SLC37A2, une molécule liée au phosphore augmente dans les cellules musculaires lisses dans l'aorma calcifiée

Calcification vasculaireest une source majeure demaladie cardiovasculairechez les patients atteints d’insuffisance rénale chronique.Hyperphosphatémieconduit à une augmentation de l'afflux de phosphore intracellulaire, ce qui entraîne une augmentation du nombre de cellules de type ostéoblaste dans les cellules musculaires lisses vasculaires. PiT-1 transite le phosphate dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Cependant, le mécanisme de la calcification vasculaire n’est pas complètement compris. Cette étude a étudié des molécules candidates liées au phosphore autres que PiT-1. Nous avons émis l'hypothèse que les molécules liées au phosphore appartenant auporteur de soluté(SLC) serait impliquée dans la calcification vasculaire. À la suite de l’analyse des puces à ADN, nous nous sommes concentrés sur SLC37A2 et avons montré que l’expression de l’ARNm de ces cellules augmentait sur les cellules musculaires lisses aortiques calcifiées (AoSMC). Il a été rapporté que SLC37A2 transporte à la fois les échanges glucose -6- phosphate/phosphate et phosphate/phosphate. L'analyse in vitro a montré que l'expression de SLC37A2 n'était pas affectée par l'inflammation de l'AoSMC. L'expression de l'ARNm et de la protéine SLC37A2 a augmenté dans les AoSMC calcifiées. In vivo, l'analyse a montré que l'expression de l'ARNm de SLC37A2 dans l'aorte demaladie rénale chroniqueLes rats étaient corrélés aux gènes marqueurs ostéogéniques. De plus, SLC37A2 était exprimé dans la zone de calcification vasculaire chezrats atteints d'une maladie rénale chronique. En conséquence, nous avons montré que SLC37A2 est l’une des molécules qui augmentent aveccalcification vasculairein vitro et in vivo.

Mots clés: SLC37A2,calcification vasculaire, cellules musculaires lisses aortiques,maladie rénale chronique, hyperphosphatémie

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Comme le nombre de patients atteintsmaladie rénale chronique(IRC) augmente, le nombre de patientsnécessitant une dialyseaugmentera également. La plupart des décès chez les patients subissantdialysesont dus àmaladies cardiovasculairestel queinsuffisance cardiaque, troubles cérébrovasculaires, ou infarctus du myocarde. (,2) Une source majeure demaladie cardiovasculaireest une calcification ectopique(), une anomalie causée par la formation et le dépôt de cristaux de phosphate de calcium dans les tissus mous. (4 6) Divers facteurs tels que l'inflammation. Le stress oxydatif et l'augmentation des taux plasmatiques de calcium (Ca) et de phosphore (P) sont impliqués dans la progression de la calcification vasculaire. Parmi ces facteurs, l’hyperphosphatémie est la plus fortement associée à la calcification vasculaire. (7.8) L'hyperphosphatémie est provoquée par un apport excessif de P en présence d'une diminution de la fonction rénale. Par conséquent, les patients sous dialyse doivent limiter leur consommation de P. (79-12) Cependant, il a été rapporté quecalcification vasculaireprogresse déjà au début de la dialyse ; cela a également été observé chez des patients atteints d'IRC à un stade précoce lorsque l'hyperphosphatémie n'est pas évidente. (3) Par conséquent, il est important de prévenir la calcification vasculaire chez les patients atteints d’IRC à un stade précoce afin d’améliorer le pronostic de vie.

ce qui conduit à un afflux accru de P dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). L'afflux de P s'effectue via PiT-1, un transporteur à la surface de la membrane cellulaire des CMLV. PiT- est un membre de la superfamille des porteurs de soluté (SLC), qui comprend un transporteur de phosphate de sodium codé par SLC20A1.04. PiT- transporte le phosphate à travers les membranes cellulaires dépendantes du Na et par la suite la minéralisation de la matrice en raison des niveaux élevés de p.s) Comme intracellulaire Les niveaux de P augmentent, les CMLV commencent à exprimer des facteurs de transcription ostéogéniques, tels que le facteur de transcription 2 (Runx2) (16) lié à l'avorton. Cet effet est suivi par une expression accrue de gènes spécifiques aux ostéoblastes, tels que l'ostéopontine et l'ostéocalcine. De plus, l’expression des protéines spécifiques aux muscles lisses est réduite. comme la protéine musculaire lisse 22-0 (SM22-0), se produit. En conséquence, les CMLV se transforment en cellules de type ostéoblaste. (1718)Des études cliniques récentes ont montré que les taux sanguins de calcium. les particules protéiques (CPP), qui représentent les particules colloïdales de phosphate de calcium, augmentent avec la diminution de la fonction rénale. (19-21)De plus, des corrélations avec les taux sanguins de CPP et de P ont été rapportées.2o2i) Il est possible que le CpP déclenche la progression de la calcification vasculaire.22-24)

Cependant, une calcification vasculaire a été observée chez des patients atteints d'IRC à un stade précoce avec des taux plasmatiques de P normaux. (13) De plus, l'ARNm de PiT-1 est exprimé de manière omniprésente dans tous les tissus. Ainsi une autre molécule pourrait agir principalement dans le domaine de la calcification vasculaire. Il y a des rapports selon lesquelsinflammationfavorise la calcification vasculaire. Des facteurs inflammatoires tels que l'interleukine (IL)-1B, l'IL-6 et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) ont induit la différenciation des CMLV en cellules de type ostéoblaste (2s26). Le TNF-a induit une calcification vasculaire via la voie de l'AMPc, qui joue un rôle dans la différenciation des ostéoblastes.2728) L'IL-6 régule diverses voies menant à la calcification vasculaire des CMLV2-31) De plus. IllB, IL-6 et TNF-a sont également des facteurs associés à une augmentation de la calcification vasculaire induite par des niveaux de p élevés.3233) Cependant. les données actuelles n'expliquent pas complètement le mécanisme de la circulation

calcification induite par ces facteurs. Nous avons émis l'hypothèse qu'il pourrait y avoir d'autres molécules liées au P, telles que celles de la superfamille SLC, impliquées dans la calcification vasculaire. Nous nous sommes concentrés sur les protéines membranaires de la superfamille SLC et avons étudié des molécules potentielles liées au P autres que PiT-1 pour leur implication dans la calcification vasculaire. De plus, nous avons examiné la relation entre les molécules candidates et la calcification vasculaire en vidéo et in vivo.

Matériels et méthodes

Culture de cellules. Des cellules musculaires lisses humaines aortiques normales (AoSMC) ont été obtenues auprès de Lonza (Bâle, Suisse). L'AoSMC a été cultivée conformément aux instructions du fabricant. Les AoSMC ont été maintenues dans un milieu de croissance (milieu basal de cellules musculaires lisses additionné de 5 % de sérum bovin fœtal (FBS), facteur de croissance épidermique, insuline, facteur de croissance des fibroblastes B et gentamicine/amphotéricine B). Les médias étaient changés tous les deux jours. Les AoSMC ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 5 % de CO à 37 degrés et maintenues jusqu'à ce que la confluence soit atteinte, puis utilisées dans des expériences.

AoSMC calcifiée.La calcification de l'AoSMC a été induite comme décrit précédemment.435) Les AOSMC ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco additionné de 15 % de FBS et de pénicilline-streptomycine et cultivées avec 2,6 mM de P pendant 3, 6, 9, 12 et 14 jours. La concentration en P a été ajustée par le tampon P NaH, PO/Na et HPO. pH 7,2). Les autres AoSMC n'ont pas été cultivées avec 2,6 mM de P.

Puce à ADN. L'ARN total d'échantillons d'AoSMC cultivés et non cultivés avec 2,6 mM P ont été utilisés. L'ARN total 5,0 ug a été analysé à l'aide d'une puce à ADN (Agilent Technologies, Tokyo. Japon). SurePrint G3 Humain GE 8 x 60 000 ver. 2 Microarray a été utilisé pour examiner environ 26,000 gènes. Le rapport a été calculé en divisant le niveau d'expression d'AoSMC cultivé avec 2,6 mM pendant 12 jours par le niveau d'expression d'AoSMC non cultivé avec 2,6 mM P.

Puce à ADN

L'ARN total d'échantillons d'AoSMC cultivés et non cultivés avec 2,6 mM P ont été utilisés. L'ARN total 5,0 ug a été analysé à l'aide d'une puce à ADN (Agilent Technologies, Tokyo. Japon). SurePrint G3 Humain GE 8 x 60 000 ver. 2 Microarray a été utilisé pour examiner environ 26,000 gènes. Le rapport a été calculé en divisant le niveau d'expression sur AoSMC cultivé avec 2,6 mM pendant 12 jours par le niveau d'expression sur AoSMC non cultivé avec 2,6 mM de P.Expression de SLC37A2 dans une inflammation vasculaire. Pour induire une réponse inflammatoire dans l'AoSMC, les cellules ont été cultivées avec un milieu de croissance jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence, puis traitées avec 1 ugmL de lipopolysaccharides (LPS) (LPS d'Escherichia coli O111: B4 ; Sigma, St. Louis, MO) pendant 24 et 72 ans. 2,6 mM P. Les autres AoSMC n'ont pas été cultivées avec une analyse par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel. L'ARN total a été extrait de l'AoSMC traitée avec du LPS pendant 24 et 72 h et des cellules non traitées avec du LPS. La PCR quantitative en temps réel basée sur le vert SYBR a été réalisée en utilisant de l'ADNc synthétisé et un ensemble d'amorces approprié pour chaque gène cible avec le système de PCR en temps réel aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Les séquences d'amorces étaient les suivantes : IL humaine-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' et 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3' ; SLC37A2, 5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' humain et 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3' ; glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- et 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 et les niveaux d'expression de l'ARNm de SLC37A2 ont été calculés après normalisation avec GAPDH.Expression de SLC37A2 dans les AoSMC. Les cellules totales ont été extraites d'AoSMC non cultivées avec 2,6 mM P et de cellules AoSMC cultivées avec 2,6 mM P pendant 3, 6, 9, 12 et 14 jours. Une PCR en temps réel a été réalisée en utilisant l'ADNc synthétisé. Les séquences d'amorces étaient comme suit : Runx2 humain, 5-TGAGAGCCCGTTTCTCCAACCC-3' et 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Les niveaux d'expression d'ARNm de Runx2 et SLC37A2 ont été calculés après normalisation avec APPH.

Analyse par Western blot.

La protéine totale a été collectée à partir d'échantillons AoSMC cultivés dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l'analyse PCR en temps réel. Ces échantillons ont été lysés à l'aide d'une solution saline tamponnée Tris (pH 75) complétée par 5 % de NP-40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéase à 1 %. Les échantillons de concentration en protéines ont été mesurés à l'aide du kit de dosage de protéines BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). et la concentration a été ajustée par Western blot, 10 µg de protéine ont été séparés dans un gel de Polyacrylamide à 10 % en utilisant une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium. La membrane a été traitée avec l'anticorps SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) ou l'anticorps GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) comme anticorps primaires, incubée avec l'anticorps conjugué à la peroxydase de raifort lgG de lapin (R&D Systems, Minneapolis, MN) comme anticorps secondaire. et visualisé à l'aide d'Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Angleterre) et d'un analyseur d'images luminescentes (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Japon). La bande a été quantifiée à l'aide de lmagel.

Expérimental

Tous les protocoles d'étude ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Hyogo, École des sciences humaines et de l'environnement. Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de douze semaines ont été achetés auprès de Japan SLC (Shizuoka, Japon). Les rats ont été maintenus selon un cycle d'obscurité de 12-lumière, 12-h (09 :00-21 :00) et ont eu un accès libre à la nourriture et à l'eau extra pure.

Les régimes expérimentaux comprennent un régime témoin P (1,0 % P, 0,6Ca, 20 % de protéines), un régime à base d'adénine (0,75 % d'adénine , 1.0 % P, 0,6 %Ca, 2,5 % de protéines), un régime pauvre en P (LP) (0,2 % P,0 0,6 % de Ca, 10 % de protéines) et un régime riche en P (HP) (1,0 % de P, 0,6 % de Ca, 10 % de protéines) basé sur le régime AIN93-G (Oriental Levure, Tokyo, Japon) avec de la caséine comme source de protéines.3637) Il a été rapporté qu'un régime pauvre en protéines favorise la calcification vasculaire chez les rats atteints d'insuffisance rénale induite par l'adénine, une restriction protéique a donc été effectuée.3738)Avant le regroupement, tous les rats (n=23) ont été nourris avec un régime MF standard (levure orientale) pendant une semaine pour s'acclimater. À l'âge de 13 semaines, les rats ont été divisés en 2 groupes : le groupe témoin (n=5) et le groupe IRC induit par l'adénine (n=18). Le groupe témoin a reçu le régime P témoin pendant 6 semaines. . Le groupe CKD induit par l'adénine a reçu le régime à l'adénine pendant environ 3 semaines, puis a été divisé en 2 sous-groupes : le groupe CKD-LP (n=8) ou le groupe CKDHP (n=10). Les rats des groupes CKD-LP et CKD-HP ont reçu le régime LP et le régime HP pendant 3 semaines, respectivement, pendant la période expérimentale, la consommation alimentaire a été enregistrée quotidiennement. Pendant le régime à l'adénine, des échantillons de sang ont été prélevés dans la veine de la queue entre 10 h 00 et 11 h 00 une fois par semaine jusqu'à la deuxième semaine, puis une fois tous les 2 jours pour surveiller les taux plasmatiques. Pendant le régime LP ou le régime HP, des échantillons de sang ont été prélevés une fois par semaine. Des échantillons d'urine ont été collectés et le volume d'urine a été enregistré une fois par semaine. Les rats ont été sacrifiés sous anesthésie à l'isoflurane (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japon) et par laparotomies. Des échantillons de sang prélevés dans la veine cave inférieure et dans l'aorte thoraco-abdominale ont été prélevés pour analyse.

Expression SLC37A2 sur l'aorte.

Environ un tiers de l’aorte thoraco-abdominale collectée a été utilisé pour visualiser la calcification et effectuer une immunocoloration. L'aorte a été incluse dans de la paraffine et des coupes de 4-um ont été coupées. Les coupes ont été colorées à l'aide d'un kit de méthode Von Kossa pour le calcium (Polysciences. Warrington, PA) conformément aux instructions du fabricant. une analyse d'immunocoloration a été réalisée avec des coupes en série. Les coupes ont été incubées avec l'anticorps SLC37A2 pendant une nuit à 4 degrés, puis traitées avec Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japon) pendant 30 minutes à température ambiante. Par la suite, les coupes ont été traitées avec un kit DABsubstrate (Nichirei).

L'ARN total a été extrait du reste de l'aorte thoraco-abdominale congelée. La PCR en temps réel a été réalisée en utilisant l'ADNc synthétisé. Les séquences d'amorces étaient les suivantes : ostéopontine de rat, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' et 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' et ; rat SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' et 5'-CTGATGGGGCTTTCTGGACATG-3. Les niveaux d'expression de l'ARNm de l'ostéopontine et de l'ARNm de SLC37A2 ont été calculés après normalisation avec GAPDH

Analyses statistiques.

Les données sont présentées sous forme de moyenne + SE. Les différences entre les groupes ont été analysées à l'aide du test t. Dans les expériences d'AoSMC calcifiées induites par le phosphate, les différences ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle suivie de la méthode de Dunnett. Dans les expériences sur le modèle CKD, les différences ont été analysées à l'aide du test de Kruskal-Wallis suivi de la méthode Steel-Dwass. Les coefficients de corrélation (rs) ont été déterminés à l'aide du test de classement des coefficients de corrélation de Spearman. Pour tous les tests. valeurs p bilatérales<0.05 were considered statistically significant.