Le site de vulnérabilité du SRAS-CoV-2 induit un anticorps largement protecteur contre les sous-variantes antigéniquement distinctes d'Omicron

L’évolution rapide des variantes Omicron du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a souligné la nécessité d’identifier des anticorps dotés de larges capacités neutralisantes pour éclairer les futures thérapies monoclonales et stratégies de vaccination. Ici, nous avons identifié S728-1157, un anticorps largement neutralisant (bnAb) ciblant le site de liaison au récepteur (RBS) dérivé d'un individu précédemment infecté par le WT SARS-CoV-2 avant la propagation de variantes préoccupantes (COV). S728-1157 a démontré une large neutralisation croisée de toutes les variantes dominantes, notamment D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu et Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). De plus, S728-1157 protégeait les hamsters contre les défis in vivo avec les virus WT, Delta et BA.1. L'analyse structurale a montré que cet anticorps cible un épitope de classe 1/RBS-A dans le domaine de liaison du récepteur via de multiples interactions hydrophobes et polaires avec sa région 3 déterminant la complémentarité des chaînes lourdes (CDR-H3), en plus des motifs communs dans CDR-H1/ Anticorps CDR-H2 de classe 1/RBS-A. D'une manière primordiale, cet épitope était plus facilement accessible dans l'état ouvert et de préfusion, ou dans les constructions de pointe stabilisées par l'hexaproline (6P), par rapport aux constructions de diproline (2P). Dans l’ensemble, S728-1157 démontre un large potentiel thérapeutique et pourrait éclairer la conception de vaccins ciblés contre les futures variantes du SRAS-CoV-2.

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Introduction

Depuis le début de la pandémie en décembre 2019, le virus du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) a entraîné plus de 660 millions de cas de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) et plus de 6,5 millions de morts dans le monde. Bien que le développement et la distribution rapides de vaccins et de traitements aient dans une large mesure freiné l'effet du COVID-19, l'émergence de variants préoccupants (COV) en circulation continue de représenter une menace majeure en raison du potentiel d'évasion immunitaire supplémentaire. et une pathogénicité accrue. La variante D614G a été la première variante à émerger et est devenue universellement répandue par la suite. Par rapport au WT, le variant D614G présentait une transmissibilité accrue plutôt qu’une pathogénicité accrue et il était donc peu probable qu’il réduise l’efficacité des vaccins dans les essais cliniques (1). Entre l’émergence du D614G et octobre 2021, quatre autres COV importants ont évolué dans le monde, notamment Alpha, Beta, Gamma et Delta. Parmi ces variantes, Delta est devenue une menace mondiale sérieuse en raison de sa transmissibilité, de la gravité accrue de sa maladie et de son évasion immunitaire partielle, comme le montre la capacité réduite du sérum polyclonal et des mAb à neutraliser cette souche (2-6). Peu de temps après, en novembre 2021, la variante Omicron a été identifiée et annoncée comme un nouveau COV. Cette variante possédait le plus grand nombre de mutations à ce jour et semblait se propager plus rapidement que les souches précédentes (7, 8). Actuellement, il existe un large éventail de sous-lignées Omicron conduisant à de nouveaux cas de COVID-19, BQ.1, BQ.1.1 et XBB.1.5 devenant dominants sur BA.5 et représentant la plupart des nouveaux cas dans le monde à l'époque. De l'écriture. Les variantes d'Omicron peuvent échapper à la reconnaissance par l'immunité associée au vaccin COVID-19 à des degrés divers, réduisant ainsi considérablement le pouvoir neutralisant des anticorps sériques des individus convalescents entièrement vaccinés par ARNm et des individus boostés avec le nouveau bivalent WT/BA.5. Vaccin à ARNm (9, 10). De même, les variantes d’Omicron ont pu échapper à la liaison de plusieurs mAb thérapeutiques avec autorisation d’utilisation d’urgence (EUA), même s’il avait déjà été démontré que ceux-ci étaient efficaces contre les COV antérieurs (10-12). En raison de la neutralisation réduite contre Omicron et de la menace persistante de futurs COV, il existe un besoin urgent d'identifier des anticorps neutralisants larges et puissants qui peuvent protéger contre diverses lignées évolutives du SRAS-CoV-2. Dans cette étude, nous avons identifié un puissant mAb réactif au domaine de liaison au récepteur (RBD-réactif) provenant du sang périphérique d'un individu convalescent du SRAS-CoV-2 qui a efficacement neutralisé Alpha, Beta, Kappa, Delta, Mu, et variantes Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 et XBB). Ce mAb, S728-1157, a réduit de manière significative les charges virales BA.1 Omicron, Delta et WT dans les poumons et la muqueuse nasale après une provocation in vivo chez des hamsters. S728-1157 se lie au site de liaison au récepteur (RBS) qui est entièrement exposé lorsque le RBD sur la pointe est en conformation ascendante. Le mAb utilise des motifs trouvés dans CDR-H1 et CDR-H2 qui sont communs aux anticorps IGHV3-53/3-66 classe 1/RBS-A (13, 14), mais également grâce à des contacts uniques et étendus avec CDR. -H3 pour contourner les mutations dans les pics de COV. Cela suggère que la conception rationnelle des futurs rappels de vaccins couvrant les variantes d’Omicron devrait être modifiée pour présenter un pic stabilisé dans la configuration principalement élevée afin d’induire de manière optimale des mAb de classe 1/RBS-A présentant des caractéristiques CDR-H3 similaires.

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Résultats

Isolement des mAb réactifs au RBD qui présentent divers modèles de neutralisation et de puissance. Avant la propagation des lignées Omicron, nous avions précédemment caractérisé 43 mAb ciblant des épitopes distincts sur la protéine de pointe, notamment le domaine N-terminal (NTD), le RBD et la sous-unité 2 (S2). Aucun de ces anticorps n’a pu neutraliser les variantes du SRAS-CoV-2 qui circulaient à cette époque (15). Dans cette étude, un panel supplémentaire d'AcM réactifs au RBD a été exprimé chez 3 individus hautement répondeurs qui ont développé des réponses IgG anti-pic robustes, comme défini précédemment (16) (Tableaux supplémentaires 1 et 3 ; matériel supplémentaire disponible en ligne avec cet article ; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Bien que la proportion de cellules B de pointe se liant au RBD soit similaire chez les répondeurs élevés par rapport aux répondeurs moyens et faibles (Figure 1, A – C), les taux d'hypermutation somatique des chaînes lourdes étaient significativement plus élevés dans le groupe des répondeurs élevés (Figure 1). , D et E), ce qui suggère que ces individus pourraient avoir le potentiel le plus élevé de générer de puissants mAb à réaction croisée (16). Ces anticorps ont été étudiés plus en détail contre les mutants RBD pour identifier leurs classifications d'épitopes (17). Parmi 14 mAb réactifs au RBD, nous avons identifié 4 mAb de classe 2, 2 mAb de classe 3 et 8 mAb non classés qui ont montré peu ou pas de réduction de la liaison contre les mutants RBD clés testés (Figure 1F). A noter que les anticorps de classe 2, classe 3 et classe 4 correspondent approximativement aux épitopes RBS BD, S309 et CR3022 définis dans des études précédentes (13, 18). Les mAb RBD de classes 2 et 3 n'ont pas reconnu un mutant RBD multivariant contenant des substitutions K417N/E484K/L452R/N501Y, un RBD artificiellement conçu pour inclure des mutations clés pour la fuite du virus (17, 18), et ils n'ont pas non plus démontré de réactivité croisée avec le RBD du SRAS-CoV-1 et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV (Figure 1F). Sur le plan fonctionnel, les mAb RBD de classe 2 et 3 neutralisaient puissamment les variantes D614G et Delta, mais l'activité neutralisante était plus limitée contre Beta, Kappa et Mu (Figure 1G). Aucun des anticorps de classe 2 ou 3 analysés n’a neutralisé les variantes d’Omicron testées.

En revanche, la majorité des mAb non classés se sont liés au multivariant RBD et ont réagi de manière croisée au SARS-CoV-1 RBD (Figure 1F). Parmi ceux-ci, nous avons identifié 3 mAb, S451-1140, S626-161 et S728-1157, qui ont montré un pouvoir de neutralisation élevé contre le D614G et ont neutralisé de manière croisée Beta, Delta, Kappa, Mu et Omicron BA.1 avec une concentration inhibitrice de 99 % (IC99) comprise entre 20 et 2 500 ng/mL (Figure 1G). Compte tenu du large pouvoir de neutralisation de ces 3 mAb, en plus de la plateforme de test sur plaque, nous avons également effectué l'activité de neutralisation contre les authentiques BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Virus BA.5 et XBB utilisant le test de neutralisation par réduction de focalisation (FRNT) (Figure 1G). Parmi ceux-ci, S728-1157 a présenté des activités neutralisantes élevées contre le panel de variantes d'Omicron, notamment BA.1, BA.2, BA.4 et BA.5, avec une IC99 allant jusqu'à 100 ng/mL, mesurée par un dosage des plaques. Un scénario similaire a été observé avec FRNT, où S728-1157 a maintenu sa forte activité de neutralisation contre BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 et XBB avec une CI50 comprise entre 8 et 300 ng. /mL (Figure 1G). S451-1140 a neutralisé puissamment BA.1, BA.2, BA.2.75 et BL.1, mais pas BA.4 et BA.5, comme observé dans les deux plates-formes de test de neutralisation. En revanche, S626-161 n'a pas démontré d'activité neutralisante contre les variantes d'Omicron au-delà de la variante BA.1 (Figure 1G). Bien que S626-161 ait un pouvoir de neutralisation plus faible contre les COV testés que les 2 autres anticorps, c'était le seul mAb qui présentait une réactivité croisée non seulement avec le SARS CoV-1 RBD, mais était également capable de neutraliser les chauves-souris. coronaviruses WIV-1 et RsSHC014 (Figure 1, F et G). Ces données suggèrent que S626-161 reconnaît un épitope conservé partagé entre ces lignées d'arbovirus mais qui est absent dans les souches BA.2 et ultérieures. De plus, par rapport à S728-1157 et S451-1140, S626-161 possède un CDR-H3 plus long qui pourrait fournir une capacité améliorée à reconnaître un patch hautement conservé de résidus partagés entre les arbovirus, comme décrit dans une étude précédente (19) (Figure 1 supplémentaire). En comparant les gènes variables des immunoglobulines lourdes (IGHV) et des chaînes légères (IGLV ou IGKV) de ces 3 mAb avec la base de données disponible sur les mAb neutralisants du SRAS-CoV-2 (13, 15, 20-27), nous avons constaté que la chaîne lourde les gènes variables utilisés par S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) et S626-161 (IGHV4-39) ont Il a déjà été signalé qu'il code pour plusieurs anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 ciblant le RBD (21, 22, 28, 29). Cependant, seul S 728-1157 possédait des appariements uniques de gènes variables à chaînes lourdes et légères qui n'ont pas été signalés dans la base de données (tableau supplémentaire 3), ce qui indique qu'il ne s'agit pas d'un clonotype public.

Figure 1. Caractérisation des mAb réactifs au RBD isolés d’individus convalescents au COVID-19

Ces 3 mAb (S451-1140, S626-161 et S728-1157) ont été caractérisés davantage pour déterminer leur étendue de liaison contre les COV du SARSCoV-2 (Figure 2, A et B) . Il a été démontré que le pic stabilisé par préfusion contenant des substitutions 2-proline dans la sous-unité S2 (2P ; diproline) est un immunogène supérieur par rapport au pic WT et est à la base de plusieurs SRAS-CoV actuels-2 vaccins, y compris les vaccins à base d’ARNm (30, 31). Plus récemment, il a été rapporté que la protéine Spike stabilisée avec 6 prolines (6P ; hexaproline) augmentait l’expression et était encore plus stable que la construction diproline d’origine ; en conséquence, son utilisation a été proposée dans la prochaine génération de vaccins contre la COVID-19 (32, 33). Pour déterminer s'il existe des différences d'antigénicité entre les constructions de pointe de diproline et d'hexaproline, les deux immunogènes ont été inclus dans notre panel de test. Tel que mesuré par ELISA, nous avons constaté que 3 mAb se liaient davantage à l'antigène de pointe 6P-WT par rapport à la pointe WT-2P (Figure 2, A et B). Les 3 mAb ont montré une liaison comparable aux pointes des virus Alpha, Beta, Gamma et Delta, par rapport à celle du WT-2P (Figure 2, A et B). Cependant, les réactivités de liaison de ces 3 mAb ont été considérablement réduites contre un panel d’antigènes de la famille Omicron (Figure 2, B et C). La liaison S451-1140 était sensible aux mutations trouvées dans BA.1 et BA.2, entraînant une forte diminution de la liaison et une diminution 31- fois de la neutralisation contre ces variantes par rapport à WT-2 Antigène P et virus D614G, respectivement (Figure 2B). L'AcM neutralisant le sarbecovirus, S626-161, a également montré une liaison réduite de 1,2- à 3,5- fois à l'antigène Spike BA.1, ce qui peut expliquer un {{45} }fois une réduction de l'activité de neutralisation contre BA.1 (Figure 1G et Figure 2, B et C). Pour l'anticorps largement neutralisant (bnAb) le plus puissant, S728-1157, la liaison aux antigènes Omicron a été réduite dans une moindre mesure (allant de 1,1- à 4,4- fois) par rapport à Le pic WT-2P n'a pas été affecté par l'activité neutralisante (Figure 1G et Figure 2, B et C). La diminution substantielle de la liaison du mAb neutralisant Omicron au pic BA.1 peut être due à des altérations de sa mobilité et liée à l'emballage serré des structures Omicron 3-RBD-down et à la préférence pour 1- des RBD qui aident à échapper aux anticorps, comme le rapporte une étude précédente (34). Les mutations stabilisatrices 2P et 6P ont également des effets différentiels dans les variantes d'Omicron où les 3 mAb ont montré une liaison plus de 2,8- fois plus élevée au pic BA.1-6P par rapport au BA.1-2P version, mais n'a que légèrement augmenté la liaison aux versions Spike BA.2 et BA.4/5 6P par rapport à leurs versions 2P de 1,2 × à 1,4 ×, suggérant une accessibilité légèrement meilleure des mAb neutralisants Omicron aux versions hexapolaires, en particulier pour la construction Spike BA.1. En plus de l'ELISA, l'interférométrie de la biocouche (BLI) a été utilisée pour quantifier le taux de liaison et les constantes d'équilibre (kon, koff et KD) de ces 3 mAb à un panel d'antigènes de pointe (Figure 2 supplémentaire). Les taux de reconnaissance de la liaison de l'antigène fragmenté (Fab) aux pointes d'hexaproline étaient de 1,5- à 3,3- fois plus rapides par rapport aux pointes de diproline (Figure 2 supplémentaire, B et C), montrant que les anticorps se sont liés à la construction 6P plus rapidement qu'à la construction 2P. On aurait pu s’y attendre si les épitopes étaient plus accessibles sur le RBD à l’état ouvert sur le pic d’hexaproline. À l'exception de S626- 161, les Fabs se sont dissociés du pic d'hexaproline plus lentement (avaient un koff inférieur) que le pic de diproline, de sorte que le KD global a montré que S728-1157 et S451-1140 se liaient à le pic d’hexaproline avec une plus grande affinité (Figure supplémentaire 2, B et C). L'augmentation de la liaison au pic d'hexaproline était encore plus notable pour les IgG intactes par le modèle d'interaction 1:2, comme le montrent les mAb S728-1157 et S451- 1140, ce qui est cohérent avec l'exposition de plusieurs épitopes avec une stabilisation 6P permettant avidité améliorée (Figure supplémentaire 2, A et C). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les épitopes ciblés pourraient être comparativement plus accessibles sur le pic 6P-stabilisé lorsque le RBD est à l’état ouvert. Des analyses structurelles ont ensuite été effectuées pour vérifier cette conjecture.

Figure 2. Étendue de liaison des mAb neutralisants Omicron

Analyse structurale de mAb largement neutralisants. En première approximation des épitopes liés, un test de compétition ELISA a été utilisé pour déterminer si ces 3 mAb largement neutralisants partageaient un chevauchement avec notre panel actuel d'AcM, une collection d'AcM avec des spécificités d'épitopes connues provenant d'études précédentes (15, 25, 35). , et 2 autres mAb actuellement en utilisation clinique, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) et REGN10933 (Regeneron) (37). Les sites de liaison de S451-1140 et S728-1157 chevauchaient partiellement CC12.3 (23, 25), un anticorps neutralisant de classe 1, et la plupart des anticorps de classe 2, y compris LY-CoV555 et REGN10933, mais pas avec des anticorps de classe 3 et de classe 4 (Figure 3A). S626-161 partageait un chevauchement notable dans la région de liaison avec CC12.3 de classe 1, plusieurs anticorps de classe 4, dont CR3022, et d'autres anticorps non classés, tout en présentant un chevauchement partiel avec plusieurs anticorps de classe 2 et un seul anticorps de classe 3 (Figure 3A). De manière analogue, un test de compétition BLI a révélé que S451-1140 et S728-1157 étaient fortement en compétition pour la liaison au pic WT-6P, alors que S626-161 ne le faisait pas (Figure supplémentaire 3). Dans l'ensemble, ces données suggèrent que S451-1140 et S728-1157 reconnaissent des épitopes similaires distincts de S626-161.

Figure 3. Mécanisme de neutralisation large de S728-1157

L'anticorps S728-1157 était codé par IGHV3-66 et possédait une courte région 3 déterminant la complémentarité (CDR-H3). Notamment, les mAb qui se lient au RBS en mode de liaison 1 (c'est-à-dire RBS-A ou site de classe 1), caractérisé par CC12.1, CC12.3, B38 et C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), ont tendance à utiliser IGHV3-53 ou 3-66 et sont sensibles aux mutations de VOC (40). Cependant, la région CDR-H3 de S728-1157 est très distincte des autres anticorps de cette classe, ce qui pourrait expliquer son activité plus large. Pour comprendre la base structurelle d'une large neutralisation par S728-1157 au niveau de cet épitope, nous avons résolu une structure de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) (Figure 3B) d'IgG S728-1157 en complexe avec le pic WT{ {31}}P-Mut7, une version de Spike WT-6P possédant une liaison disulfure interprotomère en C705 et C883, à une résolution globale d'environ 3,3 Å (Figure 4E supplémentaire). En utilisant des méthodes d'expansion de symétrie, de classification ciblée et de raffinement, nous avons obtenu une résolution locale à l'interface RBD-Fv à environ 4 Å (Figure 4E supplémentaire et Tableau supplémentaire 8). Une structure cristalline de S728-1157 Fab a été déterminée à une résolution de 3,1 Å et utilisée pour construire le modèle atomique à l'interface RBD-Fv. Nos structures confirment que S728-1157 a lié l'épitope RBS-A (ou classe 1) dans la conformation RBD-up (Figure 3B et Figure 4E supplémentaire), similaire à d'autres IGHV3-53/{{55} } anticorps (Figure 3C). Le blocage stérique du site de liaison de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) par S728-1157 explique son pouvoir de neutralisation élevé contre le SRAS-CoV-2. Le motif 32NY33 et le motif 53SGGS56 (23) dans S728-1157 CDR-H1 et -H2 interagissent avec le RBD presque de la même manière que CC12.3 (Figure 4 supplémentaire, B et C). Cependant, comparé au VH 98DF99 dans CC12.3, le VH 98DY99 dans S728-1157 CDR-H3 forme des interactions plus étendues, y compris des interactions hydrophobes et polaires, avec le RBD, ce qui peut expliquer la large neutralisation contre les COV (Figure 3D et tableaux supplémentaires 6 et 7). La diglycine VH 100GG101 dans S728- 1157 CDR-H3 peut également faciliter une liaison plus étendue par rapport au VH Y100 dans CC12.3, probablement en raison de la flexibilité des résidus de glycine qui conduisent à une conformation différente de la pointe du CDR. -H3 boucle et un déplacement relatif des résidus à 98DY99.

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Bien que les COV Omicron présentent des mutations importantes dans le RBD, la plupart de ces résidus n'interagissent pas avec S728-1157, car une liaison est toujours observée (Figure 4A supplémentaire). D'après notre modèle Spike WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157, Y505 à VL Q31 et E484 à VH Y99 devraient établir des liaisons hydrogène (Figure 4D supplémentaire et Tableau supplémentaire 6). ), qui ont le potentiel d'être perturbés par les mutations Omicron Y505H et E484A. Cependant, une mutation Y505H permettrait toujours une liaison hydrogène avec VL Q31, et une mutation E484A ajouterait une autre chaîne latérale hydrophobe à proximité des résidus hydrophobes VL Y99, F456 et Y489. Ces contacts peuvent expliquer, en partie, le mécanisme qui permet à S728-1157 de conserver une activité neutralisante, bien que réduite, contre l'antigène Spike BA.1 (Figure 1G et Figure 2B). L’antigène BA.1, quant à lui, est peut-être lié aux mutations Omicron modifiant le paysage conformationnel de la protéine de pointe (34). Cependant, plusieurs résidus somatiquement mutés, à savoir VH L27, L28, R31, F58 et VL V28 et Q31, dans S728-1157 sont impliqués dans l'interaction avec le SRAS-CoV-2 RBD (Figure 1 supplémentaire et Tableau supplémentaire 7), ce qui peut également contribuer à sa large réactivité par rapport au CC12.3. Dans l'ensemble, nos études structurelles ont révélé les bases d'une large neutralisation du S728-1157 qui peut s'adapter à la plupart des mutations des COV du SRAS-CoV-2.

Figure 4. Efficacité protectrice des bnAbs contre l’infection par le SRAS-CoV-2 chez les hamsters.

S728-1157 réduit la réplication du SRAS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta et WT SARS-CoV-2 chez les hamsters syriens. Pour évaluer l'efficacité protectrice de nos mAb largement neutralisants, nous avons utilisé un modèle d'infection du hamster syrien doré qui a été largement utilisé pour le SRAS-CoV-2. Les hamsters ont reçu 5 mg/kg de nos mAb de test ou un contrôle isotype ciblant un antigène non pertinent (glycoprotéine d'ebolavirus) par injection intrapéritonéale 1 jour après l'infection par les virus du SRAS CoV-2. Les tissus pulmonaires et nasaux ont été collectés 4 jours après l'infection (Figure 4A). L'administration thérapeutique de S728-1157 a entraîné une réduction des titres de variantes WT, BA.1 Omicron et Delta dans les cornets nasaux et les poumons des hamsters infectés (Figure 4, B – D). Fait intéressant, l’effet de S728-1157 dans les poumons a été spectaculaire, réduisant les charges virales WT et BA.1 Omicron d’environ 104 PFU, les titres viraux de la variante BA.1 Omicron étant complètement abolis (Figure 4C). Contrairement à la neutralisation in vitro (Figure 1G), S451-1140 n'a pas réduit la réplication virale BA.1 Omicron dans les cornets pulmonaires et nasaux, indiquant un décalage entre la neutralisation in vitro et la protection in vivo pour ce clone (Figure 4E) . En comparaison, l'administration de S626-161 a entraîné des réductions légèrement significatives des titres viraux pulmonaires après la provocation WT et BA.1 (Figure 4, F et G). Ces données soulignent que, pour définir avec précision les mAb largement protecteurs, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de la protection parallèlement à l’activité de neutralisation. À l’avenir, il sera intéressant d’examiner dans quelle mesure la capacité de protection de S728-1157 dépend de Fc. Dans l'ensemble, S728-1157 représente un mAb prometteur avec une large efficacité de neutralisation contre les variantes du SRAS CoV-2 qui sont capables de réduire considérablement la réplication WT, Delta et BA.1 in vivo.

L’infection par le SRAS-CoV-2 provoque rarement de puissants mAb neutralisants croisés de type S728-1157. Compte tenu de la neutralisation croisée et du potentiel prophylactique du S728-1157, nous avons cherché à évaluer si des anticorps de type S728-1157 sont couramment induits parmi les réponses polyclonales chez les patients atteints du SRAS-CoV-2. Pour évaluer cela, nous avons effectué des ELISA de compétition en utilisant du sérum de convalescence pour détecter les titres d'anticorps anti-RBD susceptibles de rivaliser pour la liaison avec S728-1157 (Figure 5A). Les sujets ont été divisés en 3 groupes en fonction de l'ampleur des réponses en anticorps, telle que définie précédemment (15, 16). Bien que les répondeurs élevés et modérés aient des titres plus élevés d'anticorps sériques S728-1157 – compétitifs par rapport aux répondeurs faibles (Figure 5B), les titres étaient assez faibles dans tous les groupes, ce qui suggère qu'il est rare d'acquérir des niveaux élevés de S{{ Anticorps de type 18}} dans le sérum polyclonal suite à une infection WT par le SRAS-CoV-2. En plus de S728-1157, nous avons testé la compétition du sérum de convalescence avec d'autres mAb, notamment S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 et CC12.3. Semblable à S728-1157, nous avons observé des titres relativement faibles d'anticorps en compétition avec S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 et CC12.3 dans le sérum polyclonal de la plupart des convalescents. individus (Figure 5, C – F et H). Néanmoins, les répondeurs élevés avaient tendance à avoir des titres significativement plus élevés contre ceux qui neutralisent les mAb que les répondeurs faibles (Figure 5, B – F et H). En revanche, les anticorps ciblant le site de l’épitope CR3022 étaient plus prononcés chez les personnes convalescentes, ce qui suggère l’enrichissement en anticorps RBD de classe 4 dans le sérum polyclonal (Figure 5G). Notamment, il n'y avait pas de différence significative dans les titres de CR3022 entre les 3 groupes de répondeurs, ce qui suggère que les anticorps du site CR3022-étaient systématiquement induits lors de l'infection WT par le SRAS-CoV-2 chez la plupart des individus. Fait intéressant, par rapport au CC12.3, S728-1157 a été détecté à des niveaux 4- fois inférieurs dans le sérum des répondeurs élevés. Ainsi, bien que les anticorps de classe 1 soient fréquemment induits par une infection naturelle et une vaccination (14, 20, 28, 29, 41-43), nos données suggèrent que les anticorps de type S728-1157 qui représentent un sous-ensemble de cette classe sont relativement rares.

De plus, nous avons examiné la différence de réactivité au pic stabilisé par 2P par rapport au pic stabilisé par 6P dans nos sérums de cohorte de convalescents (Figure 5, I – K). Nous avons constaté que les 3 groupes de répondeurs montaient des anticorps réactifs anti-spike contre le Spike WT stabilisé par 6P dans une plus grande mesure que le Spike WT stabilisé par 2P, d'un facteur de 6 à 11 fois (Figure 5J), ce qui indique que le les épitopes antigéniques majeurs étaient mieux exposés ou stabilisés sur l'antigène stabilisé par 6P. En utilisant les mêmes échantillons, les répondeurs élevés et modérés présentaient également des titres d'anticorps anti-pic contre BA.1-2P inférieurs à ceux de BA.1-6P, de 4 à 5 fois (Figure 5K). Il convient de noter que les faibles répondeurs présentaient une variation plus faible de la réactivité de liaison contre le pic BA.1 Omicron-2P et 6P (2-fois de réduction) par rapport au pic WT-2P et 6P ({ {28}}fois de réduction) (Figure 5, J et K), ce qui suggère que les anticorps sériques contre les épitopes réactifs BA.1 Omicron pourraient être plus limités chez les sujets peu répondeurs. Dans l’ensemble, ces données suggèrent qu’il existe une liaison polyclonale améliorée induite par l’infection naturelle au pic stabilisé par 6P, à la fois pour les virus WT et Omicron.

Les anticorps de type S728-1157 sont induits de manière optimale dans le contexte de l’immunité hybride. L'infection primaire par le SRAS-CoV-2 sans vaccination est devenue rare dans le contexte mondial actuel, et plusieurs études ont rapporté que l'immunité contre le SRAS-CoV-2 diffère entre les individus ayant des antécédents de vaccination/infection spécifiques. En conséquence, nous avons ensuite cherché à étudier quelles expositions courantes, outre l'infection WT par le SRAS-CoV ancestral -2 seul, induiraient efficacement des anticorps de type S728-1157 dans le plasma de sujets vaccinés monovalents à base d'ARNm avec et sans préalable. infection. Nous avons obtenu les échantillons biologiques nécessaires auprès de la cohorte d’étude Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), qui suit longitudinalement les travailleurs de la santé depuis le début de la pandémie (44). Nous avons sélectionné des échantillons de plasma provenant de participants à l'étude entièrement immunisés (2 × vaccinés) avec et sans infection, ainsi que de participants boostés (3 × vaccinés) avec et sans infection. En outre, nous avons également inclus des échantillons de participants à l’étude qui avaient reçu le vaccin bivalent à ARNm (ancestral WA1/2020 plus Omicron BA.5) (Figure 6A et Tableau supplémentaire 2). Les infections révolutionnaires chez les participants qui avaient reçu des vaccinations de rappel se sont produites à un moment où les lignées Omicron avaient remplacé toutes les autres lignées du SRAS-CoV-2 dans la région métropolitaine de New York. Nous avons constaté que les individus doublement vaccinés présentaient les titres les plus faibles d'anticorps sériques compétitifs S728-1157 parmi les 5 groupes d'échantillons testés (Figure 6B). Notamment, ces niveaux étaient similaires à ceux observés pour notre cohorte de convalescents non vaccinés (tous les répondeurs ; Figure 5B). En comparaison, les individus ayant des antécédents d'infection naturelle, y compris les individus en convalescence ayant reçu 2 des 3 doses de vaccin, et les individus ayant connu une infection percée et ayant reçu un rappel bivalent, ont montré des niveaux significativement plus élevés d'élicitation de S728-1157 par rapport aux individus non infectés. mais des individus vaccinés (Figure 6B). Bien que le groupe de dose 3-non infecté n'ait affiché qu'une augmentation non significative par rapport au groupe de dose 2-, la répartition par type de vaccin a indiqué que les troisièmes doses homologues de BNT162b2 et d'ARNm-1273 ont augmenté de manière significative S{{ 38}}comme les titres d'anticorps neutralisants de 2,72 × et 2,85 ×, respectivement (Figure 6, C et D). À noter que parmi les participants ayant eu 3 contacts au total avec Spike par quelque moyen que ce soit, les titres d'anticorps de type S728-1157- étaient 3 fois plus élevés chez les personnes convalescentes doublement vaccinées que chez les personnes triplement naïves d'infection, ce qui suggère que le SRAS-CoV{{ 51}} l'infection induit de manière plus optimale ce clonotype. Parmi les groupes d'immunité hybride, nous avons noté qu'une majorité des individus vaccinés avec une percée ayant reçu la dose de vaccin de rappel bivalent n'avaient que un titre d'anticorps S 728-1157 légèrement plus élevé que les groupes vaccinés en convalescence pré omicron, ce qui suggère que le S {{53 Le titre }} approchait probablement d'un plateau après 3 expositions. Nous avons également étudié les titres d'anticorps polyclonaux en compétition avec CC12.3 et CR3022 en plus de S728-1157. Tous les individus présentaient des titres relativement élevés d'anticorps de type CC12.3- et CR3022-, indépendamment du nombre et du type d'exposition (Figure 5 supplémentaire), contrairement à ce que nous avons observé pour S728-1157-. comme les anticorps. Dans l’ensemble, ces données indiquent que l’infection par le SRAS-CoV-2 et la vaccination par ARNm contribuent toutes deux à l’induction d’anticorps de type S728-1157-, l’infection jouant un rôle plus dominant chez les individus vaccinés.

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Enfin, en comparant les réponses contre le pic stabilisé par 2P par rapport à 6P dans la cohorte de vaccination par ARNm, nous avons constaté que la plupart des groupes produisaient des niveaux similaires d'anticorps contre les deux constructions. L’exception à cette règle était le groupe non infecté triplement vacciné, qui a démontré une réactivité statistiquement plus élevée, bien que légèrement augmentée, au 2P par rapport au pic stabilisé au 6P (Figure 6E). Ces données suggèrent que contrairement à l'infection naturelle (Figure 5, J et K), la vaccination seule produit une réponse polyclonale plus limitée aux épitopes de la construction Spike-2P, conformément à la construction Spike{{12. }}P formulation des vaccins actuels. En fin de compte, ces résultats soutiennent l'idée selon laquelle la stabilisation 6P des futurs vaccins contre le SRAS-CoV-2 pourrait être d'un avantage majeur en induisant des clonotypes d'anticorps largement protecteurs comme S728-1157.

Figure 5. Compétition des anticorps sériques de convalescence avec des mAb largement neutralisants réactifs au RBD et comparaison de la réponse des anticorps sériques contre les pointes stabilisées 6P et 2P

Figure 6. Compétition des anticorps sériques vaccinés contre l'ARNm avec les mAb neutralisants RBD-réactifs S728-1157 et comparaison de la réponse des anticorps sériques contre les pointes stabilisées 6P par rapport aux pointes stabilisées 2P.

Discussion

Dans cette étude, nous identifions un bnAb puissant isolé d'une cellule B mémoire d'un individu qui s'était remis d'une infection par le SRAS-CoV-2 au cours de la vague initiale de la pandémie de COVID-19. Ce bnAb, S728- 1157, a maintenu une réactivité de liaison substantielle et avait une activité neutralisante constante contre tous les COV du SRAS-CoV-2 testés, y compris Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 et XBB, et a pu réduire considérablement les titres viraux infectieux suite à une infection par Delta et BA.1 chez les hamsters.

Nous avons constaté que le sérum de convalescence de notre cohorte contenait de faibles concentrations d'anticorps qui entrent en compétition avec les mAb épitopes S728-1157 (un anticorps de classe 1/RBS-A) et d'épitopes de classe 2. Cela suggère que S728-1157 est quelque peu unique par rapport aux autres anticorps qui ciblent les épitopes de classe 1 et est rarement induit dans le pool de cellules B mémoire spécifiques du RBD. Au lieu de cela, notre cohorte d’infections naturelles a semblé induire des anticorps ciblant l’épitope CR3022 (classe 4) ; les anticorps de cette spécificité ont souvent une réaction croisée mais sont moins puissamment neutralisants que les anticorps ciblant le RBS (14, 17). Ces données sont complémentaires à nos découvertes précédentes démontrant qu'une abondance d'anticorps de classe 3/S309 dans les sérums de convalescents peut contribuer à l'activité neutralisante contre les variantes Alpha et Gamma, alors qu'un manque d'anticorps de classe 2 peut expliquer une capacité de neutralisation réduite contre Delta (15). . Néanmoins, l’étendue de l’activité de la plupart de ces anticorps ciblant le RBS (RBS-A/classe 1, RBS-B, C/classe 2 et RBS-D, S309/classe 3) contre les variants d’Omicron serait très limitée. (11, 40, 45).

Le principal défi à l’avenir sera de déterminer comment améliorer la production d’anticorps à large réaction croisée contre les épitopes RBS conservés. À cet égard, nous avons observé ici que les individus dotés d'une immunité hybride présentaient des titres d'anticorps de type S 728-1157- significativement plus élevés que les individus vaccinés sans infection préalable. Il est important de noter que ce phénomène a été observé même lorsque le nombre d'expositions était contrôlé (c'est-à-dire chez les doubles vaccinés convalescents par rapport aux triples vaccinés non infectés), ce qui suggère qu'un certain élément de l'immunité associée à l'infection (ou une formulation vaccinale pouvant imiter ce type d'immunité) est important pour l’élicitation de ce clonotype. Ceci est cohérent avec les preuves expérimentales démontrant que les individus dotés d’une immunité hybride ont des profils de réactivité des anticorps plus larges que ceux qui ont uniquement une réponse immunitaire induite par la vaccination ou par une primo-infection (9).

Les structures présentées ici illustrent que S728-1157 lié à l'épitope RBS-A/classe 1 dans le RBD de conformation ascendante. Cet épitope semble être plus facilement accessible sur les pointes stabilisées par 6P, qui présenteraient 2 RBD dans le nord de l'État, par rapport aux pointes 2P, qui n'en présentent qu'un (30, 33, 46, 47) et contre lesquelles nos anticorps spécifique pour le pic de conformation supérieure montre une liaison améliorée. S728-1157 a été isolé après une infection naturelle ; dans de tels contextes, les chances d'induire des clones de type S728-1157 sont probablement plus élevées étant donné que le RBD doit être capable d'adopter une conformation vers le haut, même de manière transitoire, pour se lier à ACE2, exposant ainsi cet épitope. Contrairement à la majorité des anticorps IGHV3-53/3-66 RBS-A/classe 1, S728-1157 peut s'adapter à des mutations clés dans les pics de COV en utilisant des interactions étendues entre CDR-H3 et le RBD (29, 48-50). S728-1157 utilise également une chaîne légère différente (IGLV3-9) par rapport à d'autres anticorps moins larges tels que CC12.3 (IGKV3-20), ce qui peut affecter les interactions de liaison globales ; cependant, notre analyse indique qu'il y a moins de liaisons hydrogène entre la chaîne légère S728-1157 et le RBD par rapport au CC12.3 (tableau supplémentaire 7). Bien que la plupart des résidus de contact CDR-H3 essentiels à la réactivité croisée des COV dans cette interaction soient codés par la lignée germinale et ne soient pas introduits par des mutations somatiques, plusieurs résidus mutés somatiquement dans les régions charpentes ou CDR-H1, CDR-H2 et CDR-L1 sont impliqué dans l'interaction avec le SRAS-CoV-2 RBD. D'une part, cela suggère que les cellules B mémoire codant pour les anticorps de classe IGHV3-53/66 pourraient acquérir un degré similaire de réactivité croisée par une maturation d'affinité plus poussée. D'un autre côté, cela indique également la possibilité de concevoir des immunogènes ciblés sur la lignée germinale qui ciblent les cellules B naïves de type S728-1157-. Bien qu'il puisse être difficile de concevoir des vaccins capables de produire spécifiquement des anticorps de type S728-1157 avec des CDR-H3 sélectionnés capables de surmonter les mutations VOC, il est encourageant de constater qu'une restriction du gène IGHV est observée dans d'autres SRAS-CoV puissants{ {58}} études sur les mAb neutralisants (13, 15, 20-27). Alternativement, cela peut également être réalisable grâce à une immunisation itérative avec des immunogènes RBD optimisés, comme cela a déjà été rapporté pour d’autres agents pathogènes (51-55).

Bien que de nombreuses mutations aient été observées dans le site antigénique RBS-A/ classe 1 (18), en ce qui concerne l'épitope S728-1157, 13 des 15 résidus de contact totaux RBD et 2 des 3 CDR-H{{9} Les résidus de contact RBD liés sont conservés dans Omicron et tous les autres COV. Cela suggère que la région RBD où se trouve l’épitope S728-1157 peut inclure des résidus essentiels à sa fonction dynamique et à sa forme physique virale et serait donc moins tolérante aux mutations et à la dérive antigénique que les résidus environnants du site RBS-A/classe 1. Si tel est le cas, la tendance à la perte de cet épitope particulier à mesure que les variantes virales évoluent devrait être réduite, ce qui rend la caractérisation de S728-1157 et des anticorps et épitopes similaires importante pour les vaccins résistants aux variantes ou le développement thérapeutique des mAb. En résumé, notre étude identifie des bnAb qui pourraient éclairer la conception d'immunogènes pour des vaccins contre les coronavirus de nouvelle génération à l'épreuve des variantes ou servir de produits thérapeutiques mAb résistants à l'évolution du SRAS CoV -2. En particulier, en termes de puissance et d’étendue combinées, S728-1157 semble être le meilleur anticorps isolé à ce jour. Étant donné que cet anticorps se lie plus facilement à la stabilisation 6P, il devrait être préférentiellement induit par des protéines de pointe recombinantes stabilisées par 6P ou par un virus entier, ce qui suggère que la modification de l'hexaproline pourrait bénéficier aux futures constructions de vaccins afin de protéger de manière optimale contre le futur SRAS-CoV. -2 variantes et autres arbovirus.

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Méthodes

Isolement d'anticorps monoclonaux. Les PBMC ont été isolées des filtres de leucoréduction et congelées comme décrit précédemment (24). Les cellules B ont été enrichies à partir de PBMC via FACS. Les cellules ont été colorées avec des sondes CD19, CD3 et antigéniques conjuguées à un oligo-fluorophore ; les cellules d'intérêt ont été identifiées comme étant CD3– CD19+ Antigen+. Tous les mAb ont été générés à partir de cellules oligo-marquées, triées par appâts antigéniques, identifiées par ARN-Seq unicellulaire, comme décrit précédemment (15, 24). Les données sur les cellules B uniques générées dans cette étude ont été déposées sur Gene Expression Omnibus : GSE171703 et GSM5231088 – GSM5231123.

Des cellules B spécifiques de l'antigène ont été sélectionnées pour générer des mAb sur la base de l'intensité de la sonde antigène analysée par JMP Pro 15. Les gènes des chaînes lourdes et légères des anticorps ont été synthétisés par Integrated DNA Technologies (IDT) et clonés dans des IgG1 humaines et des chaînes légères κ ou λ humaines. vecteurs d'expression par assemblage Gibson, comme décrit précédemment (56). Les chaînes lourdes et légères du mAb correspondant ont été cotransfectées de manière transitoire dans des cellules HEK293T (ATCC). Après une transfection de 18 heures, les cellules transfectées ont été complétées par un surnageant de milieu d'hybridome sans protéines (PFHM-II, Gibco). Le surnageant contenant le mAb sécrété a été récolté au jour 4 et purifié à l'aide de billes de protéine A-agarose (Thermo Fisher Scientific) comme détaillé précédemment (56). Les séquences de chaînes lourdes et légères des anticorps bien caractérisés ont été dérivées de Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID : 7KMG), CR3022 (PDB ID : 6W7Y) et REGN1{{ 125}}933 (PDB ID : 6XDG) et ont été synthétisés comme décrit ci-dessus. Le mAb CC12.3 (ID PDB : 6XC4) a été fourni par Meng Yuan du Scripps Research Institute (San Diego, Californie, États-Unis). Expression de la protéine Spike recombinante. Le pic recombinant D614G SARS-CoV-2 pleine longueur (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, mutants RBD simples (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A et Y505F), la combinaison mutant RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD et MERS-CoV RBD ont été générés en interne. En bref, les antigènes recombinants ont été exprimés à l'aide de cellules Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Le gène d'intérêt a été cloné dans un vecteur d'expression de mammifère (AbVec modifié en interne) et transfecté à l'aide du kit ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) conformément au protocole du fabricant. Le surnageant a été récolté le jour 4 après la transfection et incubé avec de l'agarose d'acide Ni-nitrilotriacétique (Ni-NTA) (Qiagen). La purification a été réalisée à l'aide d'une colonne à écoulement gravitaire et éluée avec un tampon contenant de l'imidazole comme décrit précédemment (57, 58). L'éluat a été tamponné et échangé avec du PBS en utilisant une unité centrifuge Amicon (Millipore). Les pointes de FL recombinantes stabilisées par des mutations 2P des variants B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 et BA.4 Omicron et ont été produit au laboratoire Sather du Seattle Children's Research Institute. Les RBD K417V, N439K et E484K et les pics FL recombinants WT-2P et 6P ont été produits dans le laboratoire Krammer de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï. Le SARS-CoV-2-6P-Mut7 et le Spike BA.1-6P ont été conçus et produits comme décrit dans une étude précédente (59). Les séquences protéiques et les ressources pour chaque antigène sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 4. ELISA. Les protéines recombinantes Spike/RBD du SRAS-CoV-2 ont été enduites sur des plaques de microtitrage à haute liaison aux protéines (Costar) à 2 ug/mL dans du PBS à 50 μL/puits et conservées toute la nuit à 4 degrés. Les plaques ont été lavées avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20 (PBS-T) et bloquées avec 150 µL de PBS contenant 20 % de FBS pendant 1 heure à 37 degrés. Les anticorps monoclonaux ont été dilués en série 3- fois à partir de 10 ug/mL dans du PBS et incubés dans les puits pendant 1 heure à 37 degrés. Les plaques ont ensuite été lavées et incubées avec un anticorps IgG anti-humain de chèvre conjugué à la HRP (Jackson ImmunoResearch ; 109- 035-098), 1:1, 000) pendant 1 heure à 37 degrés. Après lavage, 100 µL de substrat Super AquaBlue ELISA (eBioscience) ont été ajoutés par puits. L'absorbance a été mesurée à 405 nm sur un spectrophotomètre à microplaque (Bio-Rad). Les tests ont été standardisés à l'aide de l'anticorps témoin S144-509 (15), avec des caractéristiques de liaison connues dans chaque plaque, et les plaques ont été développées jusqu'à ce que l'absorbance du contrôle atteigne une DO de 3,0. Tous les mAb ont été testés en double et chaque expérience a été réalisée deux fois.

Sérum ELISA. Des plaques de microtitrage à haute teneur en protéines ont été recouvertes d'antigènes de pointe recombinants du SRAS-CoV-2 à 2 ug/mL dans du PBS pendant une nuit à 4 degrés. Les plaques ont été lavées avec du PBS 0.05 % de Tween et bloquées avec 200 μL de PBS 0,1 % de Tween + 3 % lait écrémé en poudre pendant 1 heure à température ambiante (TA). Les échantillons de plasma ont été inactivés par la chaleur pendant 1 heure à 56 degrés avant de réaliser l'expérience sérologique. Le plasma a été dilué en série 2- fois dans du PBS 0,1 % Tween + 1 % de lait écrémé en poudre. Les plaques ont été incubées avec des dilutions de sérum pendant 2 heures à température ambiante. L'anticorps secondaire anti-Ig humaine de chèvre conjugué à la HRP dilué à 1:3, 000 avec du PBS 0,1 % de Tween + 1 % de lait écrémé en poudre a été utilisé pour détecter la liaison des anticorps. Après 1 heure d'incubation, les plaques ont été développées avec 100 µL de solution SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) pendant 10 minutes. Ensuite, 50 µL de HCl 3M ont été utilisés pour arrêter la réaction de développement. L'absorbance a été mesurée à 490 nm sur un spectrophotomètre à microplaque (Bio-Rad). Les titres des points finaux ont été extrapolés à partir de la courbe standard sigmoïde 4PL (où x est le log de la concentration) pour chaque échantillon. La limite de détection (LOD) est définie comme la moyenne + 3 SD du signal OD enregistré à l'aide du plasma d'individus pré-SRAS-CoV-2. Tous les calculs ont été effectués dans le logiciel GraphPad Prism (version 9.0).

ELISA de compétition. Pour déterminer la classification des épitopes cibles des mAb réactifs au RBD, des tests ELISA de compétition ont été réalisés en utilisant d'autres mAb présentant des caractéristiques de liaison aux épitopes connues en tant que mAb concurrents. Les mAb concurrents ont été biotinylés en utilisant la sulfo-NHS-biotine EZ-Link (Thermo Fisher Scientific) pendant 2 heures à température ambiante. L'excès de biotine des mAb biotinylés a été éliminé avec des colonnes de dessalage Zeba à seuil de poids moléculaire (MWCO) de 7k (Thermo Fisher Scientific). Les plaques ont été recouvertes de 2 µg/mL d’antigène RBD pendant la nuit à 4 degrés. Les plaques ont été bloquées avec du PBS – 2 0 % de FBS pendant 2 heures à température ambiante, et la dilution 2- fois des anticorps monoclonaux d'une classe ou d'un sérum indéterminé a été ajoutée, à partir de 2 0 ug/mL d’AcM et une dilution de sérum au 1:10. Après incubation de l'anticorps pendant 2 heures à température ambiante, le mAb concurrent biotinylé a été ajouté à une concentration deux fois supérieure à celle de sa constante de dissociation (KD) et incubé pendant 2 heures supplémentaires à température ambiante avec le mAb ou le sérum précédemment ajouté. Les plaques ont été lavées et incubées avec 100 μL de streptavidine conjuguée à la HRP (Southern Biotech) à une dilution de 1 : 1, 000 pendant 1 heure à 37 degrés. Les plaques ont été développées avec le substrat Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Pour normaliser les tests, le mAb biotinylé concurrent a été ajouté à un puits sans aucun mAb ou sérum concurrent comme contrôle. Les données ont été enregistrées lorsque l'absorbance du puits témoin a atteint une DO de 1,0 à 1,5. Le pourcentage de compétition entre les mAb a ensuite été calculé en divisant la DO observée d'un échantillon par la DO atteinte par le contrôle positif, en soustrayant cette valeur de 1 et en multipliant par 100. Pour le sérum, les DO ont été transformées en log10 et analysées par régression non linéaire pour déterminer les 50 Valeurs de % de concentration d'inhibition (IC50) à l'aide du logiciel GraphPad Prism (version 9.0). Les données ont été transformées en Log1P et tracées dans un graphique représentatif de la dilution sérique réciproque de la CI50 de la dilution sérique qui peut atteindre une compétition de 50 % avec le mAb concurrent d'intérêt. Tous les mAb ont été testés en double, chaque expérience a été réalisée 2 fois indépendamment et les valeurs de 2 expériences indépendantes ont été moyennées.

Analyses de plaques. Des analyses de plaques ont été réalisées avec des virus variants du SRAS-CoV-2 sur des cellules Vero E6/TMPRSS2 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (Tableau supplémentaire 5). Les cellules ont été cultivées pour atteindre une confluence de 9 0 % avant d'être trypsinisées et ensemencées à une densité de 3 × 1 04 cellules/puits dans des plaques de 96-puits. Le jour suivant, 102 PFU du variant du SRAS-CoV-2 ont été incubés avec des mAb dilués au facteur 2- pendant 1 heure. Le mélange anticorps-virus a été incubé avec des cellules Vero E6/TMPRSS2 pendant 3 jours à 37 degrés. Les plaques ont été fixées avec du méthanol à 20% puis colorées avec une solution de cristal violet. Les concentrations inhibitrices complètes (IC99) ont été calculées à l'aide du log (inhibiteur) par rapport à la réponse normalisée (pente variable), réalisée dans GraphPad Prism (version 9.0). Tous les mAb ont été testés en double et chaque expérience a été réalisée deux fois. Test de neutralisation de réduction de focalisation. Des tests de neutralisation par réduction de focalisation (FRNT) ont été utilisés pour déterminer les activités de neutralisation en tant que plate-forme supplémentaire en dehors du test sur plaque. Des dilutions en série de sérum commençant à une concentration finale de 1:20 ont été mélangées avec 103 unités de virus formant des foyers par puits et incubées pendant 1 heure à 37 degrés. Un échantillon de sérum prépandémique regroupé a servi de contrôle. Le mélange anticorps-virus a été inoculé sur des cellules Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) dans des plaques à puits 96- et incubé pendant 1 heure à 37 degrés. Un volume égal de solution de méthylcellulose a été ajouté à chaque puits. Les cellules ont été incubées pendant 16 heures à 37 degrés puis fixées au formol. Une fois le formol retiré, les cellules ont été immunocolorées avec un mAb de souris contre la nucléoprotéine SARS-CoV -1/2 [clone 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], suivi d'une immunoglobuline anti-souris de chèvre marquée par HRP (Sigma-Aldrich). Aldrich ; A8924). Les cellules infectées ont été colorées avec le substrat TrueBlue (SeraCare Life Sciences), puis lavées avec de l'eau distillée. Après séchage, les nombres de foyers ont été quantifiés à l'aide d'un analyseur ImmunoSpot S6, du logiciel ImmunoCapture et du logiciel BioSpot (Cellular Technology). La CI50 a été calculée à partir de la valeur interpolée du log (inhibiteur) par rapport à la réponse normalisée, en utilisant une régression non linéaire à pente variable (4 paramètres) réalisée dans GraphPad Prism (version 9.0).

Les références

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