La spermidine atténue les dommages mitochondriaux myocardiques induits par l'hypoxie intra-utérine chez les rats en inhibant le stress oxydatif et en régulant le contrôle de la qualité des mitochondries Partie 1

Abstrait

Arrière-plan: L'hypoxie intra-utérine (IUH) augmente le risque de maladies cardiovasculaires chez la progéniture. En tant que piégeur d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), la polyamine spermidine (SPD) est essentielle à la survie et à la croissance embryonnaires et fœtales. Cependant, d'autres études sur la protection SPD et les mécanismes des lésions cardiaques induites par l'IUH chez la progéniture sont nécessaires.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une capacité de piégeage robuste des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à celle de la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages causés par les anions des radicaux libres thymine.

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Objectifs: Cette étude visait à étudier les effets préventifs du traitement prénatal SPD sur les lésions cardiaques induites par l'IUH chez les rats nouveau-nés et son mécanisme sous-jacent lié aux mitochondries.

Méthodes: Le modèle de rat d'IUH a été établi par exposition à 10 pour cent d'O2 sept jours avant le terme. Pendant ce temps, pendant sept jours, les rates gestantes ont reçu du SPD (5 mg.kg-1.j-1 ; ip). Les rats descendants d'un jour ont été sacrifiés pour évaluer plusieurs paramètres, notamment le développement de la croissance, les lésions cardiaques, la prolifération des cardiomyocytes, le stress oxydatif myocardique, l'apoptose cellulaire et la fonction mitochondriale, et ont un contrôle de la qualité mitochondriale (MQC), y compris la mitophagie, la biogenèse mitochondriale et fusion/fission mitochondriale. Dans des expériences in vitro, des cardiomyocytes primaires ont été soumis à une hypoxie avec ou sans SPD pendant 24 heures.

Résultats: IUH a diminué le poids corporel, le poids du cœur, l'expression cardiaque de Ki67, l'activité de SOD et les niveaux de CAT et d'adénosine 5'-triphosphate (ATP) et a augmenté l'expression de BAX/BCL2 et le nombre de noyaux positifs pour TUNEL. En outre, l'IUH a également provoqué une anomalie de la structure mitochondriale, un dysfonctionnement et une diminution de la mitophagie (diminution du nombre de mitophagosomes), une diminution de la biogenèse mitochondriale (diminution de l'expression de SIRT-1, PGC-1, NRF-2 et TFAM) et a conduit à un déséquilibre de fission/fusion (augmentation du pourcentage de fragments mitochondriaux, augmentation de l'expression de DRP1 et diminution de l'expression de MFN2) dans le myocarde. Étonnamment, le traitement SPD a normalisé les variations des paramètres induits par l'IUH. En outre, le SPD a également empêché l'accumulation de ROS induite par l'hypoxie, la dégradation du potentiel de la membrane mitochondriale et la diminution de la mitophagie dans les cardiomyocytes.

Conclusion: Le traitement SPD maternel a causé des lésions cardiaques induites par l'IUH chez les rats nouveau-nés en améliorant la fonction mitochondriale myocardique via l'anti-oxydation et l'anti-apoptose, et en régulant le MQC.

1. Origines

Des études épidémiologiques et animales indiquent qu'un environnement intra-utérin favorable est associé à un risque accru de maladies cardiovasculaires à l'âge adulte (1). L'hypoxie prénatale, l'environnement intra-utérin indésirable le plus courant, peut rendre le fœtus incapable de réaliser son potentiel de croissance génétiquement déterminé, se manifestant par un retard de croissance et une lésion de la fonction des organes au printemps(2). L'hypoxie fœtale chronique résulte souvent d'une grossesse avec augmentation de la résistance vasculaire placentaire comme la pré-clampsie, l'inter-grossesse à haute altitude ou les maladies respiratoires maternelles. Plus important encore, un tiers d'entre eux sont touchés par le syndrome d'hypoventilation d'apnées obstructives du sommeil (SAHOS) en fin de grossesse, et celui-ci est également associé au développement d'un syndrome d'hypertension gestationnelle. Le changement physiopathologique le plus critique du SAHS est l'hypoxie intermittente chronique (3, 4). Dans plusieurs modèles animaux, l'hypoxie intra-utérine (IUH) entraîne une réduction de l'efficacité cardiaque, un dysfonctionnement diastolique et systolique, une croissance hypertrophique, une diminution de la prolifération des cardiomyocytes et un retard de la maturation des cardiomyocytes dans le cœur fœtal et néonatal, augmentant ainsi le risque de troubles cardiaques chez la progéniture adulte ( 5). L'effet de programmation de l'hypoxie chronique peut principalement expliquer le mécanisme à des stades critiques du développement du cœur, qui entraîne une augmentation du stress oxydatif cardiaque et une augmentation de l'apoptose cellulaire chez la progéniture (6-9). Le concept de programmation développementale a du sens parce que notre physiologie est beaucoup plus malléable et plastique au début de la vie. La condition intra-utérine détermine et programme les concepts de physiologie et de métabolisme qui caractérisent notre vie. En conséquence, la réponse adaptative fœtale à l'IUH conduit au développement de maladies cardiovasculaires chez l'adulte (10). Les mitochondries sont des organites complexes jouant un rôle crucial dans la production d'énergie cellulaire et une myriade d'événements de signalisation de cave. L'intégrité structurelle et fonctionnelle des mitochondries est essentielle à la survie des cardiomyocytes et, lorsqu'elle est compromise, la perturbation de l'homéostasie mit-hondriale entraîne le développement de maladies carac. Récemment, plusieurs études se sont concentrées sur le rôle du dysfonctionnement mitochondrial chronique prénatal induisant l'hypoxie dans la médiation des lésions cardiaques de la progéniture. Il a été rapporté que cette fonction mitochondriale était altérée et que l'expression de plusieurs règles mol mitochondriales altérait le cœur périnatal exposé à l'IUH (11). De plus, l'IUH entraîne une diminution de l'activité des enzymes du complexe mitochondrial et un dysfonctionnement des tranches du cœur chez les descendants ultimes après une ischémie myocardique (12). En conséquence, cette étude visait à découvrir le lien moléculaire entre l'hypoxie prénatale, le stress oxydatif, la dysaction mitochondriale et les lésions cardiaques chez la nouvelle progéniture (13).

Le développement et la maturation de ce système mitochondrial à volume élevé dans le myocarde se produisent principalement aux stades de développement périnatal et postnatal, principalement en raison du changement métabolique cardiaque résultant de l'utilisation de glucose ou d'acides gras pour la génération d'adénosine 5'-triphosphate (ATP) après la naissance. (14). De nouvelles preuves suggèrent que les mécanismes de contrôle de la qualité des mitochondries (MQC) sont des déterminants essentiels de la maturation des cardiomyocytes (15). Le contrôle de la qualité mitochondriale, comprenant principalement la biogenèse mitochondriale, la mitophagie associée à la dynamique, un réseau de régulation finement réglé, orchestre la quantité et la qualité des mitochondries et améliore la fonction mitochondriale et la survie des cardiomyocytes dans des conditions de stress (16). Le coactivateur 1 (PGC-1) ​​des récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) joue un rôle essentiel dans la biogenèse mitochondriale et la fonction dans le cœur (17). Les proliférateurs de peroxysomes-activent les récepteurs coactivateurs 1 / (-/-) les cœurs de souris présentent les signatures du défaut de maturation et de l'anomalie grave de la fonction et de la densité mitochondriales (18). De plus, la suppression du médiateur de la mitophagie Parkin empêche la maturation morphologique et fonctionnelle des mitochondries au stade néonatal (19). Les mitochondries sont des organites hautement dynamiques, subissant des événements constants de fission et de fusion associés à leur fonction. À la fin de la période embryonnaire, l'ablation génétique spécifique à l'ac de la fusion mitochondriale pro dans MFN1 et MFN2 chez la souris présente un dysfonctionnement mitochondrial sévère après la naissance et développe une cardiomyopathie (20). De manière frappante, une étude récente a révélé que l'hypie chronique perturbait la dynamique mitochondriale dans le cerveau du fœtus et du porc (21). En conséquence, MQC peut agir comme un point focal dans le développement des lésions myocardiques chez la progéniture néonatale IUH. Cependant, on sait peu de choses sur les effets de l'hypoxie prénatale sur le système MQC cardiaque néonatal et sur l'effet du dysfonctionnement du MQC sur la santé cardiaque néonatale. Cette étude a repris cette mission pour explorer le mécanisme lié aux mitochondries des lésions myocardiques induites par l'IUH chez la nouvelle progéniture et explorer davantage les stratégies préventives pour réduire les lésions cardiaques de l'IUH.

Les polyamines (PA), y compris la putrescine (PU), la spermidine (SPD) et la spermine (SP), sont présentes dans presque tous les organismes vivants et sont essentielles à la survie, à la croissance et au développement de l'embryon et du fœtus (22-24) . Des études ont montré que les moutons exposés à l'IUH peuvent améliorer la dysplasie embryonnaire en complétant les polyamines exogènes (25, 26). En outre, le nombre croissant de publications indique le rôle des polyamines dans le piégeage des radicaux libres et la protection de l'ADN, des protéines et des lipides contre les dommages néfastes du stress oxydatif. Il est également révélé que la supplémentation en polyamines augmente la durée de vie des organismes modèles via des pro-essais antioxydants, anti-inflammatoires et induisant la mitophagie (27-29). Des études récentes ont montré que la supplémentation en SPD dans l'alimentation est cardioprotectrice et prolonge la durée de vie des souris et des humains en stimulant la mitophagie et la respiration mitochondriale et en améliorant la fonction cardiaque (30, 31). Plus important encore, nous avons précédemment signalé que l'exposition hypoxique maternelle au cours des derniers stades du développement fœtal entraînait une liste ana dased et un catabolisme accru des polyamines dans le tissu carac des rats nouveau-nés. Le SPD a empêché les lésions cardiaques chez les rats descendants de ven-day exposés à l'IUH en inhibant la mentation mitochondriale (32).

2. Objectifs

Dans cette étude, on suppose que l'IUH induit des déficits de structure et de fonction mitochondriales en augmentant le stress oxydatif et en détruisant le mécanisme MQC dans le cœur de la progéniture du nouveau-né, et le traitement SPD maternel in utero est supposé réduire les lésions myocardiques en diminuant le programme de développement des mitochondries. Cette étude peut contribuer au développement de stratégies préventives ou thérapeutiques pour les descendants d'IUH afin de prévenir les maladies cardiovasculaires chez l'adulte.

3. Méthodes

3.1. Animaux

Les rats Wistar mâles et femelles (âgés de 3 mois) ont été achetés au Département des animaux de laboratoire de l'Université médicale de Harbin. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'examen éthique de l'Université médicale de Harbin (Chine) et toutes les expériences ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health. Les rats avec un ratio mâle/femelle de 2 : 1 ont été placés au hasard dans une cage pour l'accouplement. Des frottis vaginaux ont été effectués le lendemain pour détecter la présence de spermatozoïdes dans les bouchons vaginaux ou les frottis vaginaux, ce qui a été confirmé comme le jour zéro de la grossesse. Les rats enceintes ont été gardées dans une pièce avec une humidité contrôlée (60 pour cent) et une température contrôlée (21 degrés), et le cycle lumière-obscurité était de 12 : 12 heures.

3.2. Modèle d'hypoxie intra-utérine

Du 15e au 21e jour de gestation, les rats du groupe hypoxie (n=10) ont été placés dans une chambre fermée en plexiglas, injectés d'air et d'azote, et surveillés par un analyseur d'oxygène (Pro OX12{{13 }} ; BioSpherix, New York, États-Unis), et inhalé avec une teneur en oxygène de 10 % pendant quatre heures par jour. Les échantillons de sang artériel ont été prélevés de l'artère fémorale droite, les valeurs de gaz sanguin et de pH ont été mesurées pour maintenir la pression partielle d'oxygène artériel de 50 - 55 mmHg, la saturation en oxygène du sang a été maintenue à 80 - 85 %, et des procédures spécifiques ont été réalisées comme décrit précédemment (32). Les rats femelles expérimentaux ont été divisés au hasard en quatre groupes : groupe témoin (témoin), groupe hypoxie intra-utérine (Hpx), groupe hypoxie intra-utérine plus spermidine (Hpx-Spd) et groupe hypoxie intra-utérine plus spermidine plus inhibiteur (Hpx-Spd-DFMO ). Six rats par groupe ont reçu une injection intrapéritonéale le 15e - 21er jour de grossesse. Les rats ont reçu une solution saline à 0,9 % (1 mL/kg/j) dans les groupes témoin et Hpx, du SPD (5 mg/kg/j) dans le groupe Hpx-Spd, et du SPD (5 mg/kg/j) et de la difluorométhy -L-ornithine (DFMO, un inhibiteur de l'enzyme clé de la synthèse des polyamines ODC) (5 mg/kg/j) dans le groupe Hpx-Spd-DFMO, respectivement. Après l'accouchement, des nouveau-nés 1- d'un jour ont été sacrifiés et leur cœur a été extrait pour des études expérimentales de suivi.

3.3. Analyse histologique

Le tissu ventriculaire gauche des rats a été coupé en une épaisseur < 1 cm, fixé avec du paraformaldéhyde à 4 %, déshydraté avec de l'alcool et inclus dans de la paraffine. La paraffine incorporée a été coupée en tranches de 5 mm d'épaisseur, puis séchée à une température de four constante de 60 degrés, déparaffinée avec du xylène et suivie d'une coloration à l'hématoxyline-éosine (HE). Les tranches de tissu ont été observées pour évaluer les changements dans la morphologie et les structures cardiaques avec un microscope optique (Eclipse E200; Nikon, Tokyo, Japon).

3.4. Analyse d'immunofluorescence

La coloration par immunofluorescence Ki67 a été réalisée comme décrit précédemment (33). En bref, le tissu ventriculaire gauche des rats a été fixé dans du formol à 4 %, inclus dans de la paraffine ; le déparaffinage, l'hydratation et la réparation des antigènes ont d'abord été réalisés. Ces tissus ont été bloqués avec 0.5 % d'albumine de sérum bovin pendant 2 heures, puis incubés avec l'anticorps monoclonal de lapin Ki67 (1 : 100, AF1738, Beyotime, Chine) à 4 degrés pendant la nuit. Après lavage avec du PBS, le tissu a été incubé avec de l'IgG de chèvre anti-lapin marqué au fluor Alexa (1: 500, A 0468, Beyotime, Chine) et contre-coloré avec du DAPI pour les noyaux. Les images ont été visualisées et scannées sous microscopie confocale laser (OLYMPUS, FV1000, Japon). Le logiciel a été utilisé pour analyser la colocalisation des images fusionnées.

3.5. Quantification de la fibrose

La fibrose cardiaque a été évaluée par la coloration au trichrome de Masson. Comme décrit ci-dessus, les sections de tissu cardiaque des rats nouveau-nés ont été déparaffinées et hydratées par des méthodes standard, puis colorées avec du trichrome de Masson selon les protocoles. Deux coupes transversales non adjacentes ont été utilisées pour chaque cœur. Le pourcentage de zone fibreuse dans la zone myocardique ventriculaire gauche totale a été analysé à l'aide du logiciel ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. Étiquetage dUTP Nick End et mesures de cellules apoptotiques médiées par TdT

Un test de marquage d'extrémité de coupure dUTP médié par TdT (TUNEL) a été utilisé pour déterminer le nombre de cellules apoptotiques dans les cœurs de rats nouveau-nés âgés d'un jour. Les tissus cardiaques ont été traités selon notre procédure décrite précédemment à l'aide d'un kit de détection de la mort cellulaire (Roche, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. Trois lames de chaque bloc ont été évaluées pour le pourcentage de cellules apoptotiques. Quatre champs de lames ont été examinés au hasard avec un grossissement de 200x. Au total, 100 cellules ont été comptées dans chaque champ.

3.7. Mesure de l'activité enzymatique antioxydante

L'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) a été mesurée à l'aide de kits commerciaux (SOD : A001-3- 1 et CAT : A007-1-1 ; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Chine) avec un spectrophotomètre (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, États-Unis). Selon les instructions du fabricant, l'opération était terminée et la concentration en protéines a été mesurée à l'aide de la méthode à l'acide bicinchoninique (Pierce, Rockford, États-Unis) avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme étalon (34).

3.8. Mesure de la teneur en adénosine 5'-triphosphate

La teneur en ATP dans le tissu cardiaque a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage de l'ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Chine). Selon les instructions du fabricant, le lysat a été ajouté en proportion selon le poids du tissu, homogénéisé avec un homogénéisateur en verre, puis centrifugé à 4 degrés 12000 g. Le surnageant a été prélevé et la teneur en ATP de chaque échantillon a été détectée avec un luminomètre (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) kit BCA (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Chine). La méthode à l'acide bicinchoninique a été utilisée pour déterminer la concentration en protéines puis convertir la concentration en ATP en nmol/g de protéine.

3.9. La microscopie électronique à transmission

Le tissu apical cardiaque a été disséqué en petits morceaux d'environ 1 mm × 1 mm × 1 mm, puis fixé dans un tampon phosphate de glutaraldéhyde à 4 degrés. Après déshydratation, trempage, enrobage et coloration de routine, les coupes ultrafines de 50 - 70 nm ont été réalisées. L'ultrastructure du tissu cardiaque a été observée au microscope électronique à transmission (TEM) et photographiée (H600 Hitachi, Tokyo, Japon). Des mitochondries et des myofilaments uniques ont été cartographiés sous la condition d'un grossissement de 10 000 fois avec la version 1.80 du logiciel Image J (National Institutes of Health), et leurs zones ont été mesurées à partir de chaque cœur (35). Entre-temps, des fragments mitochondriaux < 1 µm3, qui n'étaient pas divisés (généralement ronds), ont été identifiés et le pourcentage moyen de fragments mitochondriaux dans le champ de vision a été compté à l'aide de l'indice de fragmentation mitochondriale (MFI).

3.10. Isolement mitochondrial

Les mitochondries ont été isolées à 4 degrés par centrifugation différentielle avec un kit d'isolement des mitochondries (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine). En bref, du tissu cardiaque frais a été coupé en morceaux de tissu et centrifugé avec 10 volumes de PBS pré-réfrigéré, le surnageant a été jeté, le précipité a été digéré avec de la trypsine pendant 20 min, le tampon d'isolement A ajouté a été centrifugé, le surnageant a été transféré dans un autre tube, centrifugé à nouveau, et la fraction précipitée était la mitochondrie isolée. Le culot mitochondrial cardiaque final a été remis en suspension dans un tampon d'homogénéisation, stocké sur de la glace et utilisé pour des expériences sur la fonction de respiration mitochondriale dans les 4 heures.

3.11. Mesure de la consommation mitochondriale d'oxygène

La consommation d'oxygène mitochondriale a été mesurée par une électrode à oxygène de type Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, Royaume-Uni) dans un tampon de respiration mitochondriale. Le pyruvate (5 mM) et le malate (5 mM) ont été utilisés comme substrat pour les mitochondries contenant le complexe I à la concentration finale de 500 µg de protéine/mL. La consommation d'oxygène stimulée par l'ADP (respiration d'état 3) a été mesurée en présence d'ADP 200 µM, et la consommation d'oxygène indépendante de l'ADP (respiration d'état 4) a été surveillée. Le rapport de contrôle respiratoire (RCR, état 3 divisé par état 4) reflète la consommation d'oxygène par phosphorylation (couplage). Les procédures se sont poursuivies, comme décrit précédemment (36).

3.12. Analyse Western Blot

L'échantillon de tissus cardiaques a été récolté et stocké à -80 degré . Les tissus cardiaques ventriculaires gauches congelés ont été homogénéisés dans un tampon de lyse RIPA glacé (Beyotime Inc., Shanghai, Chine P0013B). Les concentrations de protéines ont été quantifiées à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime Inc., Shanghai, Chine P0006C). Les échantillons contenant les protéines totales ont été séparés par SDS-PAGE à 10 % (p/v) et transférés sur une membrane PVDF (Millipore, Bedford, MA, États-Unis). Les anticorps suivants ont été utilisés : Anticorps pour GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1-AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) et BAX (1.1000,509599-2-Ig) ont été achetés auprès de Proteintech (WuHan, Chine), BCL2 (1 : 2000, sc-7382) et DRP1 (1 : 1000, sc-271583) ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) et PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, Royaume-Uni). L'anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-lapin marqué à la peroxydase de raifort) provenait de Beyotime Corporation (Shanghai, Chine). Les intensités des bandes de protéines ont été quantifiées à l'aide d'un système d'imagerie sur gel Fluor Chem Chemiluminescence (Protein Simple, USA). La densité optique des bandes de protéines a été analysée avec le logiciel Image J version 1.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Modèle hypoxique de cardiomyocytes

Les cardiomyocytes de rat néonatal (NRMC) ont été isolés et cultivés par des méthodes standard, comme décrit précédemment (32). En bref, les cœurs des rats nouveau-nés de trois jours ont été extraits, hachés, cultivés, puis digérés dans 0.25 % de trypsine et 0.02 % d'EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine). Après centrifugation, les précipités ont été transférés dans du DMEM additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (Biolot, Russie) et incubés dans un air humide contenant 5 % de 2. Trois jours après avoir été ensemencés, les cellules ont été placées dans une chambre hypoxique en verre (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY), et remplie d'azote pendant 8 min pour évacuer l'oxygène résiduel. Ces cardiomyocytes ont été répartis au hasard dans les groupes suivants : (1) Groupe témoin (témoin), cellules cultivées dans des conditions normales d'incubation ; (2) groupe hypoxie (Hpx), cellules placées dans la chambre hypoxique pendant 24 h puis cultivées normalement pendant 24 h ; (3) groupe Hpx-Spd, cellules placées dans la chambre hypoxique et incubées avec 10 µmol/L SPD pendant 24 h ; (4) Groupe Hpx-SpdDFMO, cellules placées dans une chambre hypoxique et incubées avec 10 µmol/L de SPD plus 2 mmol/L de DFMO pendant 24h.

3.14. Mesure des espèces réactives de l'oxygène

La génération de ROS a été mesurée par le test de coloration au dihydroéthidium (DHE) (Cat No. S0063, Beyotime, Chine). En bref, les cardiomyocytes primaires ont été incubés avec 5 µmol/L de DHE à 37 degrés pendant 30 min, lavés avec du PBS, puis déplacés sous le microscope pour observer les changements d'intensité de fluorescence. Les images ont été prises avec un microscope à fluorescence Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japon) à une longueur d'onde d'excitation de 535 nm et la longueur d'onde d'émission maximale était de 610 nm, n > 20 cellules par groupe.

3.15. Détermination du potentiel de membrane mitochondriale

L'ester éthylique de colorant tétraméthylrhodamine (TMRE) est chargé positivement et peut être sélectivement localisé dans les mitochondries. Il est largement utilisé pour déterminer le potentiel de membrane mitochondriale (∆Ψm). En bref, une solution de travail de coloration TMRE à une concentration de 200 µmol/L a été ajoutée aux cardiomyocytes traités groupés, soigneusement mélangés et placés dans un incubateur de cellules à 37 degrés pendant 20 min. Le surnageant a été aspiré et les cellules ont été lavées avec du PBS et déplacées vers un microscope inversé pour observer le changement d'intensité de fluorescence. La longueur d'onde d'excitation était de 549 nm et la lumière d'émission était de 579 nm. L'intensité de la fluorescence rouge indiquait le changement de ∆Ψm, n > 20 cellules par groupe.

3.16. Expérience de localisation mitochondriale et lysosomale

Selon les instructions, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Chine) et Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Chine) ont utilisé l'analyse de colocalisation mitochondriale et lysosomale. Les NRCM ont été chargés avec 200 nM MitoTracker Green FM et 50 nM LysoTracker Red dans HBSS pendant 30 min avant les expériences, les cellules ont été lavées avec du PBS, puis des images cellulaires ont été obtenues à l'aide d'un microscope à fluorescence Olympus FluoView FV1000. La ligne laser à 488 nm a été utilisée pour exciter la fluorescence MitoTracker Green, mesurée entre 505 et 515 nm. Pour LysoTracker Red, la ligne laser à 577 nm a été utilisée avec une mesure de 590 nm. La superposition d'intensité des pixels rouges et verts a été déterminée à l'aide d'un logiciel de quantification sur le microscope Nikon Eclipse, n> 20 cellules par groupe.

3.17. Analyses statistiques

Toutes les données des groupes expérimentaux ont été comparées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie d'un test post hoc de Bonferroni avec la version 8 du logiciel GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) et la version 17.1 du logiciel SPSS (SPSS, Chicago, IL, United États). Les données ont été exprimées en moyenne ± SEM, et le niveau de signification a été fixé à P < 0.05.

4. Résultats

4.1. Progéniture et caractéristiques cardiaques

Le poids corporel (BW) et le poids cardiaque (HW) ont été mesurés, et le rapport HW à BW (HW/BW) a été calculé (Figure 1). Les résultats ont montré que le BW et le HW des rats nouveau-nés ont diminué et que leur HW/BW a augmenté en raison de l'hypoxie intra-utérine. Par rapport au groupe IUH, le BW et le HW des rats nouveau-nés du groupe SPD ont augmenté (P <0.05) et le HW/BW a diminué (P <0. 05 ); Par rapport au groupe SPD, le BW et le HW du groupe de traitement DFMO ont diminué (P < 0,05) et le HW/BW a augmenté de manière significative (P < 0,05).

4.2. Effets du SPD sur la structure morphologique myocardique, la prolifération cellulaire et la fibrose chez les nouveau-nés exposés à

Les résultats de la coloration HE cardiaque ont montré que les cœurs des descendants d'un jour exposés à l'IUH présentaient un gonflement et des fibres myocardiques lâchement disposées. Cependant, les cœurs IUH traités avec SPD ont maintenu une structure de tissu myocardique acceptable (figure 2A). Ensuite, nous avons évalué le nombre de cardiomyocytes binucléaires avec la tranche de tissu teintée HE ; le nombre de cardiomyocytes binucléaires était plus important dans le groupe IUH que dans le groupe témoin (P <0.05). Par rapport au groupe IUH, la proportion de cardiomyocytes binucléaires dans le groupe de traitement SPD a diminué de manière significative (P <0.05) ; DFMO a atténué l'effet de SPD (P <0.05) (Figure 2C). Nous avons en outre détecté l'expression de Ki67 (un marqueur de la prolifération cellulaire) dans le myocarde de rat en utilisant la méthode d'immunofluorescence. Plus l'expression de Ki67 est élevée, plus la fluorescence rose est forte en fusionnant le rouge et le bleu (figure 2E). Les résultats ont montré que par rapport au groupe témoin, l'expression de Ki67 dans le groupe IUH diminuait significativement (P < 0.05), l'expression de Ki67 augmentait significativement suite à l'administration de SPD (P < { {28}}.05), et l'effet de SPD a été aboli par DFMO (P < 0,05) (Figure 2F). Ces résultats indiquent que le SPD peut inhiber le retrait prématuré des cardiomyocytes du cycle cellulaire induit par l'IUH et favoriser la prolifération des cardiomyocytes chez la nouvelle progéniture exposée à l'IUH. Ensuite, nous avons utilisé la coloration de Masson pour détecter les changements dans la teneur en collagène myocardique et évalué la fibrose myocardique par mesure de la surface de collagène (Figure 2BandD). Nous avons constaté que le dépôt de collagène myocardique dans le cœur des rats nouveau-nés exposés à l'IUH augmentait (P < 0,05), dont le niveau était plus élevé par rapport au groupe témoin. Au contraire, la zone de fibrose myocardique suite au traitement SPD a significativement diminué (P < 0,05). Cependant, par rapport au groupe de traitement SPD, la zone de fibrose a augmenté de manière significative dans le groupe HpxSpd-DFMO (P < 0,05).

4.3. Effets de la spermidine sur la structure mitochondriale myocardique, la fonction respiratoire et la teneur en adénosine 5'-triphosphate chez les nouveau-nés exposés à l'hypoxie intra-utérine

Les modifications de la structure ultrastructurale du tissu cardiaque et des caractéristiques mitochondriales ont été analysées par TEM (figure 3A). Le logiciel Image J a été utilisé pour quantifier le pourcentage de contenu mitochondrial (zone mitochondriale dans toute la zone cellulaire) et la zone mitochondriale (figures 3B et C). Les résultats ont montré que dans le groupe témoin, les myofilaments myocardiques étaient disposés de manière ordonnée, la structure du sarcomère était claire, les mitochondries étaient compactes, la matrice était plus dense et les crêtes mitochondriales étaient disposées de manière ordonnée. Cependant, les mitochondries ont gonflé, et le relâchement de la matrice et la diminution de la densité ont été observés dans certains cardiomyocytes du groupe IUH. Par rapport au groupe témoin, la proportion de mitochondries dans les cardiomyocytes et la surface des mitochondries étaient toutes deux réduites (P <0.05). Cependant, dans les cœurs de rat du traitement SPD, les myofilaments myocardiques étaient nets, la structure du sarcomère était claire, la matrice mitochondriale était compacte et le gonflement mitochondrial diminuait. Par rapport au groupe IUH, la proportion de mitochondries dans les cardiomyocytes a augmenté (P <0.05) et la surface des mitochondries a augmenté (P < 0,05). Le DFMO a inhibé ces effets induits par le SPD (P < 0,05).

Nous avons utilisé le pyruvate/malate comme substrat pour évaluer la fonction respiratoire mitochondriale, y compris les taux respiratoires des états 3 et 4 et le RCR (Figure 3D - F). Nous avons remarqué que par rapport au groupe témoin, la fréquence respiratoire dans les états 3 et 4 et le RCR du groupe IUH étaient tous significativement inférieurs (P <0.{{10}}5). Fait intéressant, le RCR des états 3 et 4 s'est rétabli après le traitement SPD (P <0.05). En revanche, ces effets SPD ont été significativement inhibés dans le groupe de traitement DFMO (P <0.05). De même, par rapport au groupe témoin, la teneur en ATP du myocarde dans le groupe IUH significativement réduite (P < 0,05). Par rapport au groupe IUH, la teneur en ATP a remarquablement augmenté dans le groupe traité par SPD (P < 0,05) et le DFMO a atténué les effets du SPD (P < 0,05) (Figure 3G). Ces résultats suggèrent que le SPD peut protéger la structure et la fonction mitochondriales du myocarde et empêcher la baisse des niveaux d'ATP chez les rats nouveau-nés exposés à l'IUH.

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