Cytotoxicité sélective de la substance à base de plantes Actéoside contre les cellules tumorales et ses connaissances mécanistes
Mar 14, 2022
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Christina Cheimonidi et al
ABSTRAIT
Les produits naturels sont caractérisés par une diversité structurelle extrême et offrent donc une source unique pour l’identification de nouveaux agents antitumoraux. Ici, nous rapportons que la substance à base de plantesacteosidele fait d’être isolé par des méthodes phytochimiques avancées à partir de feuilles de Lippia citriodora a montré une cytotoxicité accrue contre les cellules tumorales métastatiques; a agi en synergie avec divers agents cytotoxiques et sensibilisé les cellules cancéreuses chimiorésistantes.Actérosiden’était pas toxique dans les contextes cellulaires physiologiques, alors qu’il augmentait la charge oxydative, affectait l’activité des modules protéostatiques et supprimait les métalloprotéinases matricielles dans les lignées cellulaires tumorales. L’administration intrapéritonéale ou orale (via l’eau potable) d’actéoside dans un modèle murin de mélanome a régulé à la hausse les réponses antioxydantes dans les tumeurs; Pourtant, seul l’administration intrapéritonéale a supprimé la croissance tumorale et induit des réponses immunitaires anti-tumorales-réactives. Les analyses d’identification/quantification par spectrométrie de masse ont révélé que l’administration intrapéritonéale deacteosidea entraîné une administration significativement plus élevée, par rapport à l’administration orale, de la concentration du composé dans le plasma et les tumeurs des souris traitées, suggérant que son effet antitumoral in vivo dépend de la voie d’administration et de la concentration atteinte dans la tumeur. Enfin, des études de modélisation moléculaire et des essais d’activité enzymatique ont montré queacteosideinhibe la protéine kinase C. De manière concluante, l’actéoside est prometteur en tant qu’échafaudage chimique pour le développement de nouveaux agents antitumoraux.
Mots-clés:Actéroside, Cancer, Composé naturel, Stress oxydatif, Protéostasie, Immunomodulation
1. Introduction
La cancérogenèse est caractérisée par la dérégulation de plusieurs voies de signalisation cellulaire et est associée à une augmentation du stress cellulaire oxydatif, réplicatif, métabolique, génotoxique et protéotoxique [1]. Pour adapter et surmonter ces phénotypes de stress, les cellules malignes régulent à la hausse (en dehors des oncogènes) plusieurs voies non oncogènes visant à supprimer ou (au moins) à atténuer le stress en cours. Parmi les diverses voies non oncogènes fréquemment régulées à la hausse au cours de la tumorigenèse figurent les modules du réseau de protéostasie (PN) ainsi que les réponses antioxydantes cellulaires [2,3].
Les composants clés de la NP sont les deux principales mécanismes de dégradation, à savoir la voie autophagie-lysosome (ALP) et la voie ubiquitine-protéasome (UPP), ainsi que le réseau des chaperons moléculaires cellulaires. L’ALP est principalement impliqué dans la dégradation des agrégats de protéines et des organites endommagés [4], tandis que l’UPP dégrade les protéines normales à courte durée de vie et les protéines non réparables mal repliées ou dépliées [5–8]. Le protéasome 26Seukaryotic est constitué à partir des particules régulatrices 19S (RP) et de la particule 20 Score (CP); ce dernier est composé de quatre anneaux heptamériques empilés (deux de type α entourant deux de type β) qui forment une structure en forme de tonneau. Les activités de la chymotrypsine de type (CT-L), de type trypsine (T-L) et de type caspase (C-L) de la protéasome peptidase sont situées respectivement dans les sous-unités protéasomiques β5, β2 et β1 [6]. L’efficacité clinique démontrée des inhibiteurs du protéasome Bortézomib (Velcade®; également appelé PS-341) et Carfifilzomib contre diverses tumeurs malignes hématologiques [9] a fourni la « preuve de concept » de cibler l’UPP comme une stratégie prometteuse pour le traitement du cancer. Le réseau complexe de voies de défense antioxydantes cellulaires qui est fréquemment régulé à la hausse pendant la cancérogenèse [3,10] comprend des enzymes antioxydantes, ainsi que plusieurs facteurs de transcription qui mobilisent les réponses génomiques cytoprotectrices; il s’agit notamment de la boîte de fourche O (Foxo) et du facteur nucléaire érythroïde 2 (Nrf-2). Le Nrf-2 est essentiel dans la protection des cellules contre les dommages oxydatifs et/ou xénobiotiques car il stimule l’expression des gènes antioxydants et de phase II [11-13].
Nous et d’autres avons récemment proposé que le ciblage de ces dépendances tumorales (c’est-à-dire les modules protéostatiques et / ou les voies de réponse antioxydantes) ou l’augmentation des niveaux cellulaires de ROS dans le contexte d’un génotype transformé offrent une fenêtre thérapeutique potentielle pour la destruction sélective des cellules tumorales [3,14]; à l’appui, la destruction sélective des cellules cancéreuses par une petite molécule qui a régulé à la hausse les niveaux de ROS cellulaires a été rapportée [2]. On s’attend à ce que les approches combinatoires, y compris l’activation des réponses immunitaires anti-tumorales-réactives [15] maximisent probablement la fenêtre thérapeutique offerte en inhibant les réponses PN et antioxydantes et / ou en élevant les niveaux de ROS cellulaires.
Les produits naturels (extraits ou composés purs) (NP) provenant de diverses sources (plantes, organismes marins, micro-organismes, etc.) sont examinés pour leur capacité à agir en tant qu’agents antitumoraux en raison de leur extrême diversité structurelle et de leur complexité chimique, ainsi que parce qu’ils agissent en modulant pléiotropiquement plusieurs voies de signalisation cellulaire [16]. Les IP activeraient des réponses anti-inflammatoires, anti-tumorales et/ou anti-métastatiques [16,17] et échapperaient également à la multirésistance aux médicaments [18,19]. Parmi ceux-ci, les composés phénoliques (y compris les glycosides phényléthanoïdes) ont suscité un intérêt important en raison de leur rôle déclaré dans la prévention et / ou le traitement de diverses maladies humaines.
L’actéoside, également appelé usage ou verbascoside [20], est un glycoside phényléthanoïde isolé de nombreux dicotylédones. Apparemment, l’actéoside exerce des activités biologiques intéressantes, y compris des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et régulatrices de l’apoptose cellulaire [21,22]. Néanmoins, son activité anti-tumorale potentielle n’a pas été abordée. Nous rapportons ici que l’actéoside a montré une cytotoxicité accrue contre les cellules cancéreuses de mammifères sans effets toxiques apparents dans les contextes cellulaires physiologiques. En outre, l’actéoside a supprimé la croissance tumorale du mélanome dans le modèle murin Vivo, en activant (entre autres) les réponses immunitaires anti-tumorales-réactives.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Matériel végétal et extraction
des feuilles séchées de Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) ont été achetées sur le marché local d’Athènes, en Grèce. Les feuilles ont été pulvérisées et extraites par agitation mécanique pendant 12 h avec du méthanol (2 × 20 L). L’extrait méthanolique a été évaporé à sec et lavé avec un mélange de CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). Le résidu insoluble a été séparé et séché, produisant une poudre vert-jaune (450 g).
2.2. Purification de l’analyse de l’actéoside et de l’UPLC-HRMS
Une partie (10 g) du résidu susmentionné a été soumise à une chromatographie à contre-courant à l’aide d’un appareil de chromatographie à partition centrifuge rapide (FCPC) (Kromaton, France); un mélange d’EtOAc/EtOH/H2O au rapport 5/0,5/4,5 a été utilisé comme système de solvant biphasique. Les fractions collectées ont été soumises à la chromatographie sur couche mince; puis les chromatogrammes ont été observés sous une lampe UV (254 et 365 nm) et visualisés par pulvérisation de sulfate de vanilline au méthanol suivi d’un chauffage pendant deux minutes. Au total, 2,1 g d’actéoside (pureté ≥ 90%) ont été isolés par le processus susmentionné. L’identification de l’actéoside a été réalisée par résonance magnétique nucléaire (RMN) et spectres de spectrométrie de masse (SM), tandis que sa pureté a été établie par UPLC-MS et analyse RMN; Pour plus de détails, voir Suppl. Matériaux et méthodes.
2.3. Lignées cellulaires
Fibroblastes embryonnaires pulmonaires humains (cellules IMR90) avec la B16. F1, B16. Les lignées cellulaires de souris F10, YAC-1 et WEHI-164 ont été obtenues à partir de l’American Tissue Culture Collection (ATCC). Les lignées cellulaires d’ostéosarcome humain U2 OS et Sa OS ont été gracieusement données par le professeur V. Gorgoulis (École de médecine, Université nationale et capodistrienne d’Athènes, Grèce), tandis que les cellules d’ostéosarcome KH OS et les lignées cellulaires d’ostéosarcome chimiorésistant [23] ont été un don du Dr E. Gonos (Fondation nationale de recherche hellénique, Grèce). Les lignées cellulaires C5N et A5 du cancer de la souris appartiennent à un modèle de cancérogenèse de la peau de souris en plusieurs étapes [24,25] et ont été données par le professeur A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, Université de Californie, États-Unis). Les conditions de culture des lignées cellulaires utilisées sont rapportées dans Suppl. Matériaux et méthodes.
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2.4. Mélanome modèle murin mâle
Des souris C57BL/6 (25–30 g de poids, âgées de 6–8 semaines) ont été obtenues auprès de l’Institut Pasteur hellénique et logées sous température contrôlée (22 °C) et photopériode (12 h de lumière : 12 h d’obscurité) avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Les souris ont été inoculées par voie sous-cutanée avec 105 B16. Cellules de mélanome F1 (dans 100 μL PBS) et ont été assignées au hasard à 3 groupes (n = 5/groupe). Lorsque les tumeurs sont devenues palpables (jour 11), les souris ont reçu de l’actéoside par deux voies; soit par voie intrapéritonéale (IP) (1 mg/souris dilué dans 200 μL de PBS; au total 6 doses administrées tous les deux jours) ou par voie orale par eau potable (RC) (2,5 mg/souris; au total 13 doses pendant 13 jours consécutifs). Des souris témoins ont reçu du PBS. La croissance tumorale a été enregistrée tous les 2 jours en mesurant les axes majeurs et mineurs des tumeurs formées avec un étrier numérique. Les mesures ont été transformées en volume tumoral en utilisant la formule: volume tumoral (cm3) = axe majeur × axe mineur2 × 0,5. Le jour 28, les animaux ont été euthanasiés par luxation cervicale et la rate a été enlevée de manière aseptique. L’expérience a été répétée trois fois avec des résultats similaires.
Les splenocytes ont été isolés à partir de rates homogénéisées individuellement et immédiatement testés pour leur cytotoxicité par rapport à B16. Cibles de cellules F1, YAC-1 et WEHI-164. La cytotoxicité a été évaluée sur la base de la détection d’une exposition au CD107 à la surface de la cellule, à la suite de la dégranulation des cellules effectrices. Les splenocytes (105 cellules/puits) ont été co-cultivés avec des cibles dans des microplaques inférieures en U de 96 puits à un rapport effecteur/cible (E:T) de 100:1, à 37 °C dans 5 % de CO2. Des anticorps monoclonaux conjugués FITC anti-CD107a et anti-CD107b (25 μL/mL) et de la monensine (6 μL/mL; tous de BD Biosciences) ont été ajoutés dans chaque puits. Les cellules ont été prélevées 6 heures plus tard et analysées à l’aide d’un cytomètre en flux FACSCanto II. En parallèle, les tumeurs ont été excisées et traitées pour des essais en aval comme décrit dans Suppl. Matériaux et méthodes.
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