Abstrait
Contexte L'AKI est une séquelle courante de l'infection par le SRAS-CoV-2 et contribue à la gravité et à la mortalité du COVID-19. Ici, nous avons testé l'hypothèse selon laquellealtérations rénalesinduite par l’AKI associée au COVID-19 a pu être détectée dans les cellules collectées dans l’urine. Méthodes Nous avons effectué le séquençage de l'ARN unicellulaire (scRNAseq) sur des cellules récupérées dans l'urine de huit patients hospitalisés atteints de COVID-19 avec (n55) ou sans AKI (n53) ainsi que de quatre patients atteints d'AKI non-COVID-19. (n54) pour évaluer les différences de composition cellulaire et d'expression génique au cours de l'AKI. Résultats L'analyse de 30 076 cellules a révélé un large éventail de types de cellules, dont la plupart étaientrein, urothéliales et immunitaires. L'analyse des voies des cellules tubulaires de patients atteints d'AKI a montré un enrichissement des transcriptions associées aux voies liées aux dommages par rapport à celles sans AKI. L'expression d'ACE2 et de TMPRSS2 était la plus élevée dans les cellules urothéliales parmi les types de cellules récupérés. Notamment, chez un patient, nous avons détecté l’ARN viral du SRAS-CoV-2 dans les cellules urothéliales. Ces mêmes cellules ont été enrichies en transcrits associés aux voies antivirales et anti-inflammatoires. Conclusions Nous avons réalisé avec succès scRNAseq sur des sédiments urinaires de patients hospitalisés atteints de COVID-19 pour étudier de manière non invasive les altérations cellulaires associées à l'AKI et avons établi un ensemble de données comprenant à la fois des cellules rénales blessées et non blessées. De plus, nous fournissons des preuves préliminaires d'une infection directe des cellules de la vessie par le SRAS-CoV-2. Le sédiment urinaire contient une richesse d'informations et constitue une ressource utile pour étudier la physiopathologie et les altérations cellulaires qui se produisent dansmaladies rénales.
ALIMENTS BIOLOGIQUES POUR LA SANTÉ DES REINS
Introduction
L'infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) déclenche une pathologie dans plusieurs systèmes, y compris le rein, et l'IRA est associée à une morbidité et une mortalité importantes dans la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) (1 –5). Plusieurs études ont démontré des taux élevés d'IRA chez les patients hospitalisés atteints de COVID-19 (6), certaines signalant que jusqu'à 50 % des personnes infectées développent une IRA (7–9). Le principal récepteur ACE2 du SRAS-CoV-2 est exprimé sur les cellules épithéliales de tout le système urinaire, y compris les cellules des tubules proximaux et les cellules urothéliales (10-13), bien qu'il ne soit pas clair si l'AKI chez les patients atteints de COVID-19 est dû à une infection virale directe des tubules proximaux ou est le résultat de la réponse systémique au SRAS-CoV-2 (14-22). De même, on ne sait pas si le SRAS-CoV-2 peut provoquer une cystite virale via une infection directe des cellules urothéliales, bien que cette possibilité ait été proposée (23-26). Malgré la forte prévalence de l’AKI associée au COVID-19, les altérations cellulaires sous-jacentes qui se produisent dans le cadre de l’AKI restent mal comprises.
L’AKI associée au COVID-19 est restée largement sous-étudiée car l’accès au tissu rénal nécessite une biopsie ou une analyse post-mortem (27). Des études récentes ont détecté un large éventail de cellules rénales, vésicales et immunitaires dans l’urine (28-30). Ainsi, l’urine peut offrir des informations précieuses dans l’étude non invasive des modifications rénales au cours de l’AKI associée au COVID-19. Ici, nous avons effectué le séquençage de l'ARN unicellulaire (RNA-Seq) pour caractériser la diversité cellulaire dans l'urine des patients hospitalisés atteints de COVID-19 avec et sans AKI. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle des altérations rénales de l’AKI associée au COVID-19 pourraient être détectées dans les cellules collectées dans l’urine. Nous avons également collecté des échantillons de patients sans COVID-19 et avec AKI (AKI non-COVID-19). Nous avons trouvé plusieurs populations de cellules immunitaires inflammatoires et des voies activées différentiellement dans l'AKI associée au COVID-19, ainsi que des preuves préliminairespour l'infection directe des cellules urothéliales par le SRAS-CoV-2.
Matériels et méthodes
Participants et variables Des adultes âgés de 18 ans et plus ont été dépistés lors de leur admission ou de leur transfert à l'hôpital de l'Université d'Alabama à Birmingham (UAB) entre mars et mai 2021. Les cas d'IRA ont été identifiés à l'aide duMaladie du reinAmélioration de la définition des résultats globaux comme une augmentation de la créatinine sérique (sCr) .0,3 mg/dl dans les 48 heures ou 0,1,53 créatinine de base. Les contrôles sans changement de créatinine ont été sélectionnés en fonction de l'appariement de l'âge et du sexe lorsque cela était possible et traités avec chaque échantillon AKI respectif. La sCr de base a été déterminée à l'aide de la valeur sCr la plus récente, 7 à 365 jours avant l'hospitalisation. Des données cliniques supplémentaires concernant les données démographiques, les antécédents médicaux, les caractéristiques cliniques et les valeurs de laboratoire ont été extraites des dossiers des patients par l'intermédiaire de l'équipe i2b2 du Centre UAB pour les sciences cliniques et translationnelles. Huit patients hospitalisés atteints de COVID-19, cinq avec AKI et trois sans AKI, ont été inclus. Cette étude et la collection d'échantillons ont été approuvées par le comité d'examen institutionnel de l'UAB. L'équipe de consultation en néphrologie aiguë de l'UAB a également collecté des échantillons de patients atteints d'AKI non-COVID-19 (n54) pour comparer les changements cellulaires avec l'AKI associé au COVID-19. Ceux-ci ont été collectés dans le cadre d'un protocole de comité d'examen institutionnel différent qui permet la collecte d'échantillons d'urine restants et est donc anonyme.
Collecte et traitement des échantillons
Toutes les étapes ont été réalisées sur glace. L'urine a été collectée soit sous forme d'échantillon vidé, soit à partir d'un cathéter urinaire. Les échantillons ont été immédiatement transférés à un laboratoire de niveau de biosécurité 21 pour traitement. Les échantillons d'urine ont été transférés dans un tube conique de 50- ml et centrifugés à 10 003 g pendant 10 minutes à 4 °C. Les culots cellulaires ont été lavés avec du PBS glacé, filtrés à travers un filtre de 40- mm et centrifugés à nouveau. Les cellules vivantes ont été purifiées à l'aide du kit d'élimination des débris MACS (Miltenyi Biotec) suivi du kit d'élimination des cellules mortes EasySep Annexin V (StemCell). En bref, les cellules ont été remises en suspension dans du PBS glacé et mélangées à une solution d'élimination des débris. Du PBS froid a été superposé sur le mélange et centrifugé à 3 003 g pendant 10 minutes à 4 ° C. Les deux phases supérieures ont été aspirées, puis les cellules restantes ont été lavées avec du PBS. Les cellules ont été remises en suspension et mélangées avec un cocktail d'élimination des cellules mortes, un cocktail de sélection de biotine, puis des RapidSpheres avant la séparation dans un aimant EasySep. Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans 52 ml de PBS (sans calcium ni magnésium) à 10,04 % de BSA (Fisher Scientific) pour le traitement scRNAseq.
séquençage de l’ARNsc
Les cellules purifiées ont été transférées vers la cytométrie en flux UAB et le noyau de cellule unique et immédiatement traitées à l'aide du kit de séquençage d'ARN monocellulaire Chromium 39 (103Génomique) selon le fabricant'les instructions.La suspension cellulaire a été comptée, combinée aux 103 Mélange de réactifs au chrome, et chargé dans un microFluidiquedispositif de partitionnement unicellulaire dans lequel lyse et inversionla transcription se produit dans des microgouttelettes. L'ADNc résultantétait ampliFied par PCR et ensuite traité pour donner
bibliothèques de séquençage de codes à barres. Le séquençage par paires a été réalisé sur la plateforme de séquençage Illumina NovaSeq6000 ou NextSeq500 (Illumina). Les lectures ont été traitéesen utilisant le 103 Logiciel unicellulaire Genomics Cell RangerSuite version 6.0 sur l'UAB Cheaha High-PerformanceCluster informatique. BCLFiles fichiers ont été convertis en FASTQFifichiers utilisant la fonction rapide CellRanger. CellRangerfast a été utilisé pour aligner FASTQFiles vers un génome personnaliséconstitué du génome humain hg38 (GRCh38.p13) avec
le génome du SRAS-CoV-2 (NC_045512.2) inséré sous forme d'exon (31). La table des gènes, la table des codes-barres et les matrices d'expression transcriptionnelle ont été créées pour l'analyseindiqué ci-dessous.
Analyses de données
Les analyses ont été réalisées à l'aide de packages créés pour l'environnement d'analyse statistique R (version 4.06). Les données ont été principalement analysées dans la version 3.2.3 de Seurat (32,33) et sondépendances associées. Données de chaque patientont été importés à l'aide de Read103 fonction puis structuréintégré dans un objet Seurat à l'aide de CreateSeuratObject. Pourcontrôle de qualité, les cellules avec des caractéristiques uniques comptent plus de 2500ou moins de 200 et les cellules avec des proportions mitochondriales de.15% étaientFifiltré. Les données ont été normalisées à l'aide de LogNormaliser et mettre à l'échelle pour se préparer aux dimensions linéairesréduction. Les objets de patients individuels ont été étiquetésavec une identité de groupe uniqueFications puis fusionnés en unobjet unique à l'aide de la fonction de fusion Seurat. Sam le patientles éléments ont été intégrés à la fonction RunHarmony en utilisantle pack Harmony R (34). Analyse en composantes principalesa été réalisée, puis les cellules ont été regroupées en fonction deexpression différentielle des gènes telle que déterminée par le SeuratFonction FindAllMarkers définie sur une résolution de un. Dimensionla réduction sionnelle a été réalisée à l'aide d'un collecteur uniformeapproximation et projection. Les types de cellules étaient identiFiéden comparant les transcriptions différentiellement exprimées pourchaque cluster avec des transcriptions connues associées à des espèces spécifiquesFic types de cellules (29,35,36). Le package Escape R a été utilisé pour exécuterAnalyse d'enrichissement des ensembles génétiques (GSEA) (37). WebGestaltRa été utilisé pour l'analyse de l'ontologie des gènes afin d'identifier les voiesen utilisant le processus biologique et l'Encyclopédie de KyotoBases de données sur les gènes et les génomes (38).
