Sélection et caractérisation des inhibiteurs de la tyrosinase du rhizome d'Atractylodis Macrocephalae sur la base de la relation spectre-activité et de l'amarrage moléculaire

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Cistanchea pour fonction de favoriser la production de collagène, ce qui peut augmenter l'élasticité et l'éclat de la peau et aider à réparer les cellules cutanées endommagées.CistancheLes glycosides de phényléthanol ont un effet significatif de régulation à la baisse sur l'activité de la tyrosinase, et l'effet sur la tyrosinase s'avère être une inhibition compétitive et réversible, ce qui peut fournir une base scientifique pour développer et utiliser les ingrédients blanchissants de Cistanche. Par conséquent, le cistanche a un rôle clé dans le blanchiment de la peau. Ça peutinhiber la production de mélaninepour réduire la décoloration et la matité; et favorisent la production de collagène pour améliorer l'élasticité et l'éclat de la peau. En raison de la reconnaissance généralisée de ces effets de cistanche, de nombreux produits de blanchiment de la peau ont commencé à infuser des ingrédients à base de plantes tels que Cistanche pour répondre à la demande des consommateurs, augmentant ainsi la valeur commerciale de Cistanche dansblanchiment de la peaudes produits. En résumé, le rôle du cistanche dans le blanchiment de la peau est crucial. Son effet antioxydant et son effet producteur de collagène peuvent réduire la décoloration et la matité,améliorer l'élasticité et l'éclat de la peau, et obtenir ainsi un effet blanchissant. De plus, la large application de Cistanche dans les produits de blanchiment de la peau démontre que son rôle dans la valeur commerciale ne peut être sous-estimé.

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Atractylodis macrocephalus Rhizoma (AMR) est un célèbre médicament traditionnel chinois classique (CTM), qui est utilisé comme tonique pour de nombreuses maladies depuis des milliers d'années. Dans la Chine ancienne, il était utilisé comme aliment complémentaire pour la beauté du palais. Dans des études préliminaires, la fonction de blanchiment de la peau et l'effet inhibiteur significatif sur la tyrosinase (TYR) qui est l'enzyme réactive dans la composition de la mélanine de l'AMR ont été découverts, et les recherches pertinentes ont rarement été rapportées. Dans cette étude, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ainsi que l'analyse de régression partielle des moindres carrés (PLS) ont été appliquées pour étudier la cohérence entre les constituants chimiques et l'activité inhibitrice de 11 lots d'AMR sur l'activité TYR. Les résultats de PLS ont montré que les pics chromatographiques 11 (atractylénolide III) et 15 pourraient être des ingrédients efficaces importants pour l'inhibition de l'activité TYR, comme en témoignent les relations spectre-activité. De plus, l'activité inhibitrice de TYR de l'atractylénolide III a été validée par un test in vitro par l'-arbutine servant de médicament témoin positif.Leles résultats du test in vitro et de l'amarrage moléculaire ont montré que l'atractylénolide III a une activité inhibitrice élevée de TYR et pourrait se lier aux résidus dans la poche catalytique de TYR.LePar conséquent, les dosages biologiques, l'amarrage moléculaire et les relations spectre-activité sont appropriés pour lier la qualité des échantillons aux ingrédients actifs pharmaceutiques. Et notre étude établirait une base théorique pour l'application des extraits aqueux d'AMR dans les cosmétiques blanchissants.

1. Introduction

La tyrosinase (TYR), également appelée polyphénol oxydase, est une enzyme polyfonctionnelle contenant du cuivre glycosylé qui existe largement dans l'organisme des animaux, des plantes et des micro-organismes [1–3]. En présence d'oxygène moléculaire, la tyrosine est d'abord catalysée par TYR pour s'oxyder en dopa, puis s'oxyde davantage en dopaquinone, qui s'isomérise pour former un pigment dopa. Le pigment dopa a finalement formé de la mélanine avec la participation de CO2 et de TRP -2, qui provoquent diverses maladies de la peau telles que l'hyperpigmentation, le mélasma, les taches de rousseur et les taches de vieillesse [4, 5]. TYR joue un rôle vital car c'est l'enzyme critique et l'enzyme de restriction au cours de la composition de la mélanine [6–8]. Les taches pigmentaires et le mélanome ont nettement augmenté en augmentant l'activité et la quantité de TYR [9]. De nos jours, les inhibiteurs de TYR ont reçu une large attention en raison de leur utilisation latente en tant qu'agents hypopigmentés [10].

Le rhizome d'Atractylodis macrocephalus (AMR), le rhizome sec d'Atractylodes macrocephalaKoidz., est l'une des plantes médicinales chinoises compilées dans la Pharmacopée chinoise [11–15]. Dans la Chine ancienne, l'AMR a été choisie pour former la célèbre formule classique de blanchiment désignée "Seven-White Ointment" et utilisée comme aliment complémentaire pour la beauté dans le palais [16]. Il a été rapporté que la RAM contenait principalement des sesquiterpénoïdes et des triterpénoïdes (y compris l'atractylénolide I, l'atractylénolide II et l'atractylénolide III), des polyacétylènes, des coumarines et des phénylpropanoïdes, des flavonoïdes et des glycosides flflavonoïdes, des polysaccharides, des stéroïdes, des benzoquinones et d'autres constituants [17, 18]. Cependant, ses effets sur le blanchiment de la peau et des ingrédients actifs ont été rarement signalés.Leétude de la relation spectre-activité a été appliquée pour explorer leur pertinence.

La recherche sur la relation spectre-activité permet non seulement de contourner le défaut de ségrégation entre ingrédients chimiques et pharmacodynamique mais aussi d'associer suffisamment les empreintes digitales à la pharmacodynamique par le modèle mathématique [19, 20].ELa relation spectre-activité explore la pertinence entre l'empreinte digitale et la pharmacodynamie pour offrir une méthode crédible pour clarifier la base matérielle de la phytothérapie chinoise [21].Leles empreintes digitales ont été établies par HPLC, UPLC, GC, GC MS et LC-MS généralement [19, 22–24]. Les données "pharmacodynamiques" sont acquises par les modèles habituellement [25].Leles méthodes de traitement des données, comprennent principalement l'analyse en composantes principales (ACP), l'analyse de régression des moindres carrés partiels (PLS), l'analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA), l'analyse de corrélation canonique (CCA) et l'analyse relationnelle grise (GRA) généralement [26–29].

Pour clarifier les composants de l'AMR qui contribuent à l'activité inhibitrice de TYR [30, 31], les empreintes digitales de 11 lots d'AMR ont été établies par HPLC ; la pharmacodynamique de l'activité d'inhibition de TYR in vitro a été évaluée par la méthode enzymatique biochimique. 2e composés efficaces ont été sélectionnés par le modèle de relation spectre-activité qui a été établi en corrélant les pics d'empreintes digitales avec les données pharmacodynamiques. De plus, les substances actives seraient validées par des tests in vitro et des expériences d'amarrage moléculaire. Cette étude pourrait jeter les bases théoriques de l'application de l'AMR comme médicament de traitement des maladies pigmentées de la peau et de son développement en complément des cosmétiques blanchissants.

2. Matériels et méthodes

2.1. Produits chimiques et matériaux.Le méthanol (supérieur ou égal à 99,5 %) a été acheté auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Chine). L'acide phosphorique (supérieur ou égal à 99 %) a été acheté auprès de Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd. (Chengdu, Chine). L'acétonitrile a été acheté auprès de Tiandi Reagent Co., Ltd. (USA). Les atractylodes III (supérieurs ou égaux à 98 %), le tampon phosphate, la tyrosinase et la L-tyrosine ont été achetés auprès de Beijing Soleibao Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine). -L'arbutine (supérieur ou égal à 99,7 %) a été achetée auprès de l'Académie chinoise d'identification des aliments et des médicaments. La tyrosinase et la L-tyrosine ont été dissoutes dans un tampon phosphate (pH 6,8) avant utilisation. Les atractyloses III et -arbutine ont été dissous dans du méthanol à 50 % (v/v).Lel'eau pure a été achetée à Hangzhou Wahaha Baili Food Co., Ltd., (Hangzhou, Chine). La colonne Comix C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) a été achetée auprès de Guangzhou Philemon Scientific Instrument Co., Ltd. (Guangzhou, Chine).

2.2. Matériaux végétaux.Le11 lots d'échantillons de médicaments AMR ont été collectés et sont présentés dans le tableau 1.Leles échantillons ci-dessus ont été authentifiés par le professeur Ronggui Qin (École de pharmacie, Guizhou Medical University).

2.3. Extraction.Des morceaux d'herbes de chaque échantillon (environ 10 g) ont été pesés avec précision puis placés dans un ballon à fond rond, en ajoutant de l'eau et en chauffant au reflux pour extraire. Les produits ont été séchés sous pression réduite pour obtenir l'extrait aqueux d'AMR. 2en, les extraits aqueux d'AMR (environ 30,00 mg) ont été pesés avec précision et dissous avec 50 % de méthanol (v/v).

2.4. Analyse CLHP.Colonne de chromatographie en phase inverse Comix C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm).Lephase mobile 0.1 % phosphorique était un mélange d'eau acide (A)-acétonitrile (B) ; le système d'élution est conçu et est répertorié dans le tableau 2.Lele débit suivant a été fixé à 0.6 mL/min. La température de la colonne 2e était de 30 degrés.LeLa longueur d'onde UA était de 210 nm.Lele volume d'injection était de 30 μL.

La méthode de détection a été vérifiée par un test de précision, un test de répétabilité et un test de stabilité.

2.5. Analyse chimiométrique.Dans cette étude, les informations sur les pics communs des empreintes digitales de 11 lots d'AMR ont été importées dans le logiciel SIMCA14.1 pour HCA, PCA et OPLS-DA.

2.6. Test d'inhibition TYR in vitro. Ledes extraits d'AMR ont été dissous avec du tampon phosphate (pH 6,8), stockés à 4 degrés, puis utilisés pour le dosage de l'enzyme.

Dans cette étude, la L-tyrosine a été utilisée comme substrat pour déterminer l'inhibition de l'activité TYR.Leles solutions de réaction ont été préparées selon le tableau 3, et le taux d'inhibition de l'AMR sur l'activité TYR a été déterminé. Tout d'abord, les solutions de réaction ont été placées dans un bain-marie à 37 degrés pendant 10 minutes. Deuxièmement, la solution de TYR a été ajoutée immédiatement aux solutions de réaction T2 et T4. Deuxièmement, les solutions de réaction ont réagi à une température constante du bain-marie à 37 degrés pendant 10 minutes après avoir été complètement mélangées. Enfin, les solutions de réaction des valeurs d'absorbance ont été mesurées à 475 nm immédiatement. Les taux d'inhibition (pourcentage) ont été obtenus à partir de l'équation : le taux d'inhibition (pourcentage) =[(AT2− AT1) − (AT4 − AT3)]/(AT2− AT1) × 100 pourcent .

2.7. Analyse de la relation spectre-activité. LeLe logiciel "Système d'évaluation de la similarité des empreintes digitales chromatographiques en médecine traditionnelle chinoise 2012 A Edition" a été utilisé pour ajuster les temps de rétention de chaque pic, et la surface du pic (PA) a été traitée par égalisation.Len, les données quantitatives ont été obtenues.LeL'équation de régression PLS a été mise en place avec le logiciel SIMCA14.1 ; la surface du pic a été prise comme variable indépendante (X) et le taux d'inhibition de TYR a été défini comme variable dépendante (Y).

2.8. Effet inhibiteur des atractylodes III sur le TYR et l'amarrage moléculaire.Pour témoigner de l'effet inhibiteur de l'atractylénolide III sur la TYR, des tests d'activité enzymatique in vitro ont été menés par l'-arbutine servant de médicament témoin positif.

Le programme AutoDock4.2 a été appliqué dans des simulations d'amarrage. La structure cristalline d'Agaricus bisporus (PDB ID : 2Y9X) a été prise comme structure 3D de TYR [32]. Nous avons effectué des simulations de l'amarrage de TYR à Atractylodes III. Dans le but de l'amarrage avec AutoDock Vina, la taille de la grille a été conçue pour (x, y, z) =(16, 12, 14), et le centre de la grille a été conçu pour (x, y, z) { {10}} (−10,348, −28,279, −45,925). Dans chaque procédure de simulation, la progression avec les paramètres par défaut s'opère depuis AutoGrid et AutoDock. L'algorithme génétique lamarckien (LGA) a été adopté pour déterminer les orientations de liaison de ligand les plus appropriées.

3. Résultats et discussion

3.1. Validation de la méthodologie.La précision, la répétabilité et la stabilité ont été validées pour la méthode analytique. Lors des tests de précision, la précision des temps de rétention relatifs (RRT) et des aires de pic relatives (RPA) n'a pas dépassé {{0}}.02 % et 4 % en RSD, respectivement ; la similarité était de 1. La répétabilité des RRT et des RPA était inférieure à 0.11 % et 4 % en RSD, et la similarité était supérieure ou égale à 0.998. La stabilité a été estimée en testant une solution d'échantillon conservée à la température ambiante du laboratoire après 0, 6, 8, 12 et 18 h. Les RSD des RRT et des RPA des pics communs étaient inférieurs à 0,1 % et 4 %, respectivement ; la similarité était supérieure à 0,999.LeCes résultats suggèrent que le système expérimental AMR pour l'analyse des empreintes digitales est stable et fiable.

3.2. Établissement d'empreintes digitales HPLC et analyse de similarité.L'empreinte digitale des substances de référence Atractylodes III est présentée sur la figure 1 (a). L'échantillon AMR a montré une ségrégation favorable parmi ses pics (Figure 1 (b)). Dans des conditions parfaites, les empreintes digitales HPLC des 11 lots différents d'échantillons AMR ont été générées (Figure 1(c)) et les similitudes ont été calculées. Les résultats des similarités sont présentés dans le tableau 4, qui a montré que toutes les valeurs de similarité des 11 échantillons étaient supérieures à 0.8, indiquant que tous les échantillons étaient similaires dans les types de compositions chimiques. Seize pics communs ont été observés en comparant leur temps de rétention du spectre UV. Le pic 11 a été identifié comme Atractylodes III par des substances de référence. Les RSD des AP de 16 pics communs se situaient entre 1,18 % et 58,68 % (tableau 5). Ces résultats ont indiqué que les teneurs en substances chimiques dans la RAM provenant de différentes zones de production étaient différentes.

3.3. Analyse chimiométrique

3.3.1. HCA. HCA a été appliqué pour identifier la RAM de différentes zones de production en fonction de différents groupes et de la similitude des empreintes digitales. La zone de pic commune dans 11 lots d'AMR a été utilisée comme indicateur, et l'analyse de cluster a été réalisée par le logiciel SIMCA14.1. Les résultats sont présentés à la figure 2. Les échantillons de 11 lots d'AMR ont été divisés en 3 catégories lorsque les distances de classe variaient entre 20 et 30, dont S4, S8, S9, S1 et S3 ont été regroupés en catégories I et S7 était regroupés en catégorie II, tandis que S2, S5, S10, S6 et S11 ont été regroupés en catégorie III.

3.3.2. PCA. Dans cette étude, l'ACP de 11 lots d'AMR a été calculée ; dans 16 composantes principales, la contribution cumulée de la variance des cinq premières composantes principales était de 91,3 % .Lela matrice des scores des deux premières composantes serait utilisée pour l'analyse puisque la variance cumulée dépassait 65,9 %.LePar conséquent, en l'absence de certaines informations, construisez un plan bidimensionnel de la composante principale dont l'abscisse était une composante principale et l'ordonnée était une autre composante principale. Ensuite, les 11 échantillons ont été projetés sur le plan 2D afin d'observer leur rassemblement naturel (Figure 3(a)). Il a été établi que S4, S8, S9, S1 et S3 avaient des classifications évidentes, S7 pouvait être divisé en un type et S2, S5, S10, S6 et S11 pouvaient être divisés en un autre type.LeLe résultat de l'ACP était cohérent avec le résultat de l'AHC.

Chaque point du diagramme de charge représentait un pic chromatographique, qui représente la contribution de chaque pic chromatographique à l'effet global de lacomposants principaux.Lela valeur pondérale des variables peutreflètent la corrélation entre la composition chimiqueet l'échantillon dans la plus grande mesure.Leplus loin del'origine du diagramme de charge, plus la variable est grandelester.Lerésultat est illustré à la figure 3(b), qui suggèreque les pics chromatographiques 9, 11 (atractylénolide III),et 12 ont eu un impact plus important sur la première composante principale. Cependant, les pics chromatographiques 4, 5, 6, 15 et 16eu un impact plus important sur la deuxième composante principale. Ilont montré que les pics chromatographiques ci-dessus pouvaient avoir uneun plus grand impact sur le classement.

3.3.3. OPLS-DA.Le11 échantillons ont été divisés en deux groupes : S1, S3, S4, S8 et S9 étaient le premier groupe et S2, S5, S6, S7, S10 et S11 étaient le deuxième groupe.Leles informations de pic communes de tous les échantillons ont été importées dans le logiciel SIMCA14.1 pour OPLS-DA. R2 X et R2 Y caractérisent le taux explicatif du modèle aux matrices x et y, individuellement, et Q2 caractérise la capacité prédictive du modèle.Leles résultats ont montré que les valeurs de R2 X, R2 Y et Q2 étaient respectivement 0.939, 0.992 et 0.583, toutes supérieures à {{ 9}}.5, indiquant que le modèle pouvait distinguer les deux groupes d'échantillons et avait une meilleure capacité d'ajustement et de prédiction dans le traitement des données. Il pourrait être utilisé pour distinguer la RAM de différentes zones de production (Figure 4(a)).

LeLe profil des variables importantes pour la projection (VIP) dans le modèle OPLS-DA peut refléter la contribution de chaque pic chromatographique à l'échantillon.LeLes valeurs VIP des 16 pics chromatographiques reflétaient la puissance d'influence sur chaque échantillon AMR. Sur la base du principe de sélection selon lequel la valeur VIP était supérieure à 1.0 et la barre d'erreur était inférieure à l'origine (Figure 4(b)), les 4 pics chromatographiques importants ont été sélectionnés, qui ont été classés dans l'ordre : pic 1 > pic 6 > pic 16 > pic 5.

Leles résultats d'analyse du diagramme de charge sont présentés sur la figure 4 (c), qui a montré que les positions des 4 pics chromatographiques importants ci-dessus étaient éloignées de l'origine. Il a été suggéré que les 4 pics chromatographiques avaient un impact significatif sur la classification de l'AMR, et ces composants représentés par 4 pics chromatographiques pourraient être les principaux composants marqueurs de chaque échantillon.

3.4. Évaluation de l'activité inhibitrice de la RAM sur TYR in vitro.Leles effets inhibiteurs de la RAM provenant de différentes zones de production sur l'activité de TYR ont été déterminés par la méthode enzymatique biochimique.Leles effets des échantillons sur l'activité TYR sont répertoriés dans le tableau 6. Chaque échantillon avec une concentration de 10 mg/mL pouvait inhiber l'activité TYR et l'activité pharmacologique était remarquablement différente, parmi lesquelles le taux d'inhibition de S5 était le plus élevé, tandis que S6 était le plus bas.

3.5. Analyse des relations spectre-effet. Dans cet article, PLS a été appliqué pour analyser la relation spectre-activité.Lele coefficient de régression partielle et la valeur VIP sont illustrés aux figures 5(a) et 5(b), qui ont montré que les pics chromatographiques 1, 2, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 15 et 16 étaient corrélés positivement avec la inhibition de l'activité TYR, mais les pics chromatographiques 3, 4, 8, 12, 13 et 14 étaient corrélés négativement avec eux. Parmi les pics chromatographiques positivement corrélés à l'inhibition de l'activité TYR, les valeurs VIP des pics chromatographiques 11 (Atractylodes III) et 15 étaient supérieures à 1, ce qui indique que ces deux composants influencent significativement l'inhibition de l'activité TYR.

3.6. Effet inhibiteur des atractylodes III sur le TYR et l'amarrage moléculaire.LeL'effet inhibiteur d'Atractylodes III sur l'activité TYR a été déterminé par la méthode enzymatique biochimique in vitro avec -arbutine comme témoin positif.Leles résultats ont montré que les taux d'inhibition des Atractylodes III et -arbutine sur l'activité TYR étaient de 63,68 ± 2,36 % et de 94,85 ± 0.35 %, respectivement, lorsque la concentration des échantillons était de 1 mg/mL.

L'amarrage moléculaire a été utilisé pour étudier le mécanisme de liaison d'Atractylodes III interagissant avec TYR (figures 6 (a) à 6 (c)).LeLe site de liaison de la tyrosinase de champignon est composé d'une cavité étroite et peu profonde avec deux ions cuivre (Cu2 plus ) chacun stabilisé par trois résidus histidine (par exemple, His 61) au centre actif de l'enzyme. Dans cette étude, Atractylodes III est un petit composé moléculaire situé dans le centre actif de l'enzyme et interagit avec les résidus environnants (His 244, Phe 264, Ala 286, His 263, Val 283, His259, His 85, Asn 260). Remarquablement, Atractylodes III a formé une liaison hydrogène stable avec Asn 260 avec une longueur de liaison de 1,9 ˚ A.

4. Conclusions

Dans cette étude, une méthode systématique a été établie reliant les empreintes digitales HPLC à l'analyse chimiométrique pour distinguer les échantillons de RAM de différentes origines, et l'effet blanchissant de la RAM a été prouvé par la méthode enzymatique biochimique. Les relations spectre-effet ont indiqué que les pics chromatographiques 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11, 15 et 16 étaient positivement corrélés avec l'effet d'inhibition de l'AMR sur l'activité TYR, parmi lesquels les pics 11 (atractylénolide III) et 15 pourraient être constituants actifs importants. Pendant ce temps, l'atractylénolide III a une activité inhibitrice élevée du TYR dans le test in vitro, et le résultat de l'amarrage moléculaire a montré que son mécanisme pourrait être lié à la liaison des résidus d'acides aminés dans la capsule catalytique du TYR.LePar conséquent, ces résultats ont prouvé que les dosages biologiques, l'amarrage moléculaire et les relations spectre-activité sont appropriés pour lier la qualité des échantillons aux ingrédients actifs pharmaceutiques.

Disponibilité des données

Les données utilisées pour étayer les conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

Divulgation

Yong-Qin Liu et Chang-Yan Xu sont considérés comme co-premiers auteurs.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts dans cette étude.

Contributions des auteurs

Yong-Qin Liu et Chang-Yan Xu ont contribué au travail.

Remerciements

Cette étude a été parrainée par le programme de formation à l'innovation et à l'entrepreneuriat pour les étudiants universitaires de la province du Guizhou (n° 20195200925).

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