La solution UW additionnée de thiosulfate de sodium protège les greffons rénaux contre les lésions prolongées d'ischémie-reperfusion à froid dans un modèle murin de transplantation rénale syngénique

Contact : ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Cistanche tubulosa empêcheun reinmaladie, cliquez ici pour obtenir leproduits et Cistanche Nz

ABSTRAIT

Introduction:La lésion d'ischémie-reperfusion froide (IRI) est un événement inévitable qui augmente les complications post-transplantation. Nous avons précédemment démontré que la supplémentation de la solution de l'Université du Wisconsin (UW) avec des molécules donneuses de sulfure d'hydrogène (H2S) non approuvées par la FDA minimise l'IRI froid et améliore la fonction de greffe rénale après la transplantation. La présente étude examine si une molécule donneuse de H2S approuvée par la FDA, le thiosulfate de sodium (STS), aura le même effet ou un effet supérieur dans un modèle de rat cliniquement pertinent d'orthotopique syngéniqueun reintransplantation.

Méthode:Trente rats Lewis ont subi une néphrectomie bilatérale suivie d'une transplantation orthotopique syngénique du gaucheun reinaprès 24- heure de conservation dans une solution UW ou UW plus STS à 4 ◦ C. Les rats ont été surveillés jusqu'au jour 14 après la transplantation et sacrifiés pour évaluer la fonction rénale (débit urinaire, créatinine sérique et azote uréique du sang).Un reinles sections ont été colorées avec H & E, TUNEL, CD68 et myéloperoxydase (MPO) pour détecter la nécrose tubulaire aiguë (ATN), l'apoptose, l'infiltration de macrophages et l'infiltration de neutrophiles.

Résultat:Les greffons UW plus STS ont montré une amélioration significative de la fonction du greffon immédiatement après la transplantation, avec une meilleure survie du receveur par rapport aux greffons UW (p < {{0}}.05).="" l'examen="" histopathologique="" a="" révélé="" une="" réduction="" significative="" de="" l'atn,="" de="" l'apoptose,="" de="" l'infiltration="" des="" macrophages="" et="" des="" neutrophiles="" et="" une="" régulation="" négative="" des="" gènes="" pro-inflammatoires="" et="" pro-apoptotique="" dans="" les="" greffes="" uw="" plus="" sts="" par="" rapport="" aux="" greffes="" uw="" (p=""><>

Conclusion:Nous montrons pour la première fois que la préservation des greffons rénaux dans une solution UW complétée par STS protège contre l'IRI froid prolongé en supprimant les voies apoptotiques et inflammatoires, améliorant ainsi la fonction du greffon et prolongeant la survie du receveur. Cela pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique cliniquement applicable pour minimiser les résultats cliniques néfastes de l'IRI froid prolongé chezun reintransplantation.

Mots clés:Thiosulfate de sodium (STS) Lésion d'ischémie-reperfusion (IRI) Stockage frigorifique statique (SCS)Un reintransplantation Survie du greffon et du receveur

1. Introduction

Un reinla greffe est le traitement optimal du stade terminalun reinrénalmaladie (ESRD). Par rapport à la dialyse,un reinla greffe est supérieure, car elle offre une meilleure qualité de vie et confère un avantage de survie significatif ainsi que son rapport coût-efficacité [1–3]. Cependant, l'acquisition des reins du donneur est intrinsèquement associée à une lésion d'ischémie-reperfusion (IRI), une conséquence inévitable de l'arrêt et de la restauration ultérieure du flux sanguin pendant la transplantation [4]. La stratégie actuelle pour atténuer l'IRI induite par la transplantation est le stockage à froid statique (SCS) des greffons rénaux dans des solutions de conservation standard telles que la solution de l'Université du Wisconsin (UW) sur la glace à 4 ◦C pendant la période pré-transplantation [5]. Cependant, il a été démontré que le SCS prolongé est associé à une augmentation de la mort cellulaire, de l'inflammation et d'autres événements cellulaires et moléculaires dommageables, ce qui entraîne finalement une incidence accrue de fonction retardée du greffon (DGF), une nécrose tubulaire aiguë (ATN) et une diminution de la fonction du greffon. survie [6–10]. De plus, pour faire face à l'incidence mondiale croissante de l'IRT et au nombre toujours croissant de patients sur les listes d'attente de greffe, de nombreux centres de greffe acceptent les greffes rénales avec des périodes ischémiques froides prolongées, ce qui contribue davantage aux lésions tissulaires globales. La SCS suit la reperfusion, lorsque le sang oxygéné chaud est restauré dans la greffe ischémique froide. La reperfusion, qui est la phase effectrice de la lésion ischémique, se caractérise par une augmentation des lésions tissulaires [11–13].

Une stratégie thérapeutique potentielle pour limiter les IRI froides pendantun reinla transplantation implique la supplémentation d'une solution de conservation standard avec du sulfure d'hydrogène (H2S), un gazotransmetteur produit de manière endogène dont il a été démontré qu'il joue un rôle physiologique important dans la vasodilatation et la signalisation cellulaire [14-16]. Nous avons précédemment montré que le SCS prolongé dans une solution UW enrichie en H2S réduit l'IRI froid induit par la greffe et améliore la survie du greffon dans des modèles murins de transplantation rénale syngénique et allogénique [17-19, 41, 42]. Cependant, les molécules donneuses d'H2S utilisées dans ces études ne sont pas cliniquement viables. Cela a conduit à envisager l'utilisation de thiosulfate de sodium (STS), un médicament donneur de H2S approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour traiter la calciphylaxie chez les patients atteints d'IRT, la toxicité induite par le cisplatine dans le traitement du cancer et comme antidote à empoisonnement au cyanure [20–23]. Des études récentes ont montré que le STS présente des effets protecteurs dans des modèles animaux d'IRI [24–26]. Cependant, son effet sur l'IRI rénal froid induit par la transplantation est inconnu. Par conséquent, la présente étude examine les effets rénoprotecteurs du STS dans un modèle in vitro d'IRI rénal et un modèle de rat de transplantation rénale orthotopique syngénique.

2. Matériels et méthodes

2.1. Protocole expérimental in vitro

Un modèle in vitro d'hypoxie froide et de lésion de réoxygénation chaude qui imite les conditions cellulaires pendant l'IRI froid in vivo a été utilisé pour évaluer les effets protecteurs du STS pendant l'IRI rénale. Des cellules épithéliales rénales de rat (lignée cellulaire NRK{{0}}E ; ATCC, États-Unis) ont été utilisées dans les expériences in vitro car ces cellules sont sensibles aux lésions ischémiques [27] et leur utilisation est compatible avec le rat modèle de transplantation utilisé pour le deuxième objectif de cette étude. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) inactivé par la chaleur à 60 °C pendant 20 min et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S). Les cellules ont été incubées dans des conditions de croissance normales de 37 °C, 21 % d'O2 et 5 % de CO2. Les cellules témoins étaient dans des conditions identiques à celles des cellules pré-expérimentales. Les cellules expérimentales ont été traitées avec des milieux sans sérum (SF), SF plus 200 nM AP39 ou SF avec des concentrations variables (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) de thiosulfate de sodium pentahydraté (STS), qui ont été obtenus à partir de une solution injectable à 250 mg/mL de STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). Une concentration de 200 nM d'AP39 a été utilisée car nous avons précédemment montré qu'AP39 à cette concentration est cytoprotecteur contre la même lignée cellulaire dans un modèle similaire d'IRI froid [20]. Les cellules ont ensuite été incubées à 10 °C pendant 24 h dans des conditions hypoxiques (5 % de CO2, 0,5 % d'O2, 95 % de N2) dans la chambre d'hypoxie HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, USA) pour induire une lésion ischémique froide. Une température hypothermique de 10 ◦C a été utilisée car il s'agissait de la température la plus basse qui pouvait être atteinte technologiquement tout en maintenant un niveau d'hypoxie de 0,5 % d'O2. Après l'hypoxie, le support contenant des cellules expérimentales a été remplacé par un support de contrôle et les cellules ont été réoxygénées par incubation dans des conditions de croissance normales (37 °C, 21 % d'O2 et 5 % de CO2) pendant 24 h pour simuler la reperfusion et les lésions associées. Après 24 h de réoxygénation, la viabilité cellulaire a été évaluée par coloration des cellules avec de l'annexine-V conjuguée au FITC (FITC-Annexin-V ; BioLegend, États-Unis) et de l'7-aminoactinomycine D (7-AAD ; BioLegend, États-Unis ), qui mesure respectivement l'apoptose et la nécrose cellulaires. Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux à l'aide du CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA). La version 11 de FlowJo (FlowJo LLC, États-Unis) a été utilisée pour synchroniser correctement les données à des fins d'analyse statistique.

2.2. Animaux d'expérimentation

Trente rats Lewis mâles pesant 275 à 300 g et achetés à Charles River (St. Constant, QC, Canada) ont été hébergés dans les installations de soins aux animaux et de services vétérinaires de l'Université Western (London, ON) dans des conditions standard. Les études sur les animaux ont été approuvées par le Western University Council on Animal Care and Animal Use avec un protocole ID 2018-155.

2.3. Modèle de greffe de rein

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 % de perte de poids) ou la mort. Les paramètres humains ont été vérifiés deux fois par jour et tous les rats ont été euthanasiés par exposition au CO2 dans une chambre à un débit de 40 %. Au moment de l'euthanasie, il n'y avait pas de complications chirurgicales qui auraient pu entraîner des variations dans les résultats.

2.4. Analyse de la fonction rénale

Après transplantation rénale, les rats ont été surveillés dans des cages métaboliques pendant 14 jours puis sacrifiés. Des échantillons de sang et d'urine ont été prélevés aux POD 3, 5, 7, 10 et 14 pour déterminer les paramètres de la fonction rénale (créatinine sérique, azote uréique sanguin [BUN], osmolalité urinaire et débit urinaire). L'urée et la créatinine sérique provenaient de receveurs de greffe de rein et les rats opérés de manière fictive ont été mesurés à l'aide de l'analyseur de chimie IDEXX Catalyst One (Markham, ON). Les niveaux d'osmolalité urinaire ont été déterminés par osmométrie à point de congélation à l'aide de l'osmomètre 3320 (Advanced Instruments, Norwood, MA) et comparés aux normes fournies par l'entreprise.

2.5. Analyse histopathologique et morphométrique

Les tissus rénaux inclus en paraffine ont été coupés en sections de 4 µm d'épaisseur et montés sur des lames microscopiques pour l'histologie. Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E), du marquage terminal désoxynucléotidyl transférase dUTP nick end (TUNEL) pour déterminer respectivement le degré d'ATN et d'apoptose. Les sections H&E se sont vu attribuer un score pour l'ATN par un pathologiste rénal en aveugle selon le schéma suivant : 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 % d'ATN greffé. Des sections de rein ont également été colorées avec les anticorps primaires suivants : marqueur de lésion rénale (KIM-1), marqueur de surface des macrophages CD68 et enzyme myéloperoxydase spécifique des neutrophiles (MPO ; Abcam®, Toronto, Canada) et visualisées avec des anticorps secondaires et Chromogène de substrat DAB à l'aide du système Dako Envision (Dako, Glostrup, Danemark) selon le protocole du fabricant, puis analysé au microscope optique numérique Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) à un grossissement de 10x et quantifié par le logiciel ImageJ v. 1.8 (National Instituts de santé, Bethesda, MD).

2.6. Analyse PCR quantitative

L'ARN total a été isolé à partir de tissus de greffe rénale obtenus au POD 3 à l'aide du kit RNeasy® Mini (Qiagen, Toronto, Canada) et transcrit en ADNc à l'aide du kit de synthèse d'ADNc OneScript® Plus (ABM, Canada) en conjonction avec oligo(dT)12– 18 amorces selon le protocole du fabricant. L'ARN et l'ADNc isolés ont été analysés par nanogoutte (spectrophotomètre DeNovix DS-11, Canada) avant utilisation, avec des cotes A260/280 constamment > 1,95 et > 1,8 respectivement. Le mélange réactionnel de chaque échantillon qPCR avait un volume de 20 µL et a été préparé selon le protocole Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Canada) et analysé à l'aide de la machine CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Canada) . Les séquences d'amorces ont été conçues à l'aide du logiciel Primer-BLAST (NCBI) contre la bêta-actine, la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP), l'interféron gamma (IFN-), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-), l'interleukine 6 (IL -6), lymphome à cellules B 2 (Bcl-2), protéine X associée à Bcl-2- (BAX), caspase 3, agoniste de la mort du domaine d'interaction BH3 (BID), c-Jun Kinase N-terminale 1/2 (JNK1/2), coactivateur Pparg 1 alpha (PGC-1 ), complexe de mitochondries I (NDUFB8), complexe de mitochondries II (SDHB), protéine kinase activée par les mitogènes 1/2 (ERK1 /2), la lipocaline de la gélatinase des neutrophiles (NGAL) et les gènes de la molécule de lésion rénale -1 (KIM-1). Tous les gènes d'intérêt ont été normalisés par rapport à la bêta-actine. Les changements de pli de l'expression génique ont été comparés à des rats opérés par Sham et ont été calculés à l'aide de la méthode ΔΔCt.

2.7. analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du progiciel statistique GraphPad (La Jolla, CA) Prism, version 9.0. Les données de survie ont été analysées à l'aide d'une analyse de survie de Kaplan-Meier et d'un test de log-rank, tandis que les données d'expression des gènes qPCR ont été analysées à l'aide d'un test t unidirectionnel non apparié. Toutes les autres données ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post-hoc de Tukey pour déterminer les différences statistiques entre les groupes. La signification statistique a été acceptée à p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Résultats

3.1. Le milieu sans sérum supplémenté en STS améliore la survie des cellules épithéliales tubulaires rénales pendant l'hypoxie froide/la réoxygénation

L'analyse par cytométrie en flux après coloration pour l'apoptose et la nécrose a montré que les cellules NRK{{0}}E traitées avec SF pendant l'IRI froid in vitro présentaient une viabilité cellulaire significativement réduite par rapport aux cellules témoins (normoxiques) (Fig. 1A ; p < 0.05).="" alors="" que="" tous="" les="" échantillons="" expérimentaux="" ont="" montré="" une="" viabilité="" des="" cellules="" épithéliales="" tubulaires="" rénales="" significativement="" plus="" faible="" que="" les="" cellules="" cultivées="" dans="" des="" conditions="" normoxiques="" (p=""><0.05), les="" cellules="" traitées="" avec="" du="" sf="" additionné="" de="" 150 μm="" et="" 500 μm="" de="" sts="" ont="" présenté="" une="" viabilité="" significativement="" plus="" élevée="" que="" celles="" traitées.="" avec="" du="" milieu="" sf="" seul="" (fig.="" 1a;="" p=""><0, 05),="" ce="" qui="" correspondait="" à="" une="" apoptose="" nettement="" réduite="" par="" rapport="" aux="" cellules="" traitées="" avec="" du="" milieu="" sf="" seul="" (fig.="" 1b;="" p=""><0, 05).="" de="" plus,="" l'augmentation="" de="" la="" viabilité="" cellulaire="" et="" la="" diminution="" de="" l'apoptose="" semblent="" atteindre="" des="" niveaux="" optimaux="" avec="" 150="" µm="" et="" 500="" µm="" de="" sts,="" car="" une="" dose="" plus="" élevée="" a="" inversé="" ces="" tendances="" (fig.="" 1a="" et="">

3.2. La supplémentation en solution UW avec STS améliore la survie et la fonction précoces du greffon rénal

La conservation des greffons rénaux dans une solution UW enrichie en STS a considérablement amélioré la survie du receveur avec 83 % de survie jusqu'au POD 14 (jour du sacrifice) par rapport au groupe témoin sans supplémentation en STS, qui a montré une survie de 12,5 %, en particulier au cours des 3 premiers jours (Fig. 2A ; p < 0.05).="" de="" plus,="" la="" supplémentation="" en="" sts="" a="" nettement="" amélioré="" la="" fonction="" du="" greffon="" au="" début="" de="" la="" période="" post-transplantation="" par="" rapport="" au="" traitement="" uw="" seul.="" les="" niveaux="" de="" créatinine="" sérique="" et="" de="" bun="" ont="" augmenté="" de="" manière="" significative="" dans="" les="" groupes="" uw="" et="" uw="" plus="" sts="" au="" pod="" 3,="" ce="" qui="" était="" corrélé="" à="" une="" diminution="" de="" l'osmolalité="" urinaire="" par="" rapport="" à="" sham="" (figs.="" 2b,="" c="" et="" 3a ;="" p=""><0.{{25 }}5).="" cependant,="" les="" taux="" de="" créatinine="" sérique="" et="" d'urée="" dans="" le="" groupe="" uw="" plus="" sts="" ont="" significativement="" diminué="" le="" pod="" 3="" avec="" une="" augmentation="" correspondante="" de="" l'osmolalité="" urinaire="" par="" rapport="" au="" groupe="" uw="" (fig.="" 2b,="" c="" et="" 3a ;="" p=""><0, 05).="" fait="" intéressant,="" les="" niveaux="" de="" créatinine="" sérique="" et="" de="" bun="" dans="" le="" groupe="" uw="" plus="" sts="" ont="" diminué="" régulièrement="" de="" pod="" 3="" à="" pod="" 14="" avec="" une="" osmolalité="" urinaire="" accrue="" et="" étaient="" comparables="" à="" ceux="" de="" sham="" (figs.="" 2b,="" c="" et="" 3a).="" de="" plus,="" le="" débit="" urinaire="" dans="" le="" groupe="" uw="" plus="" sts="" était="" significativement="" plus="" élevé="" au="" cours="" des="" quatre="" premiers="" jours="" postopératoires="" par="" rapport="" aux="" groupes="" uw="" et="" sham="" (fig.="" 3b ;="" p="">< 0,05).="" cependant,="" il="" a="" diminué="" régulièrement="" vers="" la="" valeur="" de="" référence="" (sham)="" et="" était="" comparable="" à="" celui="" de="" sham="" au="" pod="" 14,="" tandis="" que="" la="" production="" d'urine="" chez="" le="" rat="" survivant="" du="" groupe="" uw="" est="" restée="" supérieure="" à="" la="" valeur="" de="" référence="" au="" pod="" 14="" (fig.="">

3.3. L'ajout de STS à la solution UW atténue la mort cellulaire induite par la transplantation après une transplantation rénale

Les sections de rein obtenues aux POD 3 et 14 ont été colorées avec TUNEL comme mesure de la mort cellulaire apoptotique et notées par un pathologiste rénal en aveugle (Fig. 4A). Les greffons rénaux du groupe UW présentaient une mort cellulaire apoptotique significativement plus élevée au POD 3, comme l'indique le score TUNNEL plus élevé par rapport aux reins des groupes UW plus STS et Sham (Fig. 5A et b ; p <0.{{11} }5).="" les="" greffes="" du="" groupe="" uw="" plus="" sts="" n'étaient="" pas="" significativement="" différentes="" de="" celles="" de="" sham="" au="" même="" moment="" et="" au="" pod="" 14="" (fig.="" 4b).="" de="" plus,="" alors="" que="" les="" greffons="" des="" groupes="" uw="" et="" uw="" plus="" sts="" ont="" montré="" des="" scores="" atn="" significativement="" accrus="" au="" pod="" 3="" par="" rapport="" au="" groupe="" sham="" (fig.="" 5 ;="" p=""><0.05), les="" greffons="" uw="" plus="" sts="" ont="" montré="" des="" scores="" atn="" diminués="" au="" pod="" 3="" par="" rapport="" à="" uw="" (fig.="" 5 ;="" p="">< 0,05).="" de="" plus,="" alors="" que="" les="" receveurs="" de="" greffes="" uw="" n'ont="" pas="" survécu="" au="" pod="" 14="" et="" que="" leurs="" scores="" atn="" n'ont="" donc="" pas="" pu="" être="" déterminés="" au="" pod="" 14,="" ceux="" des="" greffes="" uw="" plus="" sts="" ont="" survécu="" au="" pod="" 14="" mais="" ont="" montré="" des="" scores="" atn="" significativement="" plus="" élevés="" par="" rapport="" au="" groupe="" sham="" (fig.="" 5 ;="" p=""><>

3.4. Les greffons rénaux conservés dans une solution UW complétée par STS présentaient une diminution des marqueurs de blessure et de l'infiltrat inflammatoire après la transplantation rénale

Les sections de rein obtenues aux POD 3 et 14 ont été colorées avec du KIM -1 pour détecter une lésion tubulaire proximale ainsi que CD68 (marqueur de macrophages) et MPO (marqueur de neutrophiles) et notées par un pathologiste rénal en aveugle (Figs. 6A, 7A, et C). L'expression tissulaire rénale de KIM -1, CD68 et MPO était significativement plus élevée dans le groupe UW au POD 3 par rapport à celles des groupes UW plus STS et Sham (Figs. 6B, 7B et D ; p <{11} }.05)="" alors="" que="" l'expression="" de="" ces="" marqueurs="" dans="" les="" greffes="" uw="" plus="" sts="" n'était="" pas="" significativement="" différente="" par="" rapport="" à="" sham="" au="" pod="" 14="" (figs.="" 6b,="" 7b="" et="" d ;="" p =""> 0,05).

3.5. La supplémentation en STS de la solution UW a supprimé l'expression rénale des gènes pro-inflammatoires, pro-apoptotiques et mitochondriaux

L'expression génique des marqueurs pro-inflammatoires, pro-apoptotique, ciblant les mitochondries et les lésions rénales a été déterminée par qRT-PCR dans les reins transplantés obtenus le POD 3. Expression des gènes pro-inflammatoires IFN-, TNF- et IL{{8 }} ont été nettement augmentés dans les greffes UW par rapport aux greffes UW plus STS au POD 3 (Fig. 8A ; p <0.05) et="" ont="" suivi="" le="" même="" schéma="" avec="" les="" gènes="" pro-apoptotique="" parp,="" bax="" ,="" caspases-3,="" bid,="" jnk1="" et="" jnk2="" (fig.="" 8a ;="" p=""><0.05) tandis="" que="" l'expression="" de="" bcl="" anti-apoptotique="" -2="" était="" légèrement="" augmentée="" dans="" uw="" plus="" le="" groupe="" sts="" par="" rapport="" au="" groupe="" uw,="" bien="" que="" cette="" augmentation="" n'ait="" pas="" atteint="" une="" signification="" statistique="" (fig.="" 8a).="" de="" plus,="" l'expression="" des="" gènes="" mitochondriaux="" pgc-1,="" ndufb8="" (complexe="" i)="" et="" sdhb="" (complexe="" ii)="" dans="" les="" greffes="" uw="" était="" significativement="" réduite="" par="" rapport="" aux="" greffes="" uw="" plus="" sts="" (fig.="" 8b ;="" p="">< 0="" .05)="" tandis="" que="" l'inverse="" a="" été="" observé="" avec="" les="" expressions="" erk1="" et="" erk2="" (fig.="" 8b ;="" p="">< 0,05).="" de="" plus,="" l'expression="" du="" gène="" kim="" -1="" dans="" les="" greffes="" uw="" a="" été="" significativement="" augmentée="" par="" rapport="" aux="" greffes="" uw="" plus="" sts="" (fig.="" 8c ;="" p=""><0, 05)="" tandis="" que="" la="" diminution="" de="" l'expression="" de="" ngal="" dans="" les="" greffes="" uw="" plus="" sts="" n'a="" pas="" atteint="" une="" signification="" statistique="" par="" rapport="" à="" celle="" de="" greffes="" uw="" (fig.="" 8c="" ;="" p=""> 0,05).

4. Discussion

Cette étude établit la supplémentation de la solution de conservation standard avec STS, un donneur H2S cliniquement viable approuvé par la FDA, pour atténuer l'IRI rénal froid induit par la greffe, améliorer la qualité de la greffe et prolonger la survie du receveur. À l'aide d'un modèle in vitro d'IRI rénal et d'un modèle de rat de transplantation rénale orthotopique syngénique, nous démontrons pour la première fois qu'une supplémentation en solution UW avec STS pendant une SCS prolongée est protectrice pour les organes et les organes.

La principale découverte de notre modèle in vitro est que la supplémentation en STS dans un milieu sans sérum protège les cellules épithéliales rénales de l'hypoxie froide et de l'apoptose induite par la réoxygénation chaude et augmente la viabilité, ce qui est cohérent avec notre étude précédente où nous avons montré les effets protecteurs des mitochondries -médicament donneur ciblant l'H2S, AP39, dans un modèle in vitro d'IRI rénale froide [20]. Fait intéressant, une concentration plus élevée de STS de 1 mM a inversé les effets bénéfiques, ce qui implique que le STS présente un phénomène biphasique dose-réponse appelé hormèse, dans lequel une concentration plus faible est cytoprotectrice tandis qu'une concentration plus élevée est cytotoxique. Les lésions mitochondriales sont une conséquence majeure de l'IR rénal, car la perméabilité mitochondriale peut inhiber la production d'adénosine triphosphate (ATP) et augmenter la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), un médiateur destructeur des lésions tissulaires [13]. Il a été récemment suggéré que les mitochondries sont un site principal de l'activité STS. Non seulement le STS est connu pour générer du H2S dans les mitochondries via une réduction dépendante du glutathion et vice versa via la voie d'oxydation des sulfures, mais il préserve également la synthèse de l'ATP mitochondrial, diminue la production de ROS et améliore les activités enzymatiques complexes dans la chaîne de transport d'électrons (ETC) [24 ,28–30]. De plus, des études récentes ont montré que le STS augmentait significativement l'expression de PGC-1, un régulateur positif de la biogenèse mitochondriale et de la production d'ATP [26], ce qui est en accord avec notre observation in vivo. Ces mécanismes moléculaires pourraient expliquer l'expression significativement accrue des complexes ETC mitochondriaux I et II (NDUFB8 et SDHB respectivement) dans notre modèle de greffe de rein avec une survie et une fonction accrues, comme observé dans les greffons rénaux conservés dans une solution UW complétée par STS.

Sur la base de nos résultats in vitro, nous avons décidé d'étudier si l'effet protecteur du STS est applicable in vivo en utilisant un modèle de greffe où l'IRI froid est un contributeur majeur au dysfonctionnement du greffon et à l'augmentation des complications post-greffe. Nos résultats montrent que le SCS prolongé (24 h) des greffons rénaux dans une solution UW complétée par STS améliore significativement la qualité et la fonction du greffon, caractérisé par une diminution de la créatinine sérique et des taux d'urée, un débit urinaire plus élevé et une survie prolongée du receveur par rapport aux greffons conservés dans une solution UW seule. . Il est important de noter que l'immédiateté de la production d'urine même après une transplantation rénale clinique est un résultat critique qui détermine si la dialyse est nécessaire pour traiter la fonction retardée du greffon (DGF). Par conséquent, notre observation selon laquelle le STS augmente la production d'urine immédiatement après la transplantation et est comparable au groupe Sham au POD 14 est une découverte prometteuse. L'amélioration observée de la fonction rénale après la transplantation de greffons conservés dans une solution UW additionnée de STS a également conféré un avantage significatif en termes de survie. Quantitativement, la supplémentation en STS a prolongé la durée de vie de la greffe de sorte que 83 % (5/6) des rats qui ont reçu des greffes UW plus STS ont survécu jusqu'au POD 14 (jour du sacrifice) contre seulement 12,5 % (1/8) des rats receveurs de greffons conservés dans une solution UW sans supplémentation en STS. Cette découverte de la présente étude correspond également à notre étude précédente, dans laquelle seuls 14 % (1 sur 7) des rats receveurs de greffes ont été conservés dans une solution UW pendant 24 h sans supplémentation en H2S (GYY4137), ont survécu jusqu'au POD 14 [20] .

En plus de montrer une amélioration des paramètres de la fonction rénale, la supplémentation en STS a également inhibé l'apoptose et l'inflammation du greffon rénal en régulant à la baisse l'expression tissulaire des gènes pro-apoptotique et pro-inflammatoire tout en régulant à la hausse les gènes anti-apoptotique et en diminuant les macrophages CD 68- positifs et Les neutrophiles MPO-positifs, ce qui a entraîné une réduction de l'expression de KIM -1 et de l'ATN et a finalement préservé la morphologie rénale. Ces cytokines inflammatoires sont connues pour être des médiateurs de la mort cellulaire pendant l'IRI froid [31], et leur réduction des greffes UW plus STS est probablement due aux caractéristiques bien connues du STS pour diminuer la perméabilité endothéliale dans la monocouche endothéliale vasculaire, atténuer la production de cytokines , et induisent la production de cytokines anti-inflammatoires [32]. De plus, notre découverte selon laquelle la supplémentation en STS de la solution UW régule négativement l'expression des gènes pro-inflammatoires correspond à celle d'une étude précédente sur l'activité anti-inflammatoire du STS en réduisant les niveaux de TNF- et d'IL-6 dans les maladies neurologiques [33 ,34]. Mécaniquement, STS inactive la caspase-3 en se liant à son site actif via de fortes liaisons hydrogène et en empêchant ainsi l'accès du substrat naturel au site actif, stoppant finalement l'apoptose [35]. STS bloque également l'activation de JNK, une protéine qui joue un rôle essentiel dans la signalisation apoptotique [35], ce qui confirme notre découverte sur l'effet de régulation négative de STS sur la caspase3 et JNK. Cependant, nous ne sommes pas en mesure de déterminer si de tels mécanismes sont opérationnels dans la présente étude puisque nous n'avons pas effectué d'expériences supplémentaires pour explorer ces mécanismes moléculaires.

Une limitation majeure de notre expérience in vitro est notre défi technique d'utiliser la température de conservation standard actuelle de 4 ◦C [36], car les 10 ◦C que nous avons utilisés étaient la température la plus basse qui pouvait être technologiquement atteinte sans mettre en péril l'environnement hypoxique. Il s'agit d'une réelle différence en ce qui concerne les processus physiologiques cellulaires et aussi les techniques de conservation. Une solution potentielle consiste à utiliser l'hypoxie induite chimiquement dans un sac en plastique et à le placer dans un réfrigérateur à 4 ◦C afin de refléter les paramètres cliniques du SCS. Cependant, ces sacs de génération d'atmosphère anaérobie ont été conçus pour être utilisés à des températures chaudes (21–37 ◦C) puisque les composés chimiques qui induisent l'environnement hypoxique fonctionnent dans cette condition. Les études futures devraient viser à optimiser la température dans la chambre d'hypoxie pour imiter les paramètres SCS cliniques. Atteindre une température constante de 4 ◦C sans compromettre un environnement hypoxique nous permettra de déterminer si les phénotypes observés dans le modèle expérimental d'IRI froid in vitro sont exprimés de manière cohérente. Outre l'expérience in vitro, notre modèle de greffe de rat n'est pas non plus sans inconvénient. Nous avons effectué une transplantation rénale syngénique (donneurs et receveurs génétiquement identiques avec compatibilité immunologique), qui ne s'applique qu'aux jumeaux identiques en transplantation rénale clinique, alors que la plupart des transplantations rénales cliniques sont allogéniques (donneurs et receveurs génétiquement différents). La greffe allogénique oblige les receveurs de greffe à subir des tests immunologiques avant la greffe pour identifier les antigènes leucocytaires humains du donneur (HLA ; molécules qui induisent et régulent la réponse immunitaire), déterminer la compatibilité immunologique entre donneurs et receveurs et éviter le rejet d'organe [37,38]. Les futures études utilisant le STS devraient envisager la transplantation allogénique. Une autre limitation du modèle de greffe de rein est le fait que nous nous sommes concentrés sur les donneurs vivants, les greffons sous-optimaux provenant de donneurs après un décès cardiaque (DCD) deviennent de plus en plus courants comme source de reins de donneur dans de nombreux centres de greffe dans le monde [39]. Le DCD expose les organes du donneur à diverses périodes d'ischémie chaude en plus des périodes d'ischémie froide pendant le SCS, et est associé à des taux accrus de DGF et à une diminution de la survie du greffon par rapport aux donneurs vivants [40]. Par conséquent, les études futures devraient envisager le modèle de transplantation rénale DCD pour évaluer l'effet du STS contre l'IRI dans ce modèle.

En conclusion, notre étude démontre que la supplémentation d'une solution de conservation standard avec un médicament donneur H2S cliniquement viable pendant le SCS prolongé des greffes rénales protège contre l'IRI rénal froid induit par la greffe, améliore la qualité globale de la greffe et la fonction de la greffe, et prolonge la survie du receveur de greffe. Considérant que le risque de DGF augmente avec le temps d'ischémie froide prolongé dans la transplantation rénale clinique, ce qui soulève une préoccupation clinique majeure, l'observation que le STS protège les greffons rénaux pendant le SCS prolongé et prévient la DGF après la transplantation offre une grande promesse clinique qui pourrait diminuer ou prévenir le l'incidence de la DGF dans la transplantation rénale clinique dans un proche avenir. Ainsi, l'avantage futur de l'ajout de STS aux solutions de préservation peut présenter une solution potentielle à ce problème persistant. Dans l'ensemble, cette étude s'ajoute à la littérature croissante qui soutient les effets cytoprotecteurs du STS et d'autres donneurs de H2S contre l'IRI d'organe, améliorant en particulier les résultats de la greffe dans l'IRI rénale froide induite par la greffe. Ces stratégies pourraient faciliter l'utilisation d'un plus grand nombre de greffons exposés à des périodes d'ischémie froide prolongées, ce qui pourrait augmenter le pool d'organes transplantables.

Déclaration de contribution de la paternité du CRediT

Tous les auteurs ont accepté la soumission de ce manuscrit. Il n'y a pas de conflit d'intérêts.

Références

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Comparaison de la mortalité chez tous les patients dialysés, les patients dialysés en attente de transplantation et les receveurs d'une première greffe cadavérique, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., Revue systématique : transplantation rénale comparée à la dialyse dans les résultats cliniquement pertinents, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Rapport coût-efficacité de la transplantation rénale de DCD en Italie, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Lésion d'ischémie-reperfusion, Eur. J. Urgence traumatologie. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Préservation des organes : concepts actuels et nouvelles stratégies pour la prochaine décennie, Transfus. Méd. Hémère. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Ischémie froide et réduction de la survie à long terme des allogreffes rénales cadavériques, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo et al., Effets majeurs de la fonction retardée du greffon et du temps d'ischémie froide sur la survie de l'allogreffe rénale, Nephrol. Cadran. Une greffe. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Impact du temps d'ischémie froide sur la survie du greffon chez les receveurs de greffe ECD: une analyse rénale appariée, Am. J. Transplantation. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Facteurs de risque du receveur associés à une fonction de greffe retardée : une analyse rénale appariée, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Chaque heure supplémentaire de temps d'ischémie froide augmente significativement le risque d'échec de greffe et de mortalité suite à une transplantation rénale, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Antioxydants ciblés sur les mitochondries : perspectives d'avenir dans les lésions d'ischémie-reperfusion rénales, Oxid. Méd. Cellule Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Stress oxydatif causé par une surcharge mitochondriale en calcium, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Le rôle des mitochondries dans les lésions d'ischémie/reperfusion, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Rôle émergent des gazotransmetteurs dans la transplantation rénale, Am. J. Transplantation. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Sulfure d'hydrogène et signalisation cellulaire : joueur d'équipe ou arbitre ? Physique Végétale. Biochimie. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, L'effet vasorelaxant du H(2)S en tant que nouvel ouvreur de canal gazeux endogène K(ATP), EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Le traitement au sulfure d'hydrogène atténue les lésions d'ischémie-reperfusion de l'allogreffe rénale pendant la conservation au froid et améliore la fonction rénale précoce de la greffe et la survie après une transplantation rénale allogénique, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Le sulfure d'hydrogène supplémentaire protège la fonction rénale de la greffe et prolonge la survie du receveur après une lésion prolongée d'ischémie-reperfusion par le froid en atténuant l'apoptose du greffon rénal et inflammation, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian et al., Le sulfure d'hydrogène protège les greffons rénaux contre les lésions prolongées d'ischémie-reperfusion par le froid via des actions mitochondriales spécifiques, Am. J. Transplantation. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Thiosulfate de sodium pour l'intoxication aiguë au cyanure : une étude dans un modèle de rat, Ann. Pharm. Pr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Le thiosulfate de sodium protège de l'insuffisance rénale après une chimiothérapie intrapéritonéale hyperthermique (HIPEC) avec du cisplatine, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.