Étude sur l'effet de l'actéoside (un ingrédient actif dans Cistanche Deserticola) sur la NAFLD en induisant l'autophagie

2 résultats

2.1 Comparaison de LC 3- ⅱ Niveaux d'expression des protéines dans les cellules HepG2 traitées avecAct et Ech L'expression relative de la protéine LC 3- ⅱDans les cellules Hepg2 traitées avec BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) était significativement plus élevée que celle du groupe témoin vierge (0. 41 ± 0. 0 2). L'expression relative de LC {{1 {{2 0}}}} ⅱ ⅱ Protéine dans les cellules HepG2 dans le groupe Rapamycine + Bafa1 (1.24 ± {{3 0}}. 0 6) (0. 28 ± {{4 0}}. 02). L'expression de la protéine LC 3- ⅱ dans les cellules HEPG2 dans le groupe ECH + BAFA1 et le groupe ACT + BAFA1 [0,43 ± 0,02 et 1,36 ± 0,11, respectivement] était significativement plus élevée que celles du groupe ECH et du groupe ACT [(0,18 ± 0,01 et 0,28 ± 0,02, respectivement], et les différences (0,28 ± 0,02, respectivement]], et les différences (pnestcistical (pne<0.05).

TCM Herb Cistanche pour la protection du foie

2.2 Comparaison de LC 3- ⅱ Niveaux d'expression des protéines dans les cellules HepG2 traitées avec différentes concentrations d'acte

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); Les niveaux d'expression de la protéine LC 3- ⅱ des cellules HepG2 dans le BAFA1 combinés avec 25, 5 0, et 1 0} 0 μmol / l Act (1.17 ± 0. 3 0,,, 1,83 ± 0. 53, et 0. 97 ± 0,25, respectivement) étaient significativement plus élevés que ceux des groupes de 25, 50 et 100 μmol / L (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 et 0,30 ± 0,15, respectivement), avec des différences significatives (P (P<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Remarque: A. Immunotransfert des protéines; B. Résultats de l'analyse semi-quantitative; par rapport au groupe ACT sans bafa1, AP<0.05.
Figure 1 Comparaison de LC 3- ⅱ Niveaux d'expression des protéines dans les cellules HepG2 traitées avec différentes concentrations d'acte

2.3 Comparaison de la viabilité des cellules Hepg2 traitées avec différentes concentrations d'ACT pendant 24 et 48 h

Les valeurs OD des cellules Hepg2 après une intervention avec 0, 2 0, 4 {{1 0}}, 6 0, 8 0, et 1 0} 0 μmol / L 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}}. 15, 0. 99 ± 0. 0. 94 ± 0. 15, et 0. 94 ± 0. 20, respectivement; et les valeurs OD des cellules HepG2 après intervention pendant 48 h étaient de 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 et 0,09 ± 0,22, respectivement. Il n'y avait pas de différence significative dans les valeurs OD des cellules HepG2 après 24 et 48 h d'intervention avec différentes concentrations d'ACT (F =0. 213, 0,213, p =0. 96, 0,36). Voir la figure 2.

Remarque: A. Les cellules Hepg2 ont été traitées avec différentes concentrations d'ACT pendant 24 h; Les cellules B. Hepg2 ont été traitées avec différentes concentrations d'ACT pendant 48 h.

Figure 2 Valeurs OD à 570 nm après 24 et 48 h de traitement avec différentes concentrations d'acte

2.4 Comparaison des niveaux de TG et de la coloration à l'huile O

Le niveau de TG des cellules HepG2 dans le groupe modèle (34,15 ± 1,90) était significativement plus élevé que celui du groupe témoin vierge (14,17 ± 2,74) et le groupe d'intervention ACT (19,11 ± 1,68), et les différences étaient statistiquement significatives (P (P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Remarque: A. Niveau TG; B. Coloration rouge O (20 ×); par rapport au groupe de modèles, AP<0.05.
Figure 3 Comparaison du niveau de TG et de la coloration Oil rouge O dans le modèle de cellule in vitro NAFLD après traitement ACT

2.5 La comparaison des autophagosomes et des gouttelettes lipidiques après le traitement ACT par rapport au groupe témoin vierge, les gouttelettes lipidiques des cellules HepG2 dans le groupe de traitement de la rapamycine et le groupe d'intervention ACT ont augmenté de manière significative, et les autophagosomes LC3 des cellules HepG2 dans le groupe d'intervention ACT ont augmenté de manière significative et co-massié avec des gouttelettes lipidiques dans l'espace. Voir la figure 4.

3 discussion

La NAFLD est la maladie hépatique chronique la plus courante au monde, représentant environ 1/4 de la population totale du monde, et est devenu un problème mondial de santé publique. La sur-nutrition est le principal facteur qui stimule la NAFLD. Un apport excessif de nutriments par les cellules hépatiques provoque un dépôt excessif en graisses dans les cellules, conduisant à des réactions lipotoxiques telles que le stress cellulaire (stress oxydatif et le stress du réticulum endoplasmique), l'activation des inflammasomes et l'apoptose cellulaire, et provoquant par la suite une série de changements dans les phénotypes de tissus hépatiques tels que la stimulation inflammatoire, la régénération des tissus et les fibrose [{2}. Ces dernières années, des études ont montré que l'autophagie joue un rôle important dans la prévention du développement de la NAFLD humaine. Les résultats de la détection de l'indice lié à l'autophagie dans le foie des patients atteints d'une maladie hépatique NAFLD et non alcoolique et du foie de souris obèses et de régime riche en graisses ont montré que le processus d'autophagie dans les hépatocytes était bloqué, ce qui a conduit à l'accumulation massive de TG intracellulaire et d'autres dropletes lipidiques [16]. D'autres études ont montré qu'après le gène clé 7 de l'autophagie des hépatocytes, l'autophagie a été spécifiquement éliminée chez la souris nourrie d'un régime riche en graisses, le niveau de TG dans les hépatocytes de souris a augmenté de manière significative [17]. Cependant, après la surexpression du gène ATG7 ou l'intervention avec des inducteurs d'autophagie tels que la rapamycine et la carbamazépine, la dégénérescence graisseuse dans le foie de souris a été significativement réduite [18-20].
Cela suggère que la dégénérescence graisseuse du foie peut être considérablement réduite en améliorant l'activité d'autophagie hépatique, offrant une stratégie efficace pour le traitement du NAFLD. Les produits naturels, en tant que source majeure de développement de nouveaux médicaments, sont largement utilisés dans la prévention et le traitement de diverses maladies hépatiques. En tant qu'excellent produit couramment utilisé en médecine traditionnelle chinoise, Cistanche Deserticola a attiré une large attention pour ses effets pharmacologiques tels que la neuroprotection, l'immunomodulation, l'antioxydant, l'anticancéreux et la protection du foie. Jusqu'à présent, plus de 120 composés ont été isolés du déserticola de Cistanche, notamment des glycosides phényléthanoïdes, des terpénoïdes et leurs glycosides, des lignans et leurs glycosides, des oligosaccharides, des polyols et des polysaccharides [21]. Parmi eux, les glycosides phényléthanoïdes sont la classe les plus étudiées des composés dans les ingrédients actifs de Cistanche déserticola. Ech et ACT sont des composés représentatifs des glycosides de Cistanche déserticola phényléthanoïde, qui ont des effets positifs dans les antioxydants, protégeant le foie, le myocarde, les cellules nerveuses et l'amélioration de la mémoire [22-23]. Cependant, il n'y a pas de rapport sur la littérature pertinente sur la question de savoir si les glycosides cistanches déserticola phényléthanoïdes sont impliqués dans le processus d'autophagie dans la protection du foie.

L'autophagie est un processus d'auto-dégradation qui est omniprésent dans le corps. Il s'agit d'un processus catabolique dans lequel les autophagosomes dégradent les déchets métaboliques cellulaires. Le processus d'autophagie comprend généralement trois processus: l'initiation de l'autophagie, l'extension de la membrane autophagique et la formation de lysosomes autophagiques, qui sont principalement régulées par la protéine cible de la rapamycine et les voies de signalisation de la kinase de la rapamycine. Les autophagosomes sont des marqueurs de l'autophagie cellulaire. Dans le processus de formation d'autophagosomes, une série de protéines liées à l'autophagie, notamment ATG5 ~ 12 et LC3, jouent un rôle important. Par conséquent, cette étude a construit un système d'évaluation de l'autophagie, a détecté le niveau d'expression de la protéine de marqueur d'autophagie LC3 au niveau moléculaire et a évalué la capacité d'induction de l'autophagie de deux glycosides phényléthanoïdes de Cistanche déserticola dans les cellules Hepg2. Les résultats ont montré qu'après l'ajout de traitement BAFA1 sur la base de l'intervention de la rapamycine inductrice de l'autophagie, la LC intracellulaire 3- ⅱ des cellules Hepg2 a augmenté de manière significative, indiquant que le système d'évaluation de l'autophagie peut évaluer précisément l'activité d'instructions de l'autophagie; Après que ECH et ACT ont été traités avec BAFA1, l'expression de la protéine LC 3- ⅱ dans les cellules HepG2 dans le groupe ECH + BAFA1 et le groupe ACT + BAFA1 était significativement plus élevée que celle du groupe ECH et du groupe ACT, et les différences étaient statistiquement significatives (P.<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and exercer une protection hépatiqueet autres fonctions biologiques. Deuxièmement, la sécurité est une considération primordiale dans le développement de médicaments. Afin d'évaluer la sécurité de la loi, cette étude a en outre testé l'effet de l'ACT sur la viabilité des cellules HepG2. Les résultats ont montré que la viabilité des cellules HepG2 n'était presque pas affectée par une intervention avec différentes concentrations d'ACT, ce qui indique que la loi peut être utilisée comme médicament candidat pour étudier plus loin ses effets pharmacologiques et ses mécanismes moléculaires.

L'autophagie est un processus biologique hautement conservé dans les cellules, et de légers changements dans les concentrations de médicament affecteront le niveau d'autophagosomes cellulaires. Pour déterminer davantage la concentration optimale d'ACT pour induire la formation d'autophagosomes dans les cellules HepG2, cette étude a utilisé différentes concentrations d'ACT combinées à Bafa1 pour traiter les cellules HepG2 et détecté le niveau d'expression de la protéine LC 3- ⅱ dans les cellules. Les résultats ont montré que la loi de 50 μmol / L pouvait augmenter significativement le niveau d'autophagosomes dans les cellules HepG2. Par conséquent, cette étude a utilisé 50 μmol / L ACT pour intervenir dans le modèle de cellule NAFLD construit in vitro et a exploré préliminairement la relation entre sonprotection du foiefonction et autophagie.
Des études connexes sur des modèles de cellules NAFLD ont montré qu'après une intervention in vitro avec des acides gras libres, le niveau de TG des cellules HepG2 a augmenté de manière significative et l'agrégation des gouttelettes lipidiques gras pourrait être clairement observée dans les cellules [{{1}]. Dans cette étude, 100 μmol / L PA ont été utilisés pour intervenir dans les cellules HepG2 in vitro pendant 24 h. Le niveau TG des cellules HepG2 dans le groupe modèle était significativement plus élevé que celui du groupe témoin vide. Dans le même temps, l'agrégation des gouttelettes lipidiques pouvait être clairement observée dans les cellules, indiquant que le modèle de cellule NAFLD a été construit avec succès. Afin d'observer davantage l'effet de l'ACT sur le modèle de cellules NAFLD, une loi de 50 μmol / L a été utilisée pour intervenir dans le modèle de cellule NAFLD in vitro, et l'effet de l'ACT sur la NAFLD a été évalué par détection de niveau TG et coloration rouge O. Les résultats ont montré qu'après l'intervention ACT, le niveau de TG et le nombre de gouttelettes lipidiques gras dans les cellules HepG2 étaient significativement inférieurs à ceux du groupe modèle, ce qui indique qu'ACT a l'activité de réduire le TG dans le modèle de cellules NAFLD induit par PA. Afin d'étudier davantage la relation entre l'activité d'émaissement des lipides d'ACT et l'autophagie cellulaire, cette étude a utilisé LC 3-} ⅱ anticorps protéiques spécifiques et des sondes fluorescentes BODIPY pour co-accumuler des autophagosomes et des gouttelettes lipidiques. Il a été observé que le nombre d'autophagosomes dans les cellules HEPG2 après l'intervention ACT a été significativement augmenté par rapport au groupe témoin, ce qui était cohérent avec les résultats de l'immunotransfert des protéines dans cette étude, confirmant en outre que l'ACT a une activité induisant l'autophagie dans les cellules HEPG2. De plus, après l'intervention médicamenteuse, les autophagosomes intracellulaires et les gouttelettes lipidiques co-localisés, ce qui indique que l'effet de l'ACT sur l'amélioration de la dégénérescence graisseuse NAFLD induite par PA peut impliquer l'implication de l'autophagie cellulaire. Cependant, dans le modèle de cellules NAFLD, la question de savoir si ACT exerce son activité pharmacologique de réduction des niveaux de TG intracellulaires à travers la voie lipophagique doit encore être expliquée en bloquant le processus d'autophagie intracellulaire.
En résumé, parmi les deux composés de glycosides de phényléthanol de Cistanche déserticola, l'ACT a une capacité significative à induire l'autophagie dans les cellules Hepg2. Dans le même temps, dans le modèle de cellule de stéatose hépatique induite par PA, CT a considérablement réduit le niveau de TG dans les cellules HepG2. Après l'intervention ACT, les autophagosomes et les gouttelettes lipidiques dans les cellules HepG2 avaient une certaine relation de colocalisation, indiquant que l'autophagie peut être une nouvelle voie impliquée dans le processus pharmacologique de l'ACT en termes de protection du foie. Voir la figure 5. Dans les études ultérieures, le mécanisme d'action de l'ACT dans la baisse des lipides sera étudié en détail en utilisant des bloqueurs d'autophagie pour jeter les bases d'un futur développement de médicaments.