La stabilisation simultanée du cytosquelette d'actine dans plusieurs cellules spécifiques au néphron protège le rein de diverses blessures
Sep 26, 2023
Maladies rénales chroniquesetlésion rénale aiguësont mécaniquementmaladies rénales distinctes. Même si les maladies rénales chroniques sont associées àlésion podocytaire, lésion rénale aiguëaffecte les cellules épithéliales des tubes rénaux. Malgré ces différences,un trait cardinaldes deuxmaladies rénales aiguës et chroniquesest le cytosquelette d'actine dérégulé. Nous avons montré queactivation pharmacologique de la dynamine GTPaseaméliore les lésions des podocytesmodèles murins de maladies rénales chroniquesparfavorisant la polymérisation de l'actine. Nous établissons ici le rôle de la dynamine dans la modulation de la rigidité et de la polarité decellules épithéliales des tubes rénauxen réticulant les filaments d'actine en réseaux ramifiés. L'activation de la capacité de réticulation de la dynamine par un agoniste de petite molécule stabilise le cortex d'actomyosine de la membrane apicale contre les blessures, ce qui à son tourpréserve la fonction rénaledans divers modèles murins de lésions rénales aiguës. Notamment, un agoniste de la dynamine atténue simultanément les podocytes etblessure tubulairedans le modèle génétique murin du syndrome d'Alport. Notre étude fournit des preuves de la faisabilité et met en évidence lesavantages de nouvelles thérapies holistiques de protection du néphron.
Leprincipales causes d’insuffisance rénale aiguë(AKI) sontischémie, hypoxie, ounéphrotoxicité1. Bien qu'elle puisse être inversée, l'AKI représente un problème de santé important avec une mortalité élevée et aucun traitement définitif. Quelle que soit son étiologie, l’AKI endommage principalement les cellules épithéliales polarisées des tubules rénaux dont les microvillosités apicales forment la bordure en brosse tubulaire qui participe à la coordination du transport essentiel des électrolytes et de l’eau2. Une caractéristique morphologique précoce de l’AKI est la perte de la bordure en brosse et de la polarité cellulaire due à la dégradation du cortex d’actomyosine au niveau de la membrane apicale1.
L'établissement et le maintien de la polarité cellulaire impliquent des cascades de signalisation, un trafic membranaire et une dynamique cytosquelettique, qui sont tous hautement coordonnés3. L'organisation de la membrane apicale est largement déterminée par l'architecture des réseaux d'actomyosine4, qui établit la rigidité du cortex, facilitant ainsi le regroupement des protéines de polarité. Alors que les moteurs de la myosine II sont considérés comme le principal générateur de rigidité corticale5,6, l'architecture du cortex d'actomyosine est établie par une myriade de protéines liant l'actine (ABP)7.
En plus des ABP connus, la bordure en brosse des tubules rénaux est hautement enrichie en dynamine8, une GTPase surtout connue pour son rôle dans l'endocytose9. La dynamine a une propension intrinsèque à s'assembler en plusieurs états d'oligomérisation tels que des dimères, des tétramères, des anneaux et des spirales9. Nous avons identifié pour la première fois des interactions directes dynamine-actine10 et montré que l'oligomérisation de la dynamine régule la polymérisation de l'actine dans les podocytes11,12, cellules spécialisées essentielles à la sélectivité du filtre rénal. En utilisant des modèles murins d’IRC, nous avons montré que l’activation de la polymérisation de l’actine dépendante de la dynamine inverse les lésions des podocytes en restaurant leur structure et leur fonction uniques12.
Nous montrons ici que danscellules épithéliales des tubes rénaux, la dynamine réticule l'actine filamenteuse (F-actine) en réseaux ramifiés. La capacité de réticulation de Dynamin est définie par son état d'oligomérisation et la longueur de la F-actine. L'activation pharmacologique de l'oligomérisation de la dynamine neutralise l'AKI en stabilisant les réseaux d'actine et donc l'intégrité cellulaire, ce qui protège partiellement les cellules épithéliales rénales des lésions induites par le stress oxydatif. Notre étude identifie le cortex d'actomyosine de la membrane apicale de la cellule tubulaire rénale comme cible médicamenteuse dans l'AKI via la dynamine comme proxy
Résultats L'oligomérisation Dynamin établit la rigidité et la morphologie de la membrane apicale.
Pour examiner le rôle des interactions dynamine-actine dans les cellules épithéliales polarisées des tubes rénaux, nous avons utilisé Bis-T-23, un activateur allostérique de l'oligomérisation de la dynamine dépendante de l'actine dans un système reconstitué, dans les cellules11,13 et dans le organisme entier12. Les phénotypes cellulaires ont été évalués dans les cellules Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) en suivant l'état de la F-actine et le schéma de coloration d'une protéine à jonction serrée zonula occludens-1 (ZO-1), qui est considéré comme un biomarqueur de la polarité cellulaire. La cytochalasine D (CytoD) et la latrunculine A (LatA), inhibiteurs connus de la polymérisation de l'actine, ont diminué les taux de F-actine et ont induit une coloration discontinue de ZO -1 (Fig. 1a supplémentaire). En revanche, le Bis-T-23 a induit une légère augmentation des niveaux de F-actine sans aucun effet sur la coloration ZO-1. Ajout de Bis-T-23 avant mais pas après LatA, niveaux de F-actine et polarité cellulaire partiellement préservés. Ni le véhicule DMSO ni l'inhibiteur de dynamine, dynole14, n'ont présenté d'effet (Fig. 1a supplémentaire).
La microscopie électronique à balayage (MEB) nous a permis de visualiser les altérations de la morphologie cellulaire induites par les médicaments, en nous concentrant sur la membrane apicale (Fig. 1a). La hauteur moyenne des cellules MDCK était de 11 ± 2 µm et la longueur moyenne des microvillosités était de 0,63 ± 0,2 µm (Tableau 1), ce qui se situe dans la plage observée dans le rein15. LatA a diminué la hauteur des cellules et la longueur des microvillosités et a déplacé les microvillosités uniformément réparties en grappes, alors que Bis-T -23 a induit les effets opposés (Tableau 1, Fig. 1a). Lorsqu'il est ajouté avant LatA, Bis-T-23 a partiellement préservé la hauteur des cellules et la longueur des microvillosités. Étant donné que les microvillosités présentent un contrôle de longueur exquis défini par l'actine corticale à leur base16, ces données prouvent que Bis-T-23 a modifié le cortex d'actomyosine au niveau de la membrane apicale.
Pour déterminer l'effet exact que Bis-T-23 a eu sur l'actine corticale, nous avons visualisé le cortex d'actomyosine dans les lamellipodes en utilisant la microscopie électronique à réplique de platine (PR-EM). LatA a diminué la densité des réseaux d'actine et cet effet a été partiellement abrogé par l'ajout de Bis-T-23 avant LatA (Fig. 1b). Comme LatA accélère la dépolymérisation des filaments d'actine en séquestrant les monomères d'actine, nous avons ensuite examiné si la préservation observée du cortex d'actomyosine par Bis-T-23 était due à son effet positif sur la polymérisation de l'actine. Contrairement à la puissante stimulation de la polymérisation de l'actine observée dans les extraits de cellules de podocytes , Bis-T -23 n'a que légèrement augmenté la polymérisation de l'actine dans l'extrait de cellules MDCK (Fig. 1b supplémentaire). De même, l'immunodéplétion de la dynamine endogène -2 (Dyn2) provenant de l'extrait ou l'inhibition de son activité GTPase par la dynode a entraîné une altération marginale de la polymérisation de l'actine (Fig. 1c supplémentaire). Alors que LatA et CytoD ont considérablement altéré la polymérisation de l'actine, l'ajout de Bis-T -23 avant LatA ou CytoD n'a pas permis de surmonter leurs effets inhibiteurs (Fig. 1d, e supplémentaire). Le jasplakinolide, un médicament qui induit la polymérisation de l'actine en stimulant la nucléation du filament d'actine, n'a pas augmenté de manière significative le niveau global de polymérisation (Fig. 1d supplémentaire), ce qui suggère que le lysat de cellules MDCK présente un niveau presque maximal d'actine polymérisée. Ensemble, ces données ont indiqué que les effets du Bis-T-23 sur la morphologie de la membrane apicale des cellules MDCK étaient pilotés par un mécanisme autre que la polymérisation de l'actine.
Compte tenu de la connaissance commune de la localisation enrichie de Dyn2 et de la F-actine à la bordure en brosse des cellules épithéliales rénales8 et du rôle de la dynamine dans l'endocytose, nous avons ensuite étudié si Bis-T-23 affectait indirectement l'actine via des altérations de l'endocytose. Comme prévu, Dyn2 et F-actine sont co-localisées dans le cortex d'actomyosine sous la membrane apicale, dans les microvillosités et au niveau des puits recouverts de clathrine (CCP), définis par leur forme et leur taille distinctes (Fig. 1f supplémentaire). Nous avons examiné la dynamique des CCP en utilisant la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)18,19. Le Bis-T-23, même à sa concentration la plus élevée, n'a eu aucun effet sur la répartition de la durée de vie des CCP, alors que le dynole a diminué le nombre de CCP productifs (Fig. 1g supplémentaire). Ce manque de corrélation entre le niveau d'endocytose et les altérations de la morphologie cellulaire affirme que Bis-T- 23 cible l'actine corticale sans influencer le rôle de la dynamine dans l'endocytose.
Étant donné que la polarité des cellules rénales est maintenue par l'architecture et la contraction soutenue des réseaux d'actomyosine, qui établissent la rigidité cellulaire au niveau de la membrane apicale 20, nous avons ensuite mesuré la rigidité cellulaire par microscopie à force atomique (AFM). Le système Nanowizard IV et le logiciel d'analyse JPK ont été utilisés pour déterminer les modifications du module de Young21 dans différents contextes expérimentaux (Fig. 2a supplémentaire). Le traitement par LatA a entraîné une diminution significative de la rigidité du contact cellule-cellule et de la rigidité des cellules apicales dans les cellules MDCK (Fig. 1c – e). En revanche, Bis-T-23 a significativement augmenté la rigidité cellulaire par rapport au véhicule DMSO (Fig. 1c – e), ce qui est cohérent avec ses effets positifs sur la hauteur des cellules, le nombre de microvillosités et la densité des réseaux d'actine (Tableaux 1 et Figure 1b)22. L'ajout de Bis-T-23 avant LatA a fortement réduit l'effet négatif de LatA sur la rigidité cellulaire (Fig. 1c – e), conformément à l'effet positif de Bis-T-23 sur les réseaux d'actine. et morphologie des cellules apicales (Tableau 1, Fig. 1b).
Fig. 1 L'oligomérisation de la dynamine définit la rigidité cellulaire en influençant l'architecture de l'actine dans les cellules épithéliales rénales. a Images SEM représentatives de cellules MDCK traitées avec du DMSO (0,1 %) ou du Bis-T-23 (30 µM, 0,1 % DMSO) pendant 1 0 min avant l'ajout de DMSO (0,1 %) ou de LatA (0,2 µM, 0,1 % de DMSO) pendant 2{{23} } minutes. Des images agrandies des encarts (régions encadrées en orange) montrent la disposition, la distribution et la densité des microvillosités au niveau de la membrane apicale. b Images PR-EM représentatives de cellules MDCK traitées comme expliqué en (a). Les images montrent des changements dans l’organisation du cortex d’actomyosine dans les cellules MDCK dans les conditions indiquées. c Images représentatives des cartes du module de Young des cellules MDCK traitées comme expliqué en (a). d, e Graphiques à barres représentant le module de Young illustrant la rigidité cellulaire mesurée à la jonction cellule-cellule (d) ou à la membrane apicale (e). Chaque symbole représente la rigidité moyenne d'une seule cellule. Les résultats indiqués en d, e ont été générés à partir d'au moins 10 cellules provenant d'au moins trois boîtes de culture. Barres d'erreur, moyenne ± SD (*P inférieur ou égal à 0,05, **P inférieur ou égal à 0,01, ***P inférieur ou égal à 0,001, ****P inférieur ou égal à 0,0001, non appariées test t bilatéral). ns, non significatif.
Nous avons également déterminé la rigidité cellulaire en utilisant le système BioScope II comme approche expérimentale alternative pour l'AFM. Dans ce cas, les courbes d'indentation de force ont été obtenues selon le modèle de Discher et ses collègues calculé avec le logiciel Matlab23. Des tendances similaires en ce qui concerne la rigidité cellulaire ont été enregistrées pour l'interaction entre LatA et Bis-T -23 (Fig. Supplémentaire 2b, 2c). De plus, la dynode n'a présenté aucun effet sur la rigidité cellulaire, alors que CytoD a significativement diminué la rigidité cellulaire (Fig. 2d, e supplémentaire), conformément à leurs phénotypes d'actine (Fig. 1a supplémentaire). Ensemble, ces données établissent la corrélation entre l'état du cortex d'actomyosine, la rigidité cellulaire, la morphologie de la membrane apicale et la polarité cellulaire. Ces résultats démontrent également de manière convaincante le rôle de l'oligomérisation de la dynamine dans la définition des paramètres mécaniques de la polarité des cellules épithéliales via son effet sur le cortex d'actomyosine.
La dynamine réticule les filaments d'actine en réseaux ramifiés qui sont à la base de la polarité cellulaire. Afin d'élucider le mécanisme moléculaire par lequel l'oligomérisation de la dynamine influence l'architecture du cortex d'actomyosine, nous avons ensuite examiné l'effet de la dynamine sur les filaments d'actine dans un système reconstitué. Selon l'hypothèse actuelle, la longueur des filaments d'actine définit leur mode de réticulation6. Comme la longueur moyenne des filaments d'actine corticaux au sein d'un réseau au bord d'attaque est comprise entre 100 et 150 nm24, nous avons examiné les effets de la dynamine sur l'organisation des filaments plus courts générés en coiffant la F-actine avec de la gelsoline (Gsn-actine) (Fig. 2a). L'ajout de Dyn2 a entraîné la formation de grands réseaux ramifiés (Fig. 2b, c). Sur la base des tailles et des formes du Dyn2 recombinant (Fig. 2d), les réseaux étaient formés principalement de dimères Dyn2 (Dyn2DIMER) et de tétramères (Dyn2TETRA) qui interagissaient avec plusieurs filaments d'actine (Fig. 2e): Dyn2DIMER lié à deux filaments, Dyn2TETRA liait jusqu'à quatre filaments et Dyn2RING jusqu'à six filaments. Un faible grossissement des images a révélé que les réseaux dépendants de la dynamine forment un motif de formes annulaires plus petites et plus grandes (Fig. 2c).
Pour corréler les observations du système reconstitué avec le rôle de la dynamine dans les cellules, nous avons ensuite déterminé la localisation de Dyn2 endogène sur les réseaux d'actine corticaux en utilisant un anticorps monoclonal anti-Dyn2 suivi d'un anticorps secondaire conjugué à l'or (Fig. 3a – c supplémentaire). Comme le montre le système reconstitué, la dynamine est associée à un nombre distinct de F-actine au sein de réseaux ramifiés (Fig. 2f). Ensemble, ces données identifient une nouvelle activité de la dynamine, à savoir la réticulation de la F-actine dans des réseaux ramifiés.
Pour corréler la capacité de réticulation de la dynamine et l'effet protecteur du Bis-T-23 sur le cortex d'actomyosine et la morphologie de la membrane apicale, nous avons ensuite examiné les effets du Bis-T-23 sur les effets médiés par la dynamine. réseaux dans des systèmes reconstitués (Fig. 3a). Sur la base de tracés de contour fournissant des représentations topographiques de différentes densités de filaments, Bis T -23 a augmenté la densité globale du réseau (Fig. 3a), ce qui pourrait s'expliquer par l'augmentation du nombre de F-actine liée à la dynamine en raison de l'augmentation de son oligomérisation. De plus, la dynamine a réticulé plus puissamment les filaments courts que la longue F-actine (Fig. 3a – c), ce qui suggère que la capacité de la dynamine à former des réseaux ramifiés est définie par son statut d'oligomérisation et la longueur des filaments d'actine. La capacité de réticuler les filaments d'actine en réseaux était partagée par deux isoformes de dynamine, Dyn2 exprimée de manière omniprésente et la dynamine spécifique des neurones -1 (Dyn1) (Fig. 3b, c).
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