La lipocaline associée à la gélatinase neutrophile sécrétée montre une capacité plus forte à inhiber l'agrandissement des kystes des cellules PKD par rapport à la forme non sécrétée Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4. Effets du mNGAL sur la formation de kystes de cellules 2L3 en culture 3D
Prolifération cellulaireest anormalement augmentée chez les souris 2L3 et conduit à la formation et à l'élargissement de kystes [17]. Sur la base des résultats précédents selon lesquels mNGAL a inhibéProlifération cellulaire 2L3 en culture 2D(Figure 3), nous avons émis l'hypothèse que le mNGAL pourrait inhiber davantage la formation de kystes dans les cellules 2L3. Pour déterminer si mNGAL pourrait inhiber la formation de kystes dans les cellules 2L3, nous avons établi une plate-forme de culture 3D fournissant un environnement approprié avec Matrigel pour la formation de kystes (Figure 6). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96- puits (1 000 cellules/puits) au-dessus du Matrigel préformé pendant la nuit. Une fois les cellules attachées au gel, davantage de Matrigel a été ajouté aux cellules pour former un motif en forme de sandwich (Figure 6A). Les cellules ont été maintenues en culture 3D à 37 ◦C et 5 % de CO2 pendant au moins 5 jours pour former des kystes. Les kystes en culture 3D se sont agrandis avec une durée de culture prolongée (Figure 6B). Pour confirmer que les constructions sphériques observées dans la culture 3D étaient des kystes avec une lumière, nous les avons fixées et colorées avec du DAPI et des anticorps contre la E-cadhérine et l'actine pour identifier les noyaux cellulaires, l'adhésion cellule-cellule et la membrane apicale, respectivement. Différentes sections optiques z d'un kyste 2L3 en culture 3D du haut (couche 1) au milieu (couche 5) ont été observées par microscopie confocale et la lumière a été confirmée dans le kyste sphérique (Figure 6C, Matériel supplémentaire
NOUVELLES HERBES POUR ADPKD (POLYKYSTOSE RÉNALE)
Pour étudier les effets du mNGAL sur la formation de kystes de cellules 2L3 en culture 3D, les cellules en culture 3D ont été traitées avec de la forskoline des jours 1 à 3 pour induire la formation de kystes. Les cellules ont ensuite été traitées avec ou sans mNGAL des jours 4 à 8, et les diamètres des kystes ont été mesurés chaque jour (Figure 6D). Les kystes en culture 3D ont augmenté proportionnellement au nombre de jours de culture, avec des diamètres allant de 40 à 120 µm (Figure 6E – G), tandis que le mNGAL a supprimé de manière significative les diamètres des kystes (Figure 6F) et leur superficie (Figure 6G) jusqu'au jour 8. Cependant , il n'y avait pas de différence significative dans l'augmentation du nombre de kystes entre les groupes témoins et traités par mNGAL des jours 4 à 8 (Figure 6H). Nous avons en outre analysé le nombre de gros kystes (diamètre > 100 µm) entre les deux groupes et avons constaté que le mNGAL réduisait de manière significative le pourcentage de gros kystes par rapport au groupe témoin au jour 8 (Figure 6I).
3.5. Effets de la transfection avec pN + LS et pN − LS sur l'expression de NGAL et la prolifération cellulaire dans les cellules 2L3
Pour étudier si la nécessité d'une concentration plus élevée de mNGAL (2 mg/mL) dans une culture 3D pour inhiber la croissance des kystes des cellules 2L3 (Figure 6) était due à l'absence de modification post-traductionnelle de mNGAL, nous avons conçu une construction pour la surexpression de mNGAL. dans les cellules 2L3. De plus, il a été démontré que NGAL peut interagir avec NGAL-R et induire davantage l'apoptose (29). Par conséquent, pour comprendre si NGAL a interagi avec NGAL-R pour induire l'apoptose etinhiber la viabilité cellulaire(Figure 3) et la croissance du kyste (Figure 6), une construction pour la surexpression de NGAL non sécrété (sans la séquence leader) a également été transfectée dans des cellules 2L3.
Le NGAL de souris (NP_032517.1) et le NGAL humain (NP_005555.2) sont respectivement des protéines 200-aa et 198-aa, et tous deux ont un {{6 }}un peptide signal pour la sécrétion situé à l'extrémité N-terminale de la protéine NGAL (Figure 7A). La comparaison des séquences a montré une identité de 62 % et une positivité de 80 % entre le NGAL de souris et le NGAL humain. Il a été démontré que le NGAL de souris avait deux sites de glycosylation liés à N sur l'asparagine (Asn, N) à aa 81 et 85, tandis que le NGAL humain avait un site à aa 85 (Figure 7A), révélant la différence entre eux en termes de modification post-traductionnelle.
Figure 7. Effets de la transfection avec pN + LS et pN − LS sur l'expression de NGAL et la prolifération cellulaire dans les cellules 2L3. (A) Alignement des protéines NGAL de souris (NP_032517.1) et NGAL humaine (NP_005555.2). Les peptides signaux 20-aa sont représentés en bleu. Les deux sites de glycosylation liés à N signalés sur Asn (N) à aa 81 et 85 du NGAL de souris et un à aa 85 du NGAL humain sont marqués par un astérisque (*). Identités : ligne continue ; points positifs : points appariés. Les informations de séquence ci-dessus proviennent du programme BLASTP sur le site Web du National Center for Biotechnology Information (NCBI). (B) Construisez un diagramme de mNGAL avec (pN + LS) ou sans (pN − LS) la séquence leader Igκ sécrétée sur le vecteur pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd. (C) Le résultat de l'électrophorèse sur gel a confirmé la construction de pN + LS (647 pb) et pN - LS (587 pb) digérée par NheI et NotI. (D) Chronologie de l’infection et sélection des cellules 2L3 avec pN + LSet pN − LS, respectivement. Les cellules 2L3 ont été infectées par pN + LS ou pN - LS dans la plaque à 6 puits le jour 1. La sélection à la blasticidine a commencé le jour 2 et le milieu a été changé tous les 3 jours. Après une semaine de sélection, les cellules ont été collectées pour être analysées par RT – QPCR, Western blot et ELISA. (E) Détection de l'expression du rapporteur eGFP pour examiner l'efficacité de la transfection de pN + LS et pN - LS au jour 2. Environ 10 % des cellules ont été infectées par la construction GFP. Barre d'échelle : 50 µm. Les résultats de RT – qPCR ont montré que pN + LS et pN − LS avaient tous deux une expression plus élevée de Lcn2 (représentait le niveau total de NGAL) (F) et de c-myc (représentait le niveau de NGAL exogène transfecté) (G) par rapport au groupe témoin. (H) Il n’y avait pas de différence significative entre les groupes entre les groupes. RQ : quantification relative=2−∆∆Ct ; Gapdh a été utilisé comme contrôle interne de chaque échantillon. Les valeurs ont été normalisées par rapport au groupe témoin. (I) Les résultats du Western blot ont montré que pN + LS et pN - LS avaient une expression de NGAL plus élevée que le groupe témoin. (J) ELISA a montré que les cellules pN + LS et pN − LS étaient toutes deuxsécrété NGAL significativement plus élevé que le groupe témoin, tandis que la quantité de NGAL sécrétée par les cellules pN - LS était significativement inférieure à celle des cellules pN + LS. (K) L'incorporation de BrdU a montré que les cellules pN + LS et pN - LS avaient un taux de prolifération cellulaire inférieur à celui du groupe témoin, tandis que les cellules pN - LS avaient un taux de prolifération cellulaire supérieur à celui des cellules pN + LS. Le test t de Student a été réalisé pour déterminer la signification entre les deux groupes (n=3 en RT – qPCR et ELISA, n=4 en Western blot et incorporation de BrdU). *p < 0.05 ; ** p < {{10}}.01 ; *** p < 0,001 vs. 2L3 de chaque groupe ; # p < 0,05 ; ### p < 0,001 vs groupe pN + LS ; ns : pas de différence significative.
Dans cette étude, nous avons utilisé une séquence leader de chaîne Igκ murine (LS) [44] plutôt que le peptide signal original de mNGAL pour assurer une sécrétion accrue de protéine mNGAL exogène. Pour surexprimer NGAL sécrété ou non, NGAL avec ou sans LS dans les vecteurs pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd, à savoir pN + LS et pN - LS, ont été utilisés et sont illustrés à la figure 7B. Deux promoteurs, pCMV et hPGK, ont été utilisés pour piloter l'expression indépendante de deux protéines, NGAL-c-myc-His6 et eGFP. Pour garantir l'insertion de la construction, NheI et NotI ont été utilisés pour digérer les deux plasmides, et les résultats de l'électrophorèse sur gel ont montré une bande 647- pb de pN + LS et une bande 587- pb de pN − LS (en raison de l’absence d’une séquence leader 60- pb) (Figure 7C).
Pour l'infection de pN + LS et pN-SP dans des cellules 2L3, du polybrène et du lentivirus ont été ajoutés aux cellules et incubés à 37 °C pendant 24 h, suivis d'une sélection avec de la blasticidine (Figure 7D). La détection de l'expression de la GFP a été réalisée par microscopie à fluorescence après infection (Figure 7E). Les cellules infectées ont été récoltées une semaine après la sélection de la blasticidine pour RT – qPCR, Western blot et ELISA afin d'analyser le niveau d'expression de NGAL (Figure 7F – J). Les résultats RT – qPCR ont montré que l'infection des cellules 2L3 par pN + LS et pN − LS conduisait à une expression croissante de Lcn2 (Figure 7F) et de Lcn2-c-myc (Figure 7G), qui représentaient les niveaux de total et NGAL exogène, respectivement, alors qu'il n'y avait aucune différence dans les niveaux d'expression de Slc22a17 (NGAL-R) (Figure 7H). Les résultats du Western blot ont montré que les cellules pN + LS et pN - LS présentaient des niveaux d'expression intracellulaire de NGAL plus élevés que les cellules 2L3 témoins (Figure 7I). Les résultats ELISA pour le surnageant cellulaire ont montré que les cellules pN + LS et pN - LS présentaient toutes deux des niveaux significativement plus élevés de NGAL sécrété que le groupe témoin de cellules 2L3 (Figure 7J). De plus, la quantité de NGAL sécrétée par les cellules pN − LS était significativement inférieure à celle sécrétée par les cellules pN + LS (Figure 7J), alors que les deux groupes avaient des niveaux d'expression de NGAL similaires (Figure 7I). Cette découverte conforte notre prédiction selon laquelle la surexpression de NGAL sans peptide signal (pN − LS) limitait la sécrétion de NGAL malgré la présence d'un niveau élevé de NGAL intracellulaire. Pour déterminer si le NGAL sécrété plutôt que le NGAL non sécrété inhibait la prolifération cellulaire, un test d'incorporation de BrdU a été réalisé, qui a montré que les cellules pN + LS et pN - LS avaient une prolifération significativement inférieure à celle du groupe témoin (Figure 7K). De plus, les cellules pN − LS présentaient une prolifération significativement plus élevée que les cellules pN + LS (Figure 7K). Ces résultats suggèrent que la sécrétion de NGAL par les cellules 2L3 était nécessaire pour inhiber la prolifération cellulaire.
3.6. Effets de la surexpression mentale menant aux voies de signalisation dans les cellules 2L3
Sur la base de nos résultats précédents montrant que le mNGAL pourrait inhiber les voies ERK et AKT dans les cellules 2L3 (Figure 4) et diminuer davantage la prolifération cellulaire (Figure 3) et l'élargissement des kystes (Figure 6), nous avons utilisé le Western Blot pour analyser si les voies ERK et AKT les voies ont été affectées dans les cellules pN + LS et pN - LS (Figure 8). Les résultats du Western blot ont montré que les groupes pN + LS et pN − LS avaient un rapport p-ERK (T202/Y204)/ERK significativement inférieur à celui du groupe témoin, et que le groupe pN − LS avait un rapport p-ERK plus élevé. (T202/Y204)/ERK que le groupe pN + LS (Figure 8A). Le rapport p-AKT (S473) / AKT était plus faible dans le groupe pN + LS que dans le groupe témoin, tandis que les cellules pN - LS n'étaient pas significativement différentes de celles des groupes témoin et pN + LS (Figure 8B). Le rapport p-CREB (S133) / CREB était significativement plus élevé dans le groupe pN - LS que dans le groupe pN + LS, alors que ni pN + LS ni pN - LS ne présentaient de différence significative par rapport au groupe témoin (Figure 8C). Ces résultats suggèrent que pN + LS et pN − LS présentaient des différences statistiquement significatives dans le rapport p-ERK/ERK (Figure 8A), tandis que le groupe pN + LS ne montrait pas de meilleur effet sur AKT (Figure 8B) et CREB ( Figure 8C) activation.
Selon les résultats précédents selon lesquels l'application de mNGAL pourrait induire l'apoptose (Figure 3) et l'autophagie dans les cellules 2L3 (Figure 5) et diminuer la prolifération cellulaire (Figure 3) et l'élargissement des kystes (Figure 6), nous avons utilisé le Western blot pour étudier l'effet sur l'apoptose. et autophagie dans les cellules pN + LS et pN - LS (Figure 9). Les résultats du Western Blot ont montré que les cellules pN + LS présentaient un rapport significativement plus élevé de caspase clivée/pro-caspase-3 (Figure 9A) et de pro-PARP clivées/pro (Figure 9B) que le groupe témoin ; Les cellules pN − LS n'ont montré aucune différence significative dans le rapport entre les caspases clivées et pro-caspase -3 (Figure 9A) et entre les cellules clivées et pro-PARP (Figure 9B) par rapport au groupe témoin, ainsi que dans le rapport entre les cellules clivées et pro-caspase. /pro-caspase-3 était significativement inférieur à celui du groupe pN + LS (Figure 9B). Ces résultats ont démontré que la surexpression du NGAL sécrété plutôt que du NGAL non sécrété induisait l'apoptose dans les cellules 2L3.
Un rapport plus élevé de LC3B II/LC3B I (Figure 9C) et un rapport plus faible de p62/GAPDH (Figure 9D) ont été identifiés dans les cellules pN + LS par rapport au groupe témoin ; Les cellules pN − LS ne présentaient pas de différence significative dans le rapport LC3B II/LC3B I (Figure 9C) et p62/GAPDH (Figure 9D) par rapport au groupe témoin, et le rapport LC3B II/LC3B I était significativement inférieur à celui du groupe témoin. Groupe pN + LS (Figure 9C). Ce résultat a révélé que la surexpression du NGAL sécrété plutôt que du NGAL non sécrété induisait l'autophagie dans les cellules 2L3.
3.7. Effets de la surexpression de mNGAL sur la formation de kystes de cellules 2L3 en culture 3D
Sur la base des résultats précédents selon lesquels mNGAL inhibait la prolifération des cellules 2L3 et l'agrandissement des kystes dans les cultures 2D et 3D, respectivement (Figures 3 et 6), nous soupçonnions que la surexpression du NGAL sécrété pourrait inhiber davantage l'agrandissement des kystes des cellules 2L3 par l'inhibition de la prolifération cellulaire ( Figure 7K).
Pour étudier les effets de la surexpression de NGAL dans les cellules 2L3 sur la formation de kystes, les cellules témoins 2L3, pN + LS et pN - LS ont été traitées avec de la forskoline les jours 1 à 3 pour induire la formation de kystes. Les diamètres, la surface et le nombre des kystes ont été mesurés quotidiennement après l'induction de la forskoline (Figure 10A). Les kystes du contrôle 2L3, les cellules pN + LS et pN − LS en culture 3D se sont développées d'une manière dépendante des jours de culture (Figure 10B) et ont montré des différences évidentes dans la taille des kystes entre les jours 4 et 8. Le groupe pN + LS avait des diamètres de kystes (Figure 10C) et des zones (Figure 10D) significativement plus petits que le groupe témoin des jours 4 à 8, tandis que le groupe pN - LS avait des diamètres de kystes significativement plus petits que le groupe témoin aux jours 6 et 8 (Figure 10C). Il n’y avait pas de différence significative dans la surface du kyste entre les groupes témoin et pN − LS. De plus, le groupe pN - LS présentait des diamètres et des zones de kystes significativement plus grands que le groupe pN + LS au jour 8 (Figure 10C, D). Bien qu'il n'y ait pas de différence significative dans le taux d'augmentation du nombre de kystes entre les cellules témoins, pN + LS et pN − LS (Figure 10E), les groupes pN + LS et pN − LS présentaient tous deux des pourcentages significativement plus faibles de grands (diamètre > 100 µm) que le groupe témoin (Figure 10F) des jours 4 à 8. Ces résultats ont montré que pN + LS et pN − LS inhibaient tous deux l'agrandissement des kystes, tandis que l'effet inhibiteur de pN − LS était plus faible que celui de pN + LS. . Cette découverte a révélé que la surexpression du mNGAL sécrété avait une capacité supérieure à inhiber l’élargissement du kyste des cellules 2L3 en culture 3D par rapport au mNGAL non sécrété.
-Un test a été réalisé pour déterminer la signification entre les groupes (n=3). * p < 0.05 ; *** p < 0 0,001 par rapport au groupe témoin ; # p < 0,05 vs groupe pN + LS
caspase{{0}} (A) et clivé-/pro-PARP (B) que le groupe témoin, qui représentait l'induction de l'apoptose par le mNGAL sécrété. Les cellules pN − LS ne présentaient pas de différence significative dans le rapport clivé/pro-caspase-3 et clivé/pro-PARP par rapport au groupe témoin. Les cellules pN + LS présentaient un rapport plus élevé de LC3B II/LC3B I (C) et un rapport plus faible de p62 (D) par rapport au groupe témoin. Les cellules pN −LS ne présentaient pas de différence significative dans le rapport LC3B II/LC3B I et p62 par rapport au groupe témoin. Tubulin, Vinculin et GAPDH ont été utilisés comme contrôles internes de chaque échantillon. Les valeurs ont été normalisées par rapport au groupe témoin. Le test t de Student a été effectué pour déterminer la signification entre les groupes (n=3). * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0,001 par rapport au groupe témoin ; # p < 0,05 ; ## p <0,01 vs groupe pN + LS.
Figure 9. Effets de la surexpression de la protéine mNGAL sur l'apoptose et l'autophagie dans les cellules 2L3. Les résultats du Western blot ont montré que les cellules pN + LS présentaient un rapport significativement plus élevé de caspase clivée/pro-caspase-3(A) et de pro-PARP clivée (B) que le groupe témoin, ce qui représentait l'induction de l'apoptose. par le mNGAL sécrété. Les cellules pN −LS ne présentaient pas de différence significative dans le rapport clivé/pro-caspase-3 et clivé/pro-PARP par rapport au groupe témoin. Les cellules pN + LS présentaient un rapport plus élevé de LC3BII/LC3B I (C) et un rapport plus faible de p62 (D) par rapport au groupe témoin. Les cellules pN − LS ne présentaient pas de différence significative dans le rapport LC3B II/LC3B I et p62 par rapport au groupe témoin. Tubulin, Vinculin et GAPDH ont été utilisés comme contrôles internes de chaque échantillon. Les valeurs ont été normalisées par rapport au groupe témoin. Le test t de Student a été réalisé pour déterminer la signification entre les groupes
(n {{0}}). * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0,001 par rapport au groupe témoin ; # p < 0,05 ; ## p < 0,01 vs groupe pN + LS
4–8. Le nombre de kystes au jour 4 de chaque groupe a été utilisé comme contrôle pour calculer le rapport du nombre de kystes. (F) Pourcentage de kystes de grande taille dans la culture 3D du groupe témoin, cellules pN + LS et pN - LS pendant les jours 4 à 8. Le test t de Student a été effectué pour déterminer la signification entre les groupes (n=3). * p < {{10}}.05 ; ** p < 0,01 par rapport au groupe témoin ; # p < 0,05 ; ## p <0,01 contre le groupe pN + LS.
