles contribue probablement à l'altération du shunt médullaire d'ammoniac et facilite ainsi l'effet de KS-AR-KO pour augmenter l'excrétion d'ammoniac chez les souris mâles.

Les glycoprotéines Rh Rhbg et Rhcg sont les principales protéines qui interviennent dans la sécrétion d'ammoniac par le canal collecteur, et leur expression est généralement parallèle aux modifications de l'excrétion d'ammoniac (10, 16, 52). Cependant, KS-AR-KO n'a pas modifié de manière significative l'expression de la protéine Rhbg chez les souris KS-AR-KO mâles ou femelles dans le cortex ou la bande interne de la moelle externe (Fig. 9). Les effets sur l'expression de Rhcg étaient similaires. L'immunohistochimie Rhcg, évaluée qualitativement et à l'aide d'une immunohistochimie quantitative, n'a montré aucun changement significatif dans l'intensité de l'immunomarqueur Rhcg dans les cellules intercalées de la bande externe de la moelle externe chez les deux sexes (Fig. 10). Ainsi, l'AR rénal ne semble pas moduler l'expression de Rhbg ou de Rhcg.

DISCUSSION

La présente étude fournit de nouvelles informations importantes concernant le mécanisme de la façon dont AR module les dimorphismes sexuels dans le rein. Parce que l'AR a de nombreux rôles extra-rénaux, ce qui pourrait compliquer la compréhension de son rôle dans le rein, nous avons créé la première souris KS-AR-KO. Le KS-AR-KO chez les souris mâles a augmenté l'excrétion d'ammoniac, tout en diminuant la taille totale des reins, la densité du volume des tubules proximaux et la hauteur des cellules des tubules proximaux, éliminant les différences sexuelles précédemment identifiées. L'expression de plusieurs protéines clés (PEPCK et NKCC2) impliquées dans la manipulation de l'ammoniac a été augmentée par KS-AR-KO, contribuant probablement à l'augmentation de l'excrétion d'ammoniac. Simultanément, l'expression d'autres protéines (NHE3 et NBCe1-A) a diminué, ce qui aura tendance à atténuer les modifications de l'excrétion d'ammoniac. KS-AR-KO n'a eu aucun effet détectable chez les souris femelles ou dans le canal collecteur des deux sexes. Le tableau 3 montre ces effets. Ces résultats suggèrent que la manipulation rénale de l'ammoniac et la structure du tubule proximal impliquent des voies de signalisation dépendantes de l'AR rénal dans le cortex du rein masculin, mais pas dans le rein féminin et non dans la moelle externe des deux sexes.

La première découverte majeure de cette étude est que l'expression de l'AR induit des différences entre les sexes dans la taille des reins. Des études antérieures chez l'homme, le rat et la souris ont montré que le rein mâle est plus gros que le rein femelle (3, 56, 57). La première preuve que cela impliquait une voie de signalisation dépendante de la testostérone était l'observation qu'une administration excessive d'androgènes augmentait qualitativement la taille des tubules proximaux du rat (57). D'autres preuves chez les hommes adultes suggèrent qu'il existe une augmentation dose-dépendante du volume rénal, avec une augmentation estimée de 4,04-cm3 par 100 mg de supplémentation hebdomadaire en testostérone (58). Nous avons récemment montré que les souris mâles avaient une plus grande taille de rein et de tubule proximal que les souris femelles (20, 22) et que ces différences étaient dépendantes de la testostérone (22). Conformément à ces résultats précédents, la présente étude démontre que chez les souris mâles, l'expression rénale de l'AR régule à la fois la taille du rein entier et celle du tubule proximal. De plus, KS-AR-KO a pour résultat que la taille des reins masculins est la même que chez les femmes avec une expression AR intacte. Ainsi, chez les souris mâles, la testostérone agissant par les voies de signalisation dépendantes de l'AR rénal peut entièrement expliquer le dimorphisme sexuel dans la taille des reins et des tubules proximaux.

La deuxième découverte majeure est que les différences basées sur le sexe dans l'excrétion d'ammoniac sont médiées par des voies dépendantes de l'AR chez les souris mâles. Nos études précédentes ont montré que les souris femelles excrètent environ deux fois plus d'ammoniac urinaire que les souris mâles (20-22), utilisent différentes voies de réponse pour répondre à la charge acide (21) et que la différence d'excrétion basale d'ammoniac implique une testostérone dépendante. mécanisme (22). La présente étude étend ces résultats en montrant que KS-AR-KO élimine le dimorphisme sexuel dans l'excrétion d'ammoniac. Les modifications des charges acides fixes alimentaires peuvent modifier l'excrétion d'ammoniac, mais les modifications de l'excrétion d'ammoniac chez les souris avec délétion AR ne peuvent pas être attribuées à ce mécanisme, car KS-AR-KO n'a pas modifié l'apport alimentaire. La plupart des changements qui se produisent dans le métabolisme de l'ammoniac, comme ceux qui surviennent avec l'acidose métabolique ou l'hypokaliémie, entraînent des changements dans la taille des reins et des tubules proximaux parallèlement à l'excrétion d'ammoniac (59–61). Cependant, les souris mâles présentant une délétion AR rénale ont augmenté l'excrétion d'ammoniac mais ont diminué la taille totale des reins et des tubules proximaux, ce qui indique que l'effet sur l'excrétion d'ammoniac n'est pas une réponse non spécifique aux modifications de la masse rénale. Cette taille rénale incongrue et la réponse de l'ammoniac en réponse à la suppression de l'AR rénal sont parallèles aux résultats de nos études précédentes utilisant un modèle de gonadectomie qui évaluait l'effet de la testostérone (22). Ainsi, chez les souris mâles, la testostérone agissant par l'intermédiaire de l'AR rénal chez les mâles régule l'excrétion d'ammoniac par des voies non liées aux effets sur la taille rénale, la taille des tubules proximaux et les charges acides endogènes liées à l'apport alimentaire.

La majorité de la génération d'ammoniac se produit dans le tubule proximal. Nos travaux antérieurs ont identifié des dimorphismes sexuels dans la génération d'ammoniac dans les tubules proximaux qui dépendent de la testostérone dérivée des testicules (22). Les résultats de la présente étude étendent encore ces découvertes en montrant que l'AR rénal chez les souris mâles régule l'expression de l'enzyme génératrice d'ammoniac PEPCK mais pas l'enzyme de recyclage de l'ammoniac GS. Cet effet sur l'expression de PEPCK n'est pas un effet non spécifique lié aux modifications de la taille des tubules proximaux, puisque les effets de la suppression de l'AR rénal sur la taille des tubules proximaux sont à l'opposé de ses effets sur l'expression de PEPCK. De plus, la découverte que la suppression rénale de l'AR ne modifie pas l'expression de la GS indique que la GS est régulée par des mécanismes distincts de ceux utilisés pour la PEPCK.

L'ammoniac produit dans le tubule proximal est sécrété préférentiellement dans le liquide luminal par un mécanisme apical dépendant du NHE 3- (54, 55). Des études antérieures ont montré que la perte de testostérone diminue l'expression de NHE3 (22, 62). Les résultats de la présente étude étendent encore ces résultats en montrant que la suppression rénale de l'AR chez les souris mâles diminue l'expression de NHE3. Ainsi, la testostérone agissant par l'activation de l'AR semble augmenter l'expression de NHE3 dans le tubule proximal cortical. Cependant, il est important de reconnaître que ces effets ne sont pas parallèles à l'excrétion d'ammoniac et devraient plutôt minimiser les changements observés dans l'excrétion d'ammoniac. Au lieu de cela, étant donné que le NHE3 est également essentiel pour le NaCl filtré et la réabsorption de l'eau, ces effets peuvent contribuer à la plus grande réabsorption du NaCl dans le tubule proximal chez les mâles (6, 7).

La réabsorption d'ammoniac dans le TAL établit le gradient d'ammoniac interstitiel nécessaire à la collecte de la sécrétion d'ammoniac dans les conduits (63, 64). Des études antérieures de notre groupe ont montré que l'expression de NKCC2 est plus élevée chez les souris femelles que chez les souris mâles (20-22), qu'il existe un dimorphisme sexuel dans la réponse de NKCC2 à la charge acide (21) et que la différence d'expression basale de NKCC2 implique un mécanisme dépendant de la testostérone (22). La présente étude montre que la perte d'AR rénal chez les souris mâles a augmenté l'expression de NKCC2. L'ampleur de cet effet était presque identique à la différence que nous avons identifiée entre les souris mâles et femelles (20, 21) et dans l'étude actuelle a éliminé le dimorphisme sexuel de l'expression de NKCC2. En outre, la différence identifiée entre les souris mâles avec une délétion AR et AR rénale intacte est parallèle à nos différences précédemment identifiées entre les souris mâles avec orchidectomie par rapport aux témoins intacts et fictifs (24). Ainsi, la testostérone agissant via la RA semble médier le dimorphisme sexuel dans l'expression de NKCC2. Cependant, cette régulation semble être indirecte, car il n'y avait pas d'expression AR détectable dans le TAL dans notre rapport précédent (22) ou dans la présente étude. Un mécanisme indirect possible expliquant cette observation est que chez les hommes, la suppression de l'AR entraîne une diminution de la taille du tubule proximal qui, en combinaison avec une diminution de l'expression du NHE3 dans le tubule proximal, augmente l'apport accru de soluté au TAL, ce qui stimule l'expression de NKCC2.

La sécrétion d'ammoniac dans les conduits collecteurs est le principal déterminant de l'excrétion urinaire d'ammoniac, et les glycoprotéines Rh Rhbg et Rhcg sont les principaux transporteurs d'ammoniac dans les conduits collecteurs (16, 65–68). Nous avons déjà montré des dimorphismes sexuels dans la densité du volume du canal collecteur et l'expression des glycoprotéines Rh, les souris femelles ayant une densité volumique du canal collecteur plus élevée, une taille de cellule intercalée et une expression Rhbg et Rhcg (20). La présente étude n'a trouvé aucun changement détectable dans la densité du volume des conduits collecteurs ou dans l'expression de Rhbg et Rhcg en réponse à KS-AR-KO chez des souris mâles ou femelles. Cela correspond à l'absence d'effet de la carence en testostérone, induite par l'orchidectomie, sur la densité volumique du canal collecteur, la taille des cellules intercalées et l'expression de Rhbg et Rhcg (22). Nous concluons que le dimorphisme sexuel dans le canal collecteur se produit par des mécanismes n'impliquant pas la testostérone et les voies de signalisation dépendantes de l'AR.

La moelle externe semble réagir différemment au sexe, à la testostérone et à la RA que le cortex. Contrairement au cortex rénal, dans la moelle externe, il n'y a pas de dimorphisme sexuel dans la densité de volume du tubule proximal ou la hauteur du tubule proximal (20), aucun effet de la carence en testostérone induite par l'orchidectomie sur ces paramètres (22), et aucun effet de la fonction rénale. Délétion AR (étude actuelle). Cette absence d'effet du sexe, de la testostérone et de l'expression de l'AR n'est pas due à l'absence d'expression de l'AR, car nous avons montré l'expression de l'AR dans tout le tubule proximal, y compris dans la moelle externe (22). Comprendre les mécanismes sous-jacents à cette différence axiale dans la réponse du tubule proximal au sexe, à la testostérone et à la RA constituera une piste importante pour les recherches futures.

Une observation finale est que la suppression de l'AR n'a pas eu d'effets détectables sur le rein féminin. L'AR est présent dans tout le tubule proximal chez les deux sexes, et bien qu'exprimé à des niveaux inférieurs chez les femmes, la différence absolue d'expression n'était que de - 50 % (22). En partie, l'absence d'effet de la suppression de l'AR pourrait indiquer une diminution de l'activation de l'AR par la testostérone en circulation, qui est, comme le montre la présente étude, nettement moins chez les femmes que chez les hommes. Cependant, l'immunohistochimie indique une localisation substantielle de l'AR nucléaire dans le rein féminin (Réf. 22 et présente étude), ce qui indique généralement l'activation des processus de signalisation dépendant de l'AR. Ces observations suggèrent la possibilité que d'autres différences dépendantes du sexe altèrent les mécanismes de signalisation dépendants de l'AR dans le tubule proximal féminin.

Perspectives et importance

Une meilleure compréhension du mécanisme et des implications biologiques de l'effet du sexe sur la structure rénale et le métabolisme de l'ammoniac est essentielle pour optimiser notre capacité à prendre soin des hommes et des femmes souffrant de troubles acido-basiques. Malgré les progrès récents dans notre compréhension de l'effet du sexe sur le métabolisme de l'ammoniac et du rôle de l'AR rénal, des études supplémentaires sont nécessaires. Il existe certainement des effets sexuels indépendants de la testostérone, dont le mécanisme n'est pas complètement compris à l'heure actuelle. Que cela implique des effets directs d'autres hormones stéroïdes sexuelles, telles que les œstrogènes ou la progestérone, les effets indirects de l'activation AR du tubule proximal ou les effets des chromosomes sexuels qui sont indépendants des hormones gonadiques seront des questions importantes pour les études futures.

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REMERCIEMENTS

Nous remercions le Dr Sharon W. Matthews et Chao Chen (l'Université de Floride, College of Medicine Electron Microscopy Core Laboratory) pour l'excellent traitement des tissus pour nos expériences immunohistochimiques. Nous remercions The University of Virginia School of Medicine Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core pour la mesure des taux sériques de testostérone. Nous remercions le Dr Gail Prins pour la fourniture d'anticorps anti-AR et pour leur expertise en RA.

DIVULGATIONS

Aucun conflit d'intérêts, financier ou autre, n'est déclaré par les auteurs.

LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR

ANH et IDW ont conçu et conçu la recherche ; ANH, RAC, H.-WL et JWV ont réalisé des expériences ; ANH, RAC, H.-WL, JWV et IDW ont analysé les données ; L'ANH, le RAC, le JWV et l'IDW ont interprété les résultats des expériences ; ANH a préparé des chiffres ; ANH a rédigé le manuscrit; ANH, RAC, H.-WL, JWV et IDW ont édité et révisé le manuscrit ; ANH, RAC, H.-WL, JWV et IDW ont approuvé la version finale du manuscrit.

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