La transcriptomique unicellulaire révèle des interactions cellule-cellule du filtre rénal perturbées après une lésion précoce et sélective des podocytes Ⅱ

Résultats

Single-Cell Profiling of >29,000 cellules rénales enrichies en glomérules

Protocoles unicellulaires actuels pourrein entier identifier<2.5% glomerular cells,9 and although a purifiedpréparation glomérulairel’utilisation de billes magnétiques enrichit cette population22, mais ne parvient pas à capturer d’autres types de cellules rénales susceptibles de présenter un intérêt. Une méthode de tamisage a été utilisée pour enrichir simultanément les glomérules et capturertypes de cellules rénales supplémentairesétendre ces découvertes et développer une compréhension détaillée des interactions cellule-cellule au sein du glomérule dans le contexte de l'ensemble du paysage cellulaire du rein, avant et aprèslésion podocytaire.

Identifier les premiers effets transcriptionnels de l’ablation des podocytes dans une cellulemanière spécifique au type, scRNAseq a été réalisé avec du tissu rénal de souris WT et iCTCFpod/collecté par tamisage en série après 1 semaine de traitement à la doxycycline (Figure 1A). Le tissu rénal de quatre animaux WT (quatre répétitions biologiques) et de quatre animaux/iCTCFpod a donné un total de 14 783 WT et 14 727 iCTCFpod/cellules profilées après filtrage (Figures supplémentaires S1, A et B ; Tableaux supplémentaires S1 et S2). Les données ont été normalisées pour supprimer les effets dus au nombre d'UMI et au pourcentage de lectures mitochondriales. Après intégration de WT et iCTCFpod/échantillons, une faible résolution de clustering a été utilisée pour détecter neuf clusters (Figure 1B). Les répliques biologiques de WT et d'iCTCFpod/échantillons ont été réparties entre toutes les grappes (Figure supplémentaire S2, AC). Tous les types de cellules du glomérule, ainsi que d'autres types de cellules rénales, ont été identifiés à l'aide de marqueurs établis et dérivés de données (Figure 1C ; Tableau supplémentaire S3 ; Figure supplémentaire S3A). Les cellules glomérulaires, représentant un total de 82,1 % de toutes les cellules récupérées [36,9 % de podocytes, 42,1 % de cellules endothéliales glomérulaires (GEC), 2,7 % de cellules mésangiales et 0,36 % de PEC] ont été isolées et regroupées (Figure 1D). . Quatre groupes de podocytes, cinq groupes de GEC et un groupe de cellules mésangiales et de PEC, exprimant le canoniquemarqueurs de type cellulaire, ont été identifiés (Figure 1E; Figure supplémentaire S3B). Des répliques biologiques de WT et d'iCTCFpod/échantillons ont été distribuées dans toutes les grappes (Figure supplémentaire S2, DF ; Tableau supplémentaire S4). Comme prévu, étant donné que la suppression du CTCF spécifique aux podocytes entraîne une perte de podocytes détectable histologiquement au bout de 2 semaines, 13 iCTCFpod/échantillons contenaient un pourcentage de podocytes inférieur à celui des échantillons WT (Figure 1F ; Tableau supplémentaire S5). Les échantillons/iCTCFpod contenaient 13,1 % de podocytes en moins, 11,9 % de GEC en plus et 1,5 % de cellules mésangiales en plus que les échantillons WT (tableau supplémentaire S5). PEC contribués<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

pas exprimé de manière significativement différentielle. Leur axe a été limité à 100. La ligne pointillée indique les paramètres par défaut : cutoffP Z 0,25. C : Visualisation de l’analyse de la surreprésentation des gènes exprimés de manière différentielle unique dans le podocyte 1 présenté sous forme de réseau ou de carte d’enrichissement. Les ensembles de gènes qui se chevauchent se regroupent.

DE NOUVELLES HERBES POUR LA SANTÉ DES REINS

La suppression inductible du CTCF spécifique aux podocytes entraîne des modifications de l'expression génique dans tous les types de cellules glomérulaires

Une analyse d'expression différentielle a été réalisée dans chacun des 11 groupes comparant les cellules iCTCFpod / et WT (tableau supplémentaire S6). Les gènes ont été considérés comme exprimés différentiellement s'ils étaient trouvés dans au moins 10 % des cellules d'un cluster donné, avec un changement de logarithme absolu minimum de 0,1 et un P ajusté < 0 .05. Ctcf était exprimé de manière différentielle dans chacun des quatre groupes de podocytes, avec des changements logarithmiques moyens de 0,390, 0,189, 0,331 et 0,303, respectivement. Le nombre de cellules dans chaque groupe a été sous-échantillonné et l'analyse de l'expression différentielle a été répétée pour comparer le nombre de gènes différentiellement exprimés parmi les 11 groupes. Les clusters de podocytes avaient les gènes exprimés les plus différentiellement, suivis de GEC-1 et GEC-2 (Figure 1G). Les trois groupes restants de GEC, ainsi que les cellules mésangiales et les PEC, avaient beaucoup moins de gènes exprimés différentiellement (Figure 1G), ce qui suggère que GEC-1 et GEC-2, parmi tous les groupes glomérulaires, étaient les plus affectés. par les séquelles d'une lésion des podocytes provoquée par la suppression du CTCF.

Programmes génétiques associés à des maladies identifiés dans des grappes spécifiques de podocytes et de cellules endothéliales

Cette étude a d'abord cherché à examiner comment les groupes de podocytes individuels réagissent à une blessure. Un diagramme de Venn des gènes exprimés différentiellement dans chacun des quatre groupes de podocytes a révélé que le podocyte 1 possédait les gènes exprimés de manière différentielle la plus unique parmi les quatre groupes de podocytes (Figure 2A; Tableau supplémentaire S7). L'observation selon laquelle l'un des quatre groupes de podocytes était affecté de manière plus visible est en accord avec les données histologiques antérieures indiquant que tous les podocytes ne sont pas affectés avec la même gravité face à une blessure et met en évidence le pouvoir du scRNAseq à caractériser moléculairement l'hétérogénéité des états cellulaires au sein du même type de cellule.23 Une analyse de surreprésentation a été réalisée pour identifier les programmes de gènes enrichis à la suite de la perte de CTCF dans le groupe de podocytes 1 (tableau supplémentaire S8). Les termes les plus enrichis ont été visualisés avec une carte d’enrichissement pour regrouper des ensembles de gènes qui se chevauchent mutuellement (Figure 2B). Un groupe important de termes enrichis était les fonctions mitochondriales, notamment la synthèse de l'ATP, l'organisation mitochondriale, la chaîne de transport d'électrons et la phosphorylation oxydative (Figure 2B). Ces données prolongent les travaux récents indiquant un dysfonctionnement mitochondrial comme signe de lésion des podocytes.24 De plus, la génétique humaine a souligné l'importance des fonctions mitochondriales dans les podocytes, y compris plusieurs mutations dans la voie de biosynthèse de la CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, et ADCK4) qui provoquent le syndrome néphrotique, principalement chez les enfants.25,26 Il a donc été postulé que le dysfonctionnement mitochondrial des podocytes pourrait représenter un état cellulaire important associé à toutes les maladies résultant de la perte de podocytes.24 Les données soutiennent cette notion au niveau unique. -résolution cellulaire, suggérant que le dysfonctionnement mitochondrial pourrait représenter le premier état de lésion dans une population spécifique de podocytes, conduisant à une perte de podocytes. L’un des principaux groupes de termes enrichis issus de l’analyse de surreprésentation (Figure 2B) était l’organisation du cytosquelette ainsi qu’un seul terme enrichi associé pour l’adhésion cellule-matrice. Le cytosquelette d'actine joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure unique et complexe des podocytes, et l'adhésion au GBM est essentielle au fonctionnement des podocytes.27 Les adhérences focales matures contiennent des centaines de protéines qui relient le cytosquelette d'actine, la liaison à la matrice des récepteurs et la transduction du signal intracellulaire. , et la polymérisation de l'actine. L'un des gènes les plus régulés négativement dans le podocyte 1 était Rhpn1 (Figure supplémentaire S4A), un composant essentiel pour établir la dynamique du cytosquelette des podocytes et maintenir l'architecture des processus du pied des podocytes.28 Le composant complexe Arp2/3, Arpc3, un moteur de la polymérisation de l'actine, a été régulé positivement dans le cluster de podocytes 1 (Figure 2C; Figure supplémentaire S4B). Un gène pour un composant supplémentaire du complexe, Actr2, a également été régulé positivement dans les podocytes 1 et 4. De plus, Wasl, dont le produit protéique, N-WASP, active le complexe Arp2/3 et est nécessaire à la maintenance. des processus du pied podocytaire in vivo29, était également régulée positivement dans le podocyte 1, le podocyte 3 et le podocyte 4. Le régulateur du cytosquelette Arhgdia, dont la délétion est associée au syndrome néphrotique chez la souris,30 était régulé négativement dans le podocyte 1 (Figure 2C). Les niveaux d'expression de deux Rho GTPases qui sont des régulateurs bien établis du cytosquelette d'actine et de la dynamique d'adhésion cellulaire31 ont également été modifiés : RhoA était régulée positivement et RhoC était régulée négativement, tout comme un effecteur central en aval de Rac1, Pak1, conformément à une étude antérieure.23 De plus, Cd2ap, un composant essentiel du cytosquelette d'actine des podocytes,27,32 a été régulé positivement dans le podocyte 1. Ensemble, ces changements suggèrent que l'une des premières réponses des podocytes à une lésion provoquée par la délétion du CTCF consiste à modifier des composants critiques du le cytosquelette d'actine dans une lutte pour maintenir l'attachement au GBM et ainsi survivre à la blessure. De plus, scRNAseq a identifié des médiateurs spécifiques de cette réponse correspondant à une population spécifique de podocytes, indiquant des cibles putatives pour une intervention thérapeutique précoce.

Le GBM est un réseau de protéines de la matrice extracellulaire située entre les podocytes et les GEC qui fournit un support structurel aux capillaires glomérulaires, héberge des ligands pour les récepteurs à la surface des GEC, podocytes et cellules mésangiales adjacents et contribue à la sélectivité du filtre glomérulaire.33 L’un des composants critiques du GBM est le collagène de type IV ɑ5 (Col4a5) ; les mutations de ce gène provoquent le syndrome d'Alport et le FSGS chez l'homme.33,34 Des variantes de Col4a3, un autre composant structurel du GBM, ont été récemment identifiées par une étude d'association complète à l'échelle du génome du DKD.35 Par conséquent, les modifications des composants du GBM en tant que Les conséquences des lésions des podocytes sont largement pertinentes pour de nombreuses maladies rénales. On a demandé si l'expression des gènes codant pour les composants structurels du GBM était perturbée dans le modèle. Col4a5 a été régulé positivement dans les iCTCFpod / podocytes (avec un changement logarithmique de 0,130) (Figure supplémentaire S4C ; Tableau supplémentaire S6). L'analyse des récepteurs de ligands suggère que la régulation positive de Col4a5 dans le podocyte 1 entraîne une augmentation des interactions avec les cellules des cinq groupes GEC et les cellules mésangiales via plusieurs intégrines (Figure 3A). L'expression de Col4a5 dans les podocytes exprimant Nphs2- était significativement augmentée (P < 0,0001 ; test t bilatéral corrigé par Welch) (Figure 3B). La régulation positive de Col4a5 observée, avec résolution spatiale, a été validée par HCR, une méthode qui génère une fluorescence d'une seule molécule via une hybridation in situ (Figure 3C ; Figure supplémentaire S5). Ce résultat a confirmé que les données génétiques individuelles dérivées de l'expérience transcriptomique unicellulaire pouvaient être validées de manière indépendante, avec une résolution spatiale, renforçant ainsi la validité des conclusions tirées par les analyses informatiques. En outre, ces données soulignent que la réponse clé aux lésions d’une population spécifique de podocytes est de réguler positivement la production de collagène, ce qui peut expliquer le GBM proéminent ou épais observé dans les maladies évolutives, telles que la DKD.35

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 gènes exprimés de manière unique et différentielle (Figure supplémentaire S6A; Tableau supplémentaire S9). L'analyse de surreprésentation a indiqué que les gènes exprimés de manière différentielle unique dans GEC -1 étaient enrichis dans des programmes génétiques pour la migration et l'adhésion cellulaires (Figures supplémentaires S6, B et C ; Tableau supplémentaire S10). Ces analyses ont révélé les premiers changements transcriptionnels survenant dans les GEC en réponse à une lésion des podocytes.

La modélisation de la communication intercellulaire révèle

Interactions clés entre les types de cellules en réponse à une lésion précoce des podocytes

Après avoir identifié des programmes génétiques perturbés dans plusieurs groupes de cellules distincts, l’étude a ensuite cherché à comprendre comment la diaphonie cellule-cellule glomérulaire était influencée par les lésions des podocytes. L’étude a d’abord examiné la liste des gènes différentiellement exprimés dans les amas de cellules podocytaires, GEC et mésangiales. L'expression de deux ligands autocrines clés de prosurvie, Vegfa et Pdgfb, ainsi que l'expression du récepteur PDGFB, Pdgfrb, ont été perturbées (tableau supplémentaire S6). L'expression de Vegfa a été diminuée dans tous les clusters de podocytes (changement moyen du pli du journal entre 0.034 et 0.149). En revanche, l'expression de Pdgfb a augmenté dans tous les clusters GEC (changement logarithmique moyen entre 0,031 et 0,140), et le récepteur Pdgfrb a été régulé positivement dans les cellules mésangiales (changement logarithmique moyen de 0,155). Cette analyse suggère que les lésions des podocytes entraînent une diminution de l'expression du ligand de prosurvie Vegfa, affectant négativement les GEC. Pour compenser, les GEC peuvent réguler positivement le ligand prosurvie Pdgfb, incitant les cellules mésangiales à réguler positivement le récepteur Pdgfrb.

NicheNet, un nouvel algorithme qui déduit comment les interactions ligand-récepteur dérivées des données d'expression peuvent affecter des cibles spécifiques en intégrant des connaissances préexistantes sur les réseaux de signalisation et de régulation, a été utilisé pour étudier plus en profondeur les interactions ligand-récepteur et leurs gènes cibles putatifs.20 NicheNet a été appliqué à modéliser les interactions entre les podocytes et les GEC ainsi que les cellules mésaniales et les GEC qui pourraient potentiellement induire des gènes exprimés de manière différentielle (gènes cibles) dans les GEC dans le cadre d'une lésion des podocytes (Figure 4A). Pour cette analyse, tous les clusters de chaque type cellulaire ont été combinés en un seul cluster. Les principaux ligands prédits exprimés par les cellules mésangiales et/ou les podocytes étaient la pléiotrophine (Ptn), l'angiopoïétine 2 (Angpt2), Col4a1, la molécule d'adhésion des cellules vasculaires 1, la protéine morphogénétique osseuse 4 (Bmp4), l'éphrine B1, le facteur de croissance du tissu conjonctif et le sémaphoring. 3e (Sema3e) (Figure 4B). Le modèle d'expression des récepteurs GEC par lesquels ces ligands sont connus pour agir a été cartographié à côté de l'analyse de l'activité du ligand. De plus, les gènes cibles prédits qui étaient différentiellement exprimés dans les iCTCFpod / GEC par rapport aux contrôles WT ont également été cartographiés. Les résultats de la figure 4B sont résumés sous forme de tracés circulaires sur les figures 4, C et D.

Plusieurs ligands, récepteurs et gènes cibles ressortaient de cette analyse. La pléiotrophine, un ligand fortement exprimé dans les cellules mésangiales (Figure 4B), est un facteur de croissance sécrété qui peut se lier et inhiber le récepteur de la protéine tyrosine phosphatase de type B, stimulant ainsi la migration des cellules endothéliales via une augmentation de Tek (Tie2)/Angpt137 et Kdr (Vegfr2)/Vegfa38. signalisation. En conséquence, Tek était considérablement régulé positivement dans les GEC (Figure 4B). Angpt2, fortement exprimé dans les cellules mésangiales, est un ligand antagoniste de Tek, inhibant la liaison d'Angpt1.39 Parce que la signalisation Angpt1 est connue pour favoriser la survie des podocytes et qu'une perturbation du rapport Angpt1/Angpt2 contribue au développement de DKD,40 ce ligand L'analyse des récepteurs a semblé indiquer une signalisation Tek inadaptée dans les GEC comme l'une des premières conséquences d'une lésion des podocytes.

Cette étude a également révélé des changements importants dans l'expression du collagène de type IV dans plusieurs cellules glomérulaires (Figure 4B). Normalement produits par des podocytes sains, les het erotrimers de collagène IV passent de ɑ1ɑ1ɑ2 à ɑ3ɑ4ɑ5 au cours du développement glomérulaire, ce qui est nécessaire à la formation et au bon fonctionnement du GBM.33 ,34 Une régulation positive de Col4a1, ainsi qu'une expansion de la matrice mésangiale, sont fréquemment observées dans DKD.41,42 Dans l'analyse actuelle, Col4a1 a été exprimée à la fois par les cellules mésangiales et les GEC (expression moyenne de la carte thermique du ligand) (Figure 4B). et a été spécifiquement régulé positivement dans les iCTCFpod / GEC par rapport aux contrôles WT. Ces données suggèrent que les GEC régulent positivement Col4a1 dans le cadre d'une lésion des podocytes, ce qui peut conduire à un GBM fibreux plus rigide qui contribue au développement de la sclérose segmentaire.33

Bmp4 était un ligand mésangial hautement exprimé identifié par analyse NicheNet (Figure 4, BD). Les BMP jouent un rôle clé dans le développement et la maladie des reins.43 Bmp4 est régulée positivement dans le contexte de la néphropathie diabétique chez le rat,42 ettraitement des souris avec diabèteavec un anticorps anti-BMP4 empêche la régulation positive de Col4a1 et l'expansion de la matrice mésangiale.44 D'un intérêt particulier, il a été constaté que Bmp4 mésangial déclenche l'expression de GEC Smad6 (Figure 4B). L'expression de Smad6 est induite par les BMP et dans une boucle de rétroaction négative, Smad6 inhibe spécifiquement les BMP, y compris la BMP4.45. Smad6 était régulée négativement dans les iCTCFpod / GEC par rapport aux contrôles WT, suggérant une augmentation de la signalisation des BMP dans les cellules endothéliales dans le cadre d'une lésion des podocytes. .

L'un des ligands prioritaires identifiés dans les podocytes était Sema3e (Figure 4, BD). Les sémaphorines de classe 3 sont des protéines sécrétées qui fonctionnent dans divers processus biologiques, notamment l'angiogenèse, la lymphangiogenèse et la maladie.46 Sema3a est régulée positivement dans la DKD humaine47, et Sema3g a été récemment identifié comme un gène spécifique aux podocytes qui protège les podocytes de l'inflammation. in vivo. 48 Le rôle de Sema3e dans le podocyte reste flou. L'analyse actuelle a révélé une paire récepteur-ligand jusqu'alors non reconnue par laquelle le podocyte Sema3e interagit avec la plexineD1 sur les GEC pour déclencher plusieurs cibles génétiques en aval dans leréglage d'une lésion podocytaire(Figure 4, C et D).

Parmi plusieurs gènes cibles GEC nouvellement identifiés, Hes1 et Cx3cl1 ont également été trouvés dans les programmes de gènes d'adhésion enrichis en GEC-1 (Figure 4, BD ; Figure supplémentaire S6). Hes1 est une cible de la signalisation Notch, qui joue un rôle important dans le développement du rein, mais sa réactivation peut conduire à une fibrose.49 Cx3cl1 est une chimiokine principalement produite par l'endothélium glomérulaire qui agit comme une molécule chimioattractive et d'adhésion pour son récepteur, Cx3cr1, qui est exprimé de manière omniprésente sur les leucocytes lymphatiques mononucléaires et circulatoires.50 Cx3cl1 a été impliqué dans diverses maladies rénales, notamment la DKD, la néphropathie à IgA et la glomérulonéphrite.50 Hes1 et Cx3cl1 étaient tous deux régulés positivement dans les iCTCFpod / GEC par rapport aux contrôles WT, ce qui suggère que les GEC répondent aux lésions des podocytes en régulant positivement les programmes pro-inflammatoires et profibrose.

Enfin, étant donné que de nombreux ligands et cibles identifiés dans l’analyse NicheNet sont impliqués dans la DKD, tant chez les rongeurs que chez les humains, l’ensemble de données a été comparé à un ensemble de données transcriptomiques à noyau unique des premières DKD humaines.10 Un modèle spécifique une comparaison a été faite de gènes différentiellement exprimés entre des groupes de cellules humaines et de souris. Sur les 138 gènes exprimés différentiellement dans les GEC DKD humaines, 25 gènes ont également été identifiés dans les cellules iCTCFpod / endothéliales de souris, y compris Col4a1 (Figure supplémentaire S7; Tableau supplémentaire S11). Ensemble, ces résultats suggèrent que les programmes de cellules endothéliales fréquemment perturbés dans la DKD humaine peuvent être partiellement récapitulés dans le modèle murin de lésion glomérulaire précoce via l'ablation sélective des podocytes. En outre, ces résultats suggèrent qu'en plus des podocytes, il pourrait exister des cibles spécifiques endothéliales et des stratégies thérapeutiques potentielles pour arrêter ou ralentir la progression de maladies rénales complexes et très répandues, telles que la DKD.