Étude sur la fonction neuroendocrinienne de la Cistanche Deserticola et de ses produits de cuisson à la vapeur de vin de riz chez un modèle de rat induit par les glucocorticoïdes-Ⅰ

1. Présentation

Cistanche désertique, appelé « ginseng du désert », est une médecine traditionnelle chinoise utilisée depuis des siècles comme plante tonique yang pourrevigorer les reins et renforcer le yang[1]. Huit espèces et une variation deCistanche Herba ont été enregistrés en Chine et seulementCistanche désertiqueYC Ma etCistanche tubuleuse(Schenk) Wight sont enregistrés dans la Pharmacopée chinoise [2]. Des études pharmacologiques ont démontré queCistanches Herbaprésentait des effets neuroprotecteurs [3], immunomodulateurs [4], cardioprotecteurs [5], antifatigue [6], anti-inflammatoires [7], hépatoprotecteurs [8], antioxydants [9], antibactériens [10], laxatifs [11] et antitumoraux. effets [12]. Le large spectre d'activités biologiques signalées de ce genre a été attribué à sa composition phytochimique complexe et variée.Cistanche désertiquecontient des glycosides de phényléthanol, des iridoïdes, des polysaccharides [13], etc. La teneur en glycosides de phényléthanoïde est la plus élevée des matières médicinales d'origine [14].

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Le traitement de la matière médicale chinoise (CMM) est une technique pharmaceutique traditionnelle permettant de répondre aux différentes exigences de traitement, de distribution et de préparation selon la théorie de la médecine traditionnelle chinoise. Ces produits transformés sont appelés morceaux de décoction et sont utilisés en clinique. Le traitement vise à améliorer l’efficacité pour réduire la toxicité des médicaments bruts. La Pharmacopée chinoise de 2015 a enregistré que des tranches épaisses de Cistanche (CD) et du Cistanche cuit à la vapeur au vin de riz (WCD) pouvaient être utilisées comme morceaux de décoction en clinique. Notre groupe de recherche a montré que l'effet laxatif était atténué et que les effets anti-âge et revigorants sur le yang des reins étaient renforcés après que le Cistanche ait été cuit à la vapeur avec du vin de riz [15].

La fonction de l’axe hypothalamus-hypophyso-surrénalien-thymus (HPAT) est perturbée dans le syndrome de déficit rein-yang [16]. Les patients présentant un déficit rein-yang présentent également un dysfonctionnement immunitaire important. Le dysfonctionnement de l’axe HPA est étroitement lié à l’immunodéficience. La théorie des réseaux neuroendocriniens-immuns (NEI) montre que les systèmes immunitaire et neuroendocrinien partagent de nombreux ligands et récepteurs [17], et que l'hypothalamus est considéré comme le pivot pour relier le système neuroendocrinien au système immunitaire.

Dans cette étude, nous avons reproduit le déficit rein-yang chez des rats modèles avec injection de corticostéroïdes exogènes et exploré le mécanisme du déficit rein-yang en réponse à différents produits transformés de Cistanche deserticola du point de vue de la fonction endocrinienne-immunitaire.

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériaux et réactifs

Cistanche deserticola a été collectée auprès d'Alashan Neimenggu en 2019.5 et identifiée comme étant les tiges charnues séchées de Cistanche deserticola YC Ma par le professeur Yanjun Zhai (École de pharmacie, Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning, Chine). Les spécimens de référence ont été conservés au Centre technologique d'ingénierie de transformation du Liaoning.

Les composés standard d'ajugol ont été achetés auprès de Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Chine); cistanoside F,échinacoside, cistanoside A et isoacteosideont été achetés auprès de Must Company (Sichuan Chine); l'actéoside a été acheté auprès de Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Chine). L'acétonitrile et le méthanol de qualité MS ont été achetés auprès de Merck KGaA (Darmstadt, Allemagne). L'acide formique de qualité HPLC a été acheté auprès de Merck KGaA (Darmstadt, Allemagne). Le vin de riz a été acheté auprès de Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Chine).

Corticostérone (CAS : 50-22-6, pureté > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pilules de chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), ACTH de rat, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 et IL-10 Les kits de détection ELISA ont été achetés auprès de Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Le kit ELISA de cortisol de rat a été fourni par BOSK Co., Anticorps CD4 de rat, anticorps CD8a (nos 561833 et 559976), lysat de globules rouges (Solarbio, R1010), solution tampon PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM et amorces -actine en amont et en aval ont été fournis par le kit de transcription inverse de Guangzhou Invitrogen Co. (n° RR037A) et le kit de synthèse d'ADNc (n° 10000068167) ont été fournis par Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroforme, isopropanol, éthanol à 75 % et uréthane Les solutions étaient toutes pures analytiquement et produites par Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. L'eau ultrapure a été produite par le système Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Instruments expérimentaux

Un marqueur enzymatique (Thermo, modèle 3530911931), un laveur de plaques automatique (modèle HBS- 4009), un compteur de force push-pull à affichage numérique (modèle VICTOR- 50N), une centrifugeuse de congélation à grande vitesse (modèle Sigma 3k15 ), spectrophotomètre ultramicro (modèle B-50Q), amplificateur de gènes (modèle L96G), PCR quantitative par fluorescence en temps réel (modèle StepOne), cytomètre en flux (modèle AC66051710132), microtome à paraffine (modèle Laika), microscope (Olympus , modèle BS-53) et un instrument à eau pure (modèle F7JA36507) ont été utilisés.

2.3. Préparation d'échantillons pour UPLC-Q-TOF-MS et expériences pharmacologiques

Le WCD a été traité à partir du même lot deCistanche désertiquedans notre laboratoire. Pour la préparation du WCD, des morceaux de CD secs (5 mm d'épaisseur) (100 g) ont été infusés avec du vin de riz (30 ml), cuits à la vapeur à haute pression (1,25 kPa) pendant 4 h, puis séchés à 55 degrés.

Les poudres grossières de CD et de WCD ont été trempées dans 1 0 fois d'éthanol à 95 % pendant 0,5 h, extraites au reflux 3 fois à chaque fois pendant 1 h, filtrées et les filtrats ont été combinés 3 fois. L'éthanol a été récupéré sous pression réduite et l'extrait a été obtenu pour administration. L'extrait (1 ml) a été ajouté à 50 % de méthanol, portant le volume total à 20 ml, et stocké à 4 degrés pour l'analyse du contenu.

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2.4. Conditions UPLC-QqQ-MS pour l'analyse des extraits de CD et WCD

2.4.1. Conditions analytiques LCThMS

Le système UPLC-MSThMS avec le logiciel MassLynx 4.1 Analyst a été utilisé pour effectuer l'acquisition et le traitement des données. La colonne analytique était une Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) à une température de 40 degrés C. La phase mobile était une solution aqueuse d'acide formique à 0,1 % (A) et de l'acétonitrile contenant 0,1 % d'acide formique (B). Le gradient d'élution était de 0,00–1,00 min avec 3 % de B, 1,01–2,00 min avec 3 %–11,5 % de B, 2,01–3.{{29 }} min avec 12 % de B, 3,01 à 4.00 min avec 15 % de B, 4,01 à 5.00 min avec 20 % de B, 5,01 à 6.00 min avec 22 % B, 6,01 à 8,00 min avec 25 % de B et 8,01 à 9,00 min avec 10 % de B. Le débit était de 0,3 mLTh min et le volume d'injection était de 1,0 μL.

Le spectromètre de masse triple quadruple Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI) a été utilisé en mode ions négatifs. Le gaz de désolvatation était de l'azote avec un débit de 500 LThh à une température de 250 degrés. Tous les composés détectés ont été mesurés en mode de surveillance des réactions multiples (MRM) ; Le tableau 1 montre les paramètres énergétiques et le tableau 2 montre les courbes d'étalonnage des composants analysés.

2.4.2. Préparation des substances de référence

Tubuloside A (3,02 mg), échinacoside (3,00 mg), 2′-acétylactéoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside F ( 2,14 mg), le salidroside (3,39 mg), l'acide géniposidique (2,84 mg), l'ajugol (1,58 mg) et le catalpol (2,39 mg) ont été dissous dans du méthanol pour préparer une solution mère. La solution mère a été diluée avec du méthanol pour obtenir les concentrations appropriées pour les solutions étalons de travail. Toutes les solutions préparées ont été conservées à 4 degrés avant utilisation.

2.5. Préparation et regroupement de modèles animaux

Des rats mâles SD (180 à 220 g) ont été achetés auprès de Liaoning Changsheng Biotechnological Co., numéro de permis d'animal : SCXK (Liao) 2015-0001. Tous les rats ont été maintenus avec libre accès à de la nourriture et à de l'eau à 25 degrés et une humidité relative de 30 à 50 %. Les animaux ont été hébergés pendant 7 jours avant les expériences.

Cent rats ont été répartis au hasard en 10 groupes : groupe témoin à blanc (BC), groupe témoin modèle (MC), groupe témoin positif (PC), groupe témoin au vin de riz (WC), groupe CD à haute dose (CD -HD), le groupe CD à dose moyenne (CD-MD), le groupe CD à faible dose (CD-LD), le groupe WCD à dose élevée (WCD-HD), le groupe WCD à dose moyenne (WCD-MD) et Groupe WCD à faible dose (WCD-LD). Les doses de CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD et CD-LDThWCD-LD étaient respectivement de 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) et 1,37 gTh (kg ∙ d). La dose pour le groupe PC était de 1,646 gTh(kg ∙ d) et pour le groupe WC, de 1 mLTh100 g pendant 40 jours. Le 6ème jour après l'administration, les rats ont reçu une injection sous-cutanée de la suspension aqueuse de corticostérone (corticostérone + 0,1 % de diméthylsulfoxyde + 0,1 % de Tween-80 + 0,9 % de chlorure de sodium) sauf pour le groupe BC [18]. La concentration de corticostérone était de 5 gThL et la dose était de 0,1 mLTh100 g. Les rats du groupe BC ont reçu une solution saline normale + 0,1 % de diméthylsulfoxyde + 0,1 % de Tween- 80 + 0,9 % de chlorure de sodium par injection à la même dose.

2.6. Détermination des fonctions de l'axe HPA

2.6.1. Test de poids, de température et de puissance de maintien

Un test de poids a été effectué tous les 3 jours et la température a été prise tous les 6 jours. pendant l'expérience. Au 39ème jour, la force maximale du membre postérieur a été mesurée par un gripmètre. Les rats ont été placés sur des plates-formes lisses, obligeant leur membre postérieur à saisir le poteau. Les rats saisiront instinctivement n’importe quel objet pour éviter de reculer lorsque la queue est tirée jusqu’à ce que la force de traction dépasse la prise. Lorsque le rat perdait son emprise, le préamplificateur pouvait enregistrer automatiquement la force de préhension maximale.

2.6.2. Détermination du niveau de T, CRH, ACTH, CORT et cortisol dans le sérum

Une heure après la dernière administration, les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale d'une solution d'uréthane (20 gTh100 mL). Ensuite, les échantillons de sang ont été collectés, centrifugés à 3 500 r pendant 15 minutes pour obtenir le sérum et conservés à -20 degrés. Les concentrations de T, CRH, ACTH, CORT et cortisol ont été mesurées avec des kits ELISA pour rat conformément aux instructions du fabricant.

2.6.3. Observations au microscope

La structure morphologique du tissu des glandes surrénales a été observée par coloration HE. Le tissu surrénalien a été fixé dans du paraformaldéhyde à 10 %, déshydraté dans de l'éthanol, rendu transparent par une solution de xylène, incorporé par des méthodes conventionnelles, coupé en tranches de 4 µm d'épaisseur, déciré avec une solution de xylène, hydraté avec le gradient d'éthanol, puis coloré à l'hématoxyline et à l'éosine. solution de coloration. Après avoir été rendue transparente avec du xylène, la plaque a été scellée avec de la gomme neutre et observée au microscope.

2.6.4. Coloration immunohistochimique de l'expression des protéines Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas et FasL dans la glande surrénale

Des coupes surrénales de rat fixées au formol et incluses en paraffine ont été déparaffinées et réhydratées après avoir été coupées à une épaisseur de 4 µm. Pour bloquer l'activité de la peroxydase endogène, les coupes ont été préincubées dans un bloc de peroxyde d'hydrogène pendant 1 0 min. Les coupes ont été plongées dans du citrate de 0,01 M (pH 6,0) et chauffées jusqu'à ébullition. Le processus a été répété après 5 à 10 minutes. Après refroidissement, les coupes ont été lavées avec du PBS (pH 7,2 à 7,6) 1 à 2 fois, laissées à température ambiante pendant environ 5 minutes et lavées avec du PBS (pH 7,2 à 7,6) 2 à 3 fois. La solution de blocage à 5 % de BSA a été ajoutée à température ambiante et l'excès de liquide sur la coupe a été secoué 20 minutes plus tard. Des anticorps primaires dilués spécifiques de FasTh FasL, Bcl-2ThBax et caspase-3 (dilués au 1:100 avec du PBS) ont été ajoutés et incubés à 37 degrés pendant 1 h ou 4 degrés pendant la nuit. Les coupes ont été lavées 2 à 3 fois avec du PBS (pH 7,2 à 7,6). Ensuite, des IgG de chèvre anti-souris biotinylées ont été ajoutées et les coupes ont été séchées à 20-37 degrés pendant 20 min et lavées avec du PBS (pH 7,2-7,6) 4 fois pendant 5 min. Après un lavage minutieux dans du PBS, les coupes ont été incubées avec un mélange de réactifs A et B pendant 30 min, incubées avec du PBS pendant 45 min, et enfin développées avec un substrat DAB (DAKO) pendant 30 min avant d'être légèrement contre-colorées à l'hématoxyline, déshydratées, et monté.

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2.7. Détermination des fonctions immunitaires

2.7.1. Calcul de l'indice des organes immunitaires

Une heure après la dernière administration, les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale d'une solution d'uréthane (20 gTh100 mL), puis la rate et le thymus ont été prélevés et pesés immédiatement sous une hotte stérile. Les coefficients de poids de la rate ou du thymus (%) � poids de la rate ou du thymus (mg) Poids corporel (g).

2.7.2. Détection des sous-ensembles de lymphocytes T dans le sang périphérique

Les splénocytes et hémocytes ont été incubés avec les anticorps monoclonaux anti-CD4 (PE) et anti-CD8 (FITC) pendant 30 min dans l'obscurité. 2 ml de lysat érythrocytaire ont été ajoutés et la solution a été mélangée au vortex. La solution a été laissée à l’obscurité pendant 10 minutes et centrifugée pendant 5 minutes. Le surnageant a été jeté, puis la solution a été lavée 3 fois avec du PBS glacé et remise en suspension dans une solution perméabilisante de PBS. Au moins 10 000 cellules ont été analysées par cytométrie en flux dans l'heure suivant chaque coloration au Mab.

2.7.3. Détermination du niveau d'IL-10, d'IL-6, d'IL-2, de TNF- et d'IFN-c dans le sérum

Une heure après la dernière administration, les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale d'une solution d'uréthane (20 gTh100 mL) et du sang a été prélevé de l'aorte abdominale. Le sang a été centrifugé à 3 500 r pendant 15 minutes pour obtenir le sérum et conservé à -20 degrés. Les concentrations d'IL-10, d'IL-6, d'IL-2, de TNF- et d'IFN-c ont été détectées avec des kits ELISA de rat conformément aux instructions du fabricant.

2.8. Expression de CaM dans les tissus de l'hypothalamus et de l'hypophyse

L'ARN total a été extrait des tissus de l'hypothalamus et de l'hypophyse par TRIzol. La transcription inverse a été réalisée sur 10 µL d'ARN total selon les instructions du fabricant. Des quantités égales d'ADNc ont été analysées via qPCR en présence d'un colorant se liant à l'ADNdb (Promega, USA) et du système de PCR en temps réel CFX 96 (Bio-Rad, USA) pour examiner les différents gènes dans les conditions d'activation initiale à 95 degrés pendant 10 min, 40 cycles de dénaturation à 95 degrés pendant 15 s et extension de recuit à 60 degrés pendant 1 min.

Les amorces pour CaM et -actine sont données dans le tableau 1, et -actine a été utilisée comme contrôle interne. Chaque échantillon a été normalisé en utilisant la différence de seuils critiques (Ct) entre le gène cible et la -actine. L'équation suivante a été utilisée pour décrire le résultat : ΔΔCt - (gène cible Ct - gène Ct -actine) groupe expérimental - (gène cible Ct - gène Ct -actine) groupe témoin. Les niveaux d'ARNm de chaque échantillon ont ensuite été comparés, en utilisant le gène cible d'expression 2- ΔΔCt. Les résultats de chaque groupe ont été moyennés (tableau 3).

2.9. Analyse statistique

Toutes les données ont été analysées à l'aide du logiciel SPSS (version 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Les différences entre les groupes ont été analysées par analyse de variance unidirectionnelle à mesures répétées (ANOVA). Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart type (SD) à l'aide du logiciel GraphPad Prism (version 6.0, San Diego, Californie, États-Unis). Les différences avec une valeur P inférieure à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

3. Résultats expérimentaux

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalyse

Pour obtenir la meilleure séparation, la meilleure forme de pic et un temps d'analyse court, les conditions chromatographiques, notamment la colonne, la phase mobile et le programme de gradient, ont été étudiées dans notre expérience préliminaire. Les chromatogrammes typiques avec le mode MRM sont présentés dans la figure 1.

D'après le tableau 4, nous pouvons voir que la teneur en glycosides phényléthanoïdes du WCD a augmenté par rapport à celle du CD, en particulier pour l'échinacoside et l'actéoside, tandis que la teneur en iridoïdes a diminué dans le WCD.

3.2. Régulation pour la fonction de l'axe HPA

3.2.1. Test de poids, de température et de puissance de maintien

Les rats du groupe MC et des groupes expérimentaux ont présenté progressivement des symptômes de déficience rénale-yang après avoir reçu de la corticostérone. Les symptômes, tels que la perte de poids, l'hypothermie, la perte d'éclat des cheveux, l'affaissement de l'esprit, le retard de réponse et une diminution significative de la consommation d'eau et de l'activité, se sont considérablement améliorés dans les groupes CD et WCD. La figure 2 (a) montre les changements de poids. Le poids de chacun des groupes de drogues a augmenté, en particulier dans les groupes CDHD et WCD-HD. Le gain de poids dans le groupe MC était le plus faible. La figure 2 (b) montre les changements de température, qui étaient les plus faibles dans le groupe MC, et la température a augmenté dans les groupes WCD-HD, WCD-MD et WCD-LD.

La figure 2 (c) montre que le pouvoir de rétention a augmenté pour le groupe BC et chacun des groupes expérimentaux, et que le groupe WCD-MD était le plus élevé, ce qui a démontré que les signes de faiblesse induits par un déficit rein-yang se sont améliorés après l'administration.

3.2.2. Niveaux de T, CRH, ACTH, CORT et cortisol

La figure 3 montre que par rapport à ceux du groupe BC, le niveau de T, CRH, ACTH et CORT dans le sérum de rat a diminué (P < 0.01) et le niveau de cortisol a diminué (P < 0.05) dans le groupe MC. Par rapport à ceux du groupe MC, le niveau de T dans les groupes WCD-HD et WCD-MD a augmenté (P < 0.01), le niveau de CRH dans le WCD-LD, Amélioration des groupes WCD-MD et WC (P < 0,01), teneur en ACTH augmentée dans les groupes CD-HD, WCD-MD et WCD-HD (P < 0,01), niveau CORT amélioré dans les groupes Les groupes CD-MD, WCD-MD et WCD-HD (P < 0,01) et améliorés dans les groupes CDHD et WCD-LD (P < 0,05), et le niveau de cortisol a augmenté dans chacun des groupes de médicaments.

3.2.3. Résultats de l'observation au microscope

Le tissu des glandes surrénales peut être divisé en couche corticale et couche médullaire. Les couches corticales comprennent les couches globulaires, groupées et réticulaires. Les cellules contiennent plus de lipides et la couche médullaire est constituée principalement de cellules de phéochromocytome et d'une petite quantité de tissu fibreux. Comme le montre la figure 4, nous avons constaté que tout était normal dans le groupe BC, tandis que dans le groupe MC, le cortex surrénalien présentait une hyperplasie évidente, une atrophie cellulaire et une densité croissante. La bande bulbeuse s'est épaissie et la zone fasciculaire translucide, la zone réticulaire étroite et les cellules plus petites présentaient une coloration inégale et une congestion capillaire. Dans le groupe PC, les limites corticales et médullaires étaient visibles. Les cellules des bandes globulaires et des faisceaux étaient disposées uniformément et la structure morphologique avait été restaurée. La même meilleure restauration a été observée dans les groupes WCD, et les effets dans le groupe WCD-MD étaient meilleurs que ceux des groupes WCD-HD et WCD-LD. La morphologie de la glande surrénale dans les groupes CD n'était pas aussi bonne que celle des groupes WCD.

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