Imagerie par autoradiographie au fluorure de sodium [18F] de la néphrocalcinose dans les reins du donneur et les allogreffes rénales explantées

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Néphrocalcinoseest présent dans jusqu'à 43 % desun reinbiopsies d'allogreffe un an après la transplantation et est associée à une fonction inférieure du greffon et à une faible survie du greffon. Nous avons étudié l'imagerie [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF) des microcalcifications dans les reins des donneurs (n= 7) et explantéun reinallogreffes (n= 13). Des coupes en série de trois µm incluses dans la paraffine ont été utilisées pour l'évaluation histologique de la calcification (rouge d'alizarine; coloration de Von Kossa) et l'autoradiographie ex vivo [18F]-NaF. Les images ont été fusionnées pour évaluer si les zones de microcalcification correspondaient aux zones d'absorption de [18F]-NaF. D'après les analyses histologiques, des microcalcifications tubulo-interstitielles et glomérulaires étaient présentes dans 19/20 et 7/20 échantillons, respectivement. En utilisant l'autoradiographie, l'absorption de [18F]-NaF a été trouvée dans 19/20 échantillons, avec une activité de traceur significativement plus élevée dansun reinallogreffe par rapport aux échantillons de rein de donneur décédé (p {{0}}.019). La coloration au rouge d'alizarine des microcalcifications actives a démontré une bonne corrélation (rho de Spearman de 0.81, p <0,001), et="" la="" coloration="" de="" von="" kossa="" des="" calcifications="" consolidées="" a="" démontré="" une="" corrélation="" significative="" mais="" faible="" (0,62,="" p="0.003)" avec="" une="" activité="" [18f]-naf.="" cette="" corrélation="" entre="" l'absorption="" ex-vivo="" de="" [18f]-naf="" et="" les="" microcalcifications="" prouvées="" par="" histologie,="" est="" la="" première="" étape="" vers="" une="" méthode="" d'imagerie="" pour="" identifier="" les="" microcalcifications="" en="" phase="">néphrocalcinose. Cela peut conduire à une meilleure compréhension de l'étiologie des microcalcifications et de leur impact sur la fonction de transplantation rénale.

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Néphrocalcinose, défini comme un dépôt parenchymateux et tubulaire d'oxalate de calcium (CaOx) ou de phosphate de calcium (CaPhos), est un facteur important dans le déclin de la fonction du greffon aprèsun reintransplantation1–3. Les dépôts de CaOx et de CaPhos sont attribués à des niveaux élevés d'oxalate sérique, de calcium sérique et de phosphate sérique chez les patients atteints de maladie chronique.un reinet/ou hyperparathyroïdie4,5. L'incidence denéphrocalcinose, basé sur des biopsies d'allogreffe rénale, est de 6 % à 6 mois, de 25 à 43 % à un an et jusqu'à 79 % à 10- ans aprèsun reintransplantation5–7. Des études portant sur les biopsies d'allogreffe rénale dans l'année suivant la transplantation ont démontré une association entre la présence précoce de dépôts de calcium et à la fois une fonction inférieure du greffon et une faible survie du greffon4,8,9. Cependant, il reste à déterminer si ces microcalcifications jouent un rôle actif dans le dysfonctionnement de l'allogreffe ou sont simplement des indicateurs d'un métabolisme minéral dérégulé.

À ce jour,un reinLes biopsies d'allogreffe sont la seule méthode diagnostique pour évaluer les microcalcifications post-greffe. Une approche diagnostique non invasive et fiable permettrait des mesures répétées, facilitant le suivi des calcifications au fil du temps et des études d'intervention avec l'amélioration potentielle des résultats pour la fonction du greffon et la survie du greffon après une transplantation rénale10.

L'imagerie par tomographie par émission de positrons/tomodensitométrie (TEP/TDM) avec [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF) est utilisée dans la pratique clinique et les études expérimentales comme modalité d'imagerie squelettique et vasculaire11–15. Alors que la visualisation fiable des microcalcifications vasculaires est entravée par l'imagerie CT, les résultats de l'imagerie microPET [18F]-NaF ex-vivo sont bien corrélés avec les microcalcifications prouvées par histologie dans des échantillons vasculaires humains et animaux16,17. De plus, les résultats de plusieurs études cliniques prospectives ont montré que l'activité précoce du [18F]-NaF vasculaire était bien liée à la fois aux microcalcifications, détectées par imagerie CT, et plus intéressant, à l'augmentation de la taille de ces calcifcations18–20.

Nous présentons ici les résultats d'une étude d'autoradiographie de preuve de concept pour l'utilisation ex-vivo de l'imagerie [18F]-NaF denéphrocalcinosechez le donneurreinset les allogreffes rénales transplantées comme approche diagnostique pour la visualisation des microcalcifications.

Tableau 1.Un reincaractéristiques du greffé. Aucun cas d'hypercalcémie dans cette cohorte ; *classification de la classification Banf de la pathologie des allogreffes—201828 ; FSGS= Glomérulosclérose segmentaire focale ; IFTA=Fbrose interstitielle et atrophie tubulaire ; les résultats d'autoradiographie et d'histologie correspondants sont présentés dans le Supplément S1.

Tableau 2. Décédéun reincaractéristiques du donneur. *Maladie cardiovasculaire définie comme un événement cérébrovasculaire, un infarctus du myocarde, une maladie vasculaire nécessitant une intervention invasive ; **tel que noté par l'équipe d'approvisionnement ; Les résultats d'autoradiographie et d'histologie correspondants sont présentés dans le Supplément S2 ; aucun donneur atteint de diabète sucré.

Résultats

Cohorte d'échantillon.

Treizeun reindes échantillons ont été obtenus après transplantation, à une médiane de 33 [IQR 9–66] mois après la transplantation, à partir de receveurs d'un âge médian de 51 [IQR 30–64] ans. Une transplantation a été réalisée pour un rejet d'allogreffe (Banf IIA et IIB) chez sept patients, une artériopathie chronique d'allogreffe chez deux patients, une infection d'allogreffe chez deux patients, une non-fonction primaire chez un patient et une fibrose interstitielle et une atrophie tubulaire de grade III chez un patient. Huit patients sur 13 (61,5 %) souffraient d'hyperparathyroïdie, sept (53,8 %) souffraient d'hyperphosphatémie, cinq (38,5 %) souffraient de diabète sucré et aucun de ces patients ne présentait de signes d'hyperphosphatémie.néphrocalcinoseà l'échographie clinique ou un antécédent de calculs rénaux (Tableau 1). Sept échantillons de reins de donneurs décédés ont été obtenus, provenant de donneurs d'un âge médian de 65 ans [IQR 64–71] ans. Quatre donneurs sur sept (57,1 pour cent) avaient des antécédents de maladie cardiovasculaire, aucun n'avait de diabète sucré et six sur sept (85,7 pour cent) souffraient d'athérosclérose du système vasculaire rénal lors d'une inspection visuelle, qui sont des facteurs potentiels de refus de ces donneurs.reins(Tableau 2).

Figure 1. Image d'autoradiographie de l'absorption de [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF) (A), avec l'image superposée de l'absorption de [18F]-NaF avec coloration au rouge alizarine des microcalcifications (B) et coloration de von Kossa des calcifications (C).

Autoradiographie et histologie.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 pour cent dans 5 (25 pour cent) des 20 échantillons (Fig. 1 et Fig. 2A) (S1 supplémentaire et S2 supplémentaire, montrant l'autoradiographie et les images de superposition pour tous les échantillons). Le nombre de zones [18F]-NaF était significativement plus élevé dansun reinéchantillons d'allogreffe par rapport au donneur décédéun reinéchantillons, avec une médiane de 7.0 [IQR 4.0–15.5] et 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], respectivement (p=0.019) (S3 supplémentaire).

Des microcalcifications tubulo-interstitielles, visualisées avec une coloration au rouge Alizarine, étaient présentes dans 19 échantillons sur 20, avec une médiane de 5,5 [IQR 2–10.3] par échantillon, et des microcalcifications glomérulaires ont été observées dans sept sur 20 échantillons, avec une médiane de 1 [IQR 1–3] par échantillon (Fig. 2B). Un nombre significativement plus élevé de microcalcifications a été observé dans les échantillons d'allogreffe rénale par rapport aux échantillons de rein de donneur décédé, avec une médiane de 9.0 [IQR 5.0–20.5] et 4.0 [IQR 1.0–4.0], respectivement (p=0.046) (S3 supplémentaire). Avec la coloration de Von Kossa, des calcifications tubulo-interstitielles ont été observées dans 18 échantillons sur 20, avec une médiane de 2,5 [IQR 1–5] par échantillon, et des calcifications glomérulaires ont été observées dans sept échantillons sur 20, avec une médiane de 1 [IQR 0–3 ] par échantillon (Fig. 2C). Le nombre de calcifications n'était pas significativement différent entreun reindes échantillons d'allogreffe et des échantillons de rein de donneur décédé, avec une médiane de 4.0 [IQR 2.0–6.0] et 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], respectivement (p=0.311) (S3 supplémentaire). La reproductibilité interobservateur a été identifiée entre la détection visuelle et semi-automatisée des calcifications, avec un ICC de 0.94 (IC à 95 % 0.85–0.98) pour la coloration au rouge d'alizarine et de 0.77 (IC à 95 % 0.42–0.91) pour la coloration de Von Kossa.

Les images superposées des résultats d'autoradiographie et d'histologie ont montré une co-localisation de l'absorption de [18F]-NaF avec une coloration au rouge alizarine pour la microcalcification (Fig. 1B). En comparaison, les images superposées de l'absorption de [18F]-NaF et la coloration de Von Kossa des calcifications ont montré une absorption dans les zones sans calcifications prouvées par l'histologie (Fig. 1C). L'absorption faussement négative de [18F]-NaF, en tant que pourcentage de zones de (micro)calcification prouvées par histologie en dehors de la superposition, était médiane de 0 % [IQR 0–25 %] pour les zones rouges d'alizarine et médiane 100 % [65–100 %] pour les zones de Von Kossa. La coloration au rouge d'alizarine des microcalcifications a démontré une bonne corrélation avec l'absorption de [18F]-NaF (rho de Spearman de 0,81 (IC à 95 % 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 % d'absorption de [18F]-NaF (Fig. 4).

Figure 2. Image superposée de l'absorption de [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF) et des microcalcifications (rouge alizarine) (A), avec coloration au rouge alizarine pour les microcalcifications (B) et coloration de von Kossa pour les calcifications (C).

Caractéristiques du receveur au moment de la greffe.

Aucune différence n'a été observée entreun reinéchantillons d'allogreffes de patients avec (n{{0}}) ou sans hyperphosphatémie (n=6), pour le nombre de zones [18F]-NaF (médiane 5.0 [IQR 2.0–11.8] contre 7.0 [7.0–23.0], p=0.170) , Rouge d'alizarine (médiane 7,5 [IQR 5.0–14.0] versus 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390), et Von Kossa (médiane 5.0 [IQR 3.5–6.3] contre 3.0 [2.{ {59}}–5.0], p=0.247). La comparaison d'échantillons d'allogreffe rénale de patients avec (n=8) ou sans (n=5) hyperparathyroïdie n'a pas montré de différences, pour le nombre de zones [18F]-NaF (médiane 7.0 [IQR 4.0–7.5] versus 7.5 [4.0–23.0], p=0.459), Rouge Alizarine (médiane 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] contre 1{{103}}.0 [3.5–32.8], p{{76 }}.769), et Von Kossa (médiane 4.0 [IQR 1.5–5.0] contre 4.5 [2.0–6.8], p{{9{{ 131}}}}.505). Aucune différence significative n'a été identifiée entre les échantillons d'allogreffe rénale de patients avec (n=5) ou sans (n=8) diabète sucré, pour le nombre de zones [18F]-NaF (médiane 5,5 [IQR 2,5– 19,3] versus 7,0 [6,5–15,5], p=0.524), Rouge d'alizarine (médiane 10,0 [IQR 5,5–24,8] versus 9,0 [4,0–8,5], p=0.833), et Von Kossa (médiane 3,0 [IQR 2,0–5,8] versus 4,0 [3,5–8,5], p=0.284). Pour le temps entre la transplantation et la transplantation (mois), aucune corrélation significative n'a été observée avec le nombre de zones [18F]-NaF (p=0.586), le rouge d'alizarine (p=0.667) et Von Kossa (p=0.459). Pour l'âge au moment de la transplantation, aucune corrélation significative n'a été observée avec le nombre de zones [18F]-NaF (p=0.902), le rouge d'alizarine (p=0.798) et Von Kossa (p=0.798) =0.334). De même, aucune corrélation signifcative n'a été observée entre la durée de dia lyse (mois) aprèsun reinéchec de l'allogreffe et nombre de zones [18F]-NaF (p=0.481), rouge d'alizarine (p=0.565) et Von Kossa (p=0.174).

Figure 3. Corrélation du nombre de zones de [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF) avec les microcalcifications colorées au rouge Alizarine (A) et les calcifications colorées de von Kossa (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 % de surface de traceur [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF), pour le nombre de microcalcifications colorées au rouge d'alizarine (A) et de von Kossa, calcifications colorées (B) (médiane, intervalle interquartile).

Discussion

Dans cette étude de preuve de concept, l'absorption ex-vivo de [18F]-NaF chez l'hommeun reinles échantillons de parenchyme ont montré une bonne corrélation avec les microcalcifications prouvées par histologie. L'absorption de [18F]-NaF était plus fortement corrélée à la coloration au rouge alizarine pour les microcalcifications actives par rapport à la coloration de Von Kossa des calcifications consolidées, suggérant un rôle de l'imagerie [18F]-NaF dans l'identification des zones de néphrocalcinose à un stade précoce.

Les échantillons présentés représentent un mélange de cas de reins de donneurs et d'allogreffes de rein explantées. Ces deux types d'échantillons différaient en ce qui concerne la liaison du traceur, avec plus d'absorption de [18F]-NaF observée dans les échantillons d'allogreffe de rein explantés. Ceci est conforme aux publications précédentes, faisant état d'une augmentation des microcalcifications après transplantation rénale5–7. L'association denéphrocalcinoseavec une fonction inférieure du greffon au moment de la biopsie et un an après la transplantation est rapporté dans deux études sur la biopsie d'allogreffe rénale, avec 258 et 149un reingreffés respectivement8,9. De plus, dans une cohorte longitudinale de 97 greffés rénaux, une survie du greffon de 1-an et de 12-an significativement pire est observée chez les patients présentant des dépôts d'oxalate de calcium (c'est-à-dire une survie du greffon de 98,6 % contre 72,5 %). et 79,3 % contre 49,7 %, respectivement). En analyse de régression logistique multivariée, la présence de dépôts d'oxalate de calcium était indépendamment associée à la perte de greffon, dans un modèle incluant entre autres la créatinine au moment de la biopsie et le type de donneur4. Le rôle spécifique des microcalcifications dans cette cascade deun reinLe déclin de la fonction de l'allogreffe reste incertain. Dans le contexte clinique pré-transplantation, les dépôts de CaOx sont attribués à des niveaux élevés d'oxalate sérique, une molécule qui n'est pas efficacement éliminée pendant la dialyse4. Alors que les dépôts de CaPhos sont le plus souvent observés chez les patients souffrant d'hyperparathyroïdie et de taux élevés de calcium sérique, en raison d'un métabolisme minéral désordonné avant et après la transplantation5. Nous n'avons trouvé aucune différence dans les résultats histologiques et autoradiographiques pour l'hyperphosphatémie, l'hyperparathyroïdie, le diabète sucré, le délai entre la transplantation et la transplantation et la durée de la dialyse après l'échec de l'allogreffe rénale.

Pour le développement de nouvelles stratégies de traitement des microcalcifications actives cheznéphrocalcinose, sa pertinence clinique en ce qui concerne l'échec (chronique) de la greffe doit être mieux comprise. Avec l'identification d'une population cible de personnes à haut risqueun reingreffés, des études cliniques peuvent être conçues pour explorer des stratégies de traitement21. Un objectif possible pourrait être trouvé dans la régulation à la hausse des inhibiteurs endogènes de la calcification, avec un accent particulier sur l'ostéopontine3.

Étant donné la forte incidence denéphrocalcinoseet son association avec la fonction d'allogreffe rénale, une meilleure compréhension de l'étiologie des microcalcifications est justifiée. Une approche diagnostique non invasive et fiable pour identifier et quantifier les microcalcifications dans la néphrocalcinose précoce pourrait permettre des études sur l'impact de la néphrocalcinose sur la fonction de transplantation rénale. L'imagerie [18F]-NaF est intéressante, car l'absorption de [18F]-NaF dans les échantillons vasculaires humains et animaux est augmentée dans les zones de calcification biologiquement actives avant que ces zones puissent être visualisées par micro-tomographie16,17,22. Dans de récentes études cliniques TEP/TDM, il a été démontré que l'absorption de [18F]-NaF était liée à la progression de la calcification vasculaire, fournissant des preuves cliniques de l'utilisation de [18F]-NaF pour détecter les zones de calcification biologiquement active18–20. Les observations de cette étude sont conformes à ces découvertes antérieures dans le domaine de l'imagerie vasculaire. Une bonne corrélation entre l'absorption de [18F]-NaF et les microcalcifications prouvées par histologie a été démontrée, tandis que la corrélation avec les calcifications consolidées était nettement plus faible.

Comme indiqué, la co-localisation entre l'absorption de [18F]-NaF et les microcalcifications positives au rouge d'alizarine a été identifiée, tandis que les zones d'absorption de [18F]-NaF ne se sont pas co-localisées avec la coloration de Von Kossa des calcifications consolidées. Ces zones calcifiées, avec des calcifications consolidées et aucune absorption correspondante de [18F]-NaF, pourraient être considérées comme des zones de calcification inactive, où il n'y a pas de processus de minéralisation en cours, comme décrit précédemment par Irkle et al. dans une étude ex-vivo de la calcifcation carotidienne16. Bien que validé uniquement pour les calcifications vasculaires et non pourun reincalcifications du parenchyme, il est soutenu par les propriétés de liaison du [18F]-NaF à la surface externe des calcifications et sa pénétration limitée dans les calcifications solides. Par conséquent, l'absorption de [18F]-NaF sera plus élevée dans les microcalcifications, avec une grande surface, par rapport aux microcalcifications, avec un volume élevé mais une surface relativement petite13,16.

Cette étude de preuve de concept présente également certaines limites. Premièrement, inhérents à la conception de l'étude, les résultats représentent un point temporel unique, sans suivi clinique de la progression de la calcification. Deuxièmement, cette étude de preuve de concept consiste en un nombre relativement faible d'échantillons de rein, car la transplantation après échec tardif de la greffe n'est effectuée que sur indication clinique et la disponibilité du donneur refuséreinsl'utilisation pour la recherche est limitée23. Par conséquent, une analyse complète de l'étiologie des dépôts de calcium devrait être considérée au-delà de la portée de ce projet. Troisièmement, la traduction clinique des résultats est entravée par le manque de connaissances sur la distribution in vivo de [18F]-NaF dans les reins et l'effet de la clairance du traceur rénal, c'est-à-dire qu'une faible activité cible-bruit pourrait limiter la visualisation des calcifications. Pour résoudre ce problème, le moment optimal de l'imagerie TEP au [18F]-NaF doit être évalué, c'est-à-dire auquel le [18F]-NaF est réellement excrété et l'activité restante provient de la liaison aux zones calcifiées. Ceci peut éventuellement être réalisé avec une imagerie retardée supérieure à trois heures, comme cela est effectué pour l'évaluation des calcifcations coronaires24. Le taux de filtration glomérulaire réduit observé chez les receveurs de greffe pourrait entraîner une phase d'excrétion prolongée, nécessitant une période plus longue entre l'injection du traceur et l'imagerie TEP, mais les directives actuelles n'indiquent pas de néphrotoxicité potentielle du traceur [18F]-NaF11,25. Une étape potentielle entre l'étude de preuve de concept présentée ici et l'imagerie in vivo peut être l'imagerie TEP ex-vivo [18F]-NaF de reins perfusés normothermiques ou in vivo [18F]-NaF microPET études animales26,27. Quatrièmement, l'application clinique de cette technique pourrait être entravée par les coûts d'exécution d'une procédure [18F]-NaF PET/CT et l'exposition inhérente aux rayonnements. Cependant, les nouveaux systèmes de caméras TEP numériques avec une sensibilité plus élevée peuvent réduire les deux, en raison d'un temps de balayage plus court et d'une dose d'activité injectée plus faible.

La force de cette étude de preuve de concept réside dans la comparaison biunivoque détaillée des microcalcifications identifiées par autoradiographie [18F]-NaF et histologie. L'absorption de Te [18F]-NaF dans différents échantillons a pu être comparée sans nécessiter d'autres ajustements, car tous les échantillons ont été incubés dans la même solution de [18F]-NaF. De plus, cette étude fournit les premières données montrant une correspondance visuelle et statistique entre l'absorption de [18F]-NaF et les microcalcifications prouvées par histologie dans des échantillons de rein.

Fonction cistanche-rein

Pour conclure, nous fournissons les premières données pour l'utilisation de [18F]-NaF dans une étude d'autoradiographie pour identifier les microcalcifications en phase active.néphrocalcinoseaprèsun reintransplantation. Cette étude de preuve de concept ex-vivo [18F]-NaF est la première étape vers l'application potentielle de la TEP/TDM clinique au [18F]-NaF chez les receveurs de greffe de rein.

Méthodes

Humainun reinéchantillons.

Le tissu rénal a été obtenu après transplantation (n=13) et à partir de reins rejetés de donneurs décédés (n=7) en cas de déclin du rein du donneur par les centres de transplantation affiliés. Les données cliniques des receveurs et des donneurs de greffe de rein ont été extraites des dossiers médicaux des patients, y compris la présence d'hyperparathyroïdie, d'hyperphosphatémie et de diabète sucré avant la transplantation, et l'évaluation de la pathologie clinique des échantillons d'allogreffe rénale signalée à l'aide de la classification Banf de la pathologie de l'allogreffe rénale28. Les activités de recherche ont été menées conformément à la déclaration des principes éthiques d'Helsinki pour la recherche médicale impliquant des sujets humains et le comité d'examen institutionnel a approuvé cette étude (Comité d'éthique médicale University Medical Center Groningen 2015/501). Un consentement éclairé a été obtenu de tous les receveurs de greffe et une approbation préalable au don a été donnée pour l'utilisation de reins rejetés de donneurs décédés à des fins de recherche. Les activités cliniques et de recherche étaient conformes aux principes de la Déclaration d'Istanbul tels qu'énoncés dans la « Déclaration d'Istanbul sur le trafic d'organes et le tourisme de transplantation ».

La procédure opératoire standard (SOP) pour l'échantillonnage des tissus était la suivante : les échantillons ont été obtenus au bloc opératoire, immédiatement après l'extraction du rein (pour la transplantation) ou à l'arrivée du donneur rejetéun reindans notre centre de transplantation. Les échantillons utilisés pour cette expérience ont été prélevés dans le plan transversal du pôle supérieur, comprenant du tissu rénal cortical et médullaire, de taille comprise entre 25 mm x 15 mm et 20 mm x 40 mm. Ces échantillons ont été fixés au formol et inclus en paraffine. À l'aide d'un instrument de coupe de précision microtome, des coupes de trois µm incluses dans la paraffine ont été réalisées. Ces coupes ont été montées sur du verre de microscope à adhérence (TOMO, Matsunami Glass, USA). Des coupes en série, c'est-à-dire des coupes adjacentes qui révèlent des couches séquentielles duun reinéchantillons de tissus, ont été utilisés pour l'autoradiographie et l'analyse histologique. Avant l'incubation du traceur et la coloration histologique, les coupes ont été déparaffinées, réhydratées dans de l'eau déminéralisée et stockées temporairement dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).

Incubation de [18F]‑NaF et autoradiographie.

L'expérience ex-vivo était basée sur le protocole utilisé dans les études précédentes de Hop et al. et Reijrink et al.22,29. La première étude est une étude d'autoradiographie sur l'absorption de [18F]-NaF dans les plaques carotidiennes de patients victimes d'un AVC subissant une intervention chirurgicale, avec une indication de calcification basée sur la tomodensitométrie à titre de comparaison. La deuxième étude est une étude d'autoradiographie sur l'absorption de [18F]-FDG dans des échantillons de tissu adipeux, avec l'immunohistochimie de coupes en série à titre de comparaison. Une de chacune des trois coupes en série a été baignée dans une solution de [18F]-NaF, à une concentration de 618 millibecquerel (MBq) dans 300 ml de PBS, à température ambiante, pendant 30 min. Le lavage a été effectué par trois rinçages avec du PBS froid et deux fois avec de l'eau froide. Les échantillons ont été séchés à l'air libre et un écran de phosphore blanc a été placé sur les échantillons. L'exposition a été effectuée pendant la nuit, pendant une période de 24 h et 30 min. La détermination de la distribution et de l'intensité de l'activité tissulaire a été effectuée sur un écran phosphoreux à l'aide de l'imageur biomoléculaire Amersham Typhoon (GE Healthcare, Marlborough, États-Unis).

Rouge d'alizarine et coloration de von Kossa.

Une coloration au rouge alizarine a été réalisée pour visualiser l'accumulation de calcium au stade précoce de la calcification. Les échantillons ont été incubés dans une solution à 2 % p/v de rouge d'alizarine (dissous dans de l'eau déminéralisée), pH 4,2 pendant 5 minutes30. Le lavage a été effectué par 20 rinçages dans un mélange acétone/xylène 1:1 et 20 rinçages dans du xylène à 100 %. La coloration de Von Kossa a été réalisée pour visualiser la présence de molécules de phosphate inorganique dans les calcifications consolidées. En bref, les échantillons ont été incubés dans une solution à 1 % de nitrate d'argent (AgNO3) pendant 1 h, tout en étant exposés à la lumière du soleil30. Alternée par trois rinçages à l'eau déminéralisée, une incubation a été réalisée avec du thiosulfate de sodium pendant 5 min, suivie d'une incubation au rouge nucléaire rapide pendant 3 min.

Traitement et analyses d'images.

Les coupes de tissus colorées ont été numérisées avec le Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japon) et les images ont été inspectées à l'aide du logiciel Aperio ImageScope version 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Allemagne). L'autoradiographie et les analyses quantitatives d'images informatisées ont été réalisées avec le logiciel ImageJ, version 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

La soustraction de fond a été appliquée pour toutes les images d'histologie, en insérant un contour à la frontière de l'échantillon d'histologie. La détection semi-automatisée des calcifications dans la coloration au rouge d'Alizarine et de Von Kossa a été réalisée avec ImageJ—BioVoxxel Toolbox31. Des seuils ont été appliqués pour tous les échantillons et les zones de calcification détectées ont été dilatées avec 6 itérations, pour optimiser la visualisation. Pour les images d'autoradiographie, la rotation et le redimensionnement ont été effectués sur la base des échantillons d'histologie d'origine. Des seuils ont été appliqués pour tous les échantillons, ce qui a entraîné des zones d'absorption du traceur, selon l'approche décrite par Irkle et al. : les images ont été seuillées à l'aide de la méthode Otsu, suivies d'un flou gaussien et d'un seuillage avec la méthode Li16. Les images de superposition ont été acquises en faisant correspondre les contours des images d'histologie adjacentes, avec la mise en correspondance ultérieure des résultats d'histologie et d'autoradiographie (Fig. 1). La quantification basée sur les pixels de la calcification et de la zone de traceur (en pourcentage de la zone de l'échantillon) a été réalisée avec l'outil ImageJ—Analyze Particles.

Symptômes de la maladie de Cistanche-rein

Analyses statistiques.

Les statistiques ont été réalisées avec le package statistique pour les sciences sociales version 23 (IBM Corporation, Armonk NY, USA), les graphiques ont été réalisés avec GraphPad Prism 7.02 pour Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, USA) et les figures ont été produites avec Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San José, États-Unis). Les résultats ont été présentés sous forme de médiane et d'intervalle interquartile (IQR) pour les données asymétriques, et sous forme de fréquence et de pourcentage lorsque les données étaient catégorielles. Nous avons comparé les groupes à l'aide des tests U de Mann–Whitney (pvalue bilatérale<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Disponibilité des données

Rein de donneur décédé etun reinLes images d'autoradiographie du receveur de greffe de l'absorption de [18F]-fluorure de sodium ([18F]-NaF), avec les images superposées de l'absorption de [18F]-NaF avec la coloration au rouge alizarine des microcalcifications et la coloration Von Kossa des calcifications sont disponibles en ligne en tant qu'informations supplémentaires. Toutes les données supplémentaires seront mises à disposition sur demande, conformément aux réglementations IRB du University Medical Center Groningen.

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Remerciements

Ce projet de recherche est soutenu par une subvention de la Fondation De Cock-Hadders (code de projet 2018-03).

Les contributions de l'auteur

SB a contribué à la conception, à l'acquisition et à l'analyse, et a rédigé le manuscrit. IFA, MR et MLCB ont contribué à la conception, à l'acquisition et à l'analyse, et ont substantiellement révisé le manuscrit. SPB, CM et MHdB ont contribué à la conception et ont substantiellement révisé le manuscrit. JLH, RHJAS et RAP ont contribué à la conception, à la conception et à l'analyse, et ont substantiellement révisé le manuscrit.

Intérêts concurrents

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.