Stx2 induit une expression génique différentielle et perturbe les gènes du rythme circadien dans le tubule proximal

Abstrait: Escherichia coli productrice de shigatoxines(STEC) provoque des anomalies tubulaires proximales dans le rein. Cependant, les facteurs altérés par la toxine Shiga (Stx) au sein des tubules proximaux restent à démontrer. Nous avons déterminé le récepteur Stx Gb3 dans les reins murins et humains et confirmé l'expression du récepteur dans les tubules proximaux. Stx2-a injecté des tissus rénaux de souris etCellules épithéliales tubulaires proximales rénales primaires humaines traitées par Stx2-(RPTEC) ont été collectés et une analyse par micropuce a été effectuée. Nous avons comparé les réseaux de reins murins et de RPTEC et sélectionné 58 gènes communs exprimés de manière différentielle par rapport au contrôle (0 h, sans traitement par toxine). Nous avons constaté que le gène le plus fortement exprimé était le GDF15, qui pourrait être impliqué dans la perte de poids induite par Stx2-. Les gènes associés aux activités Stx2 précédemment signalées, telles que la src kinase Oui, l'activation de la voie de phosphorylation, la réponse protéique déployée (UPR) et la réponse au stress ribotoxique (RSR) ont montré des expressions différentielles. De plus, les gènes de l'horloge circadienne étaient exprimés de manière différentielle, suggérant une perturbation du rythme circadien rénal induite par Stx2-. Le transporteur tubulaire proximal Na+ -glucose SGLT1 (SLC5A1) régulé par le rythme circadien était régulé négativement, indiquant une détérioration fonctionnelle tubulaire proximale, et les souris ont développé une glycosurie confirmant un dysfonctionnement tubulaire proximal. Stx2 modifie l'expression des gènes dans les tubules proximaux murins et humains par le biais d'activités connues et de perturbations du rythme circadien récemment étudiées, qui peuvent entraîner des dysfonctionnements tubulaires proximaux.

Mots clés:Toxine Shiga de type 2 (Stx2) ;tubule proximal rénal; souris; cellule épithéliale tubulaire proximale rénale humaine (RPTEC); puce à ADN ; rythme circadien

Contribution clé :Des gènes différentiellement exprimés provenant de reins de souris traités au Stx2- et de cellules tubulaires proximales primaires humaines ont été analysés. En plus des gènes affectés par Stx2-connus précédemment, il a été démontré que les gènes associés au rythme circadien modifient leur expression et ont une influence sur la fonction tubulaire proximale.

1. Introduction

Escherichia coli productrice de shigatoxines(STEC) provoque des symptômes sévères de syndrome hémolytique et urémique (SHU), défini par la triade insuffisance rénale aiguë, thrombocytopénie et anémie hémolytique [1]. On pense que les toxines Shiga (Stxs) jouent un rôle majeur dans l’endommagement des cellules dans cette maladie infectieuse. L'histopathologie rénale caractéristique du SHU comprend des lésions glomérulaires et tubulaires telles que le dépôt capillaire de fibrine dans les glomérules et la nécrose tubulaire, respectivement [1,2]. Des cas de dysfonctionnement antérieurs dans les tubules proximaux de patients infectés par STEC ont été rapportés par analyse d'urine. Les marqueurs urinaires fonctionnels tubulaires proximauxN-acétylglucosaminidase(NAG) et 2 microglobulines (2MG) provenant de l'urine au stade aigu des patients atteints de SHU associé à STEC O157- ou O111- ont été mesurées comme étant fortement augmentées, suggérant un dysfonctionnement tubulaire proximal précoce [3].

Les Stx, y compris Stx2, sont constitués d'une seule sous-unité A et de cinq sous-unités B (toxine A1B5), dans lesquelles la sous-unité A possède une activité enzymatique dépurinant l'adénine 4324 de l'ARNr 28S de la sous-unité du ribosome 60S, tandis que les sous-unités B sont nécessaires pour se lier aux cellules hôtes via le globotriaosylcéramide. (Gb3). Il existe plusieurs influences connues que les Stx exercent sur les cellules. (I) En se liant à son récepteur Gb3, la toxine provoque une transduction du signal via la kinase de la famille Src Oui [4,5]. Après s'être liés au récepteur, les Stx s'intériorisent dans la cellule par endocytose et sont transportés de manière rétrograde vers le RE. Les Stx traversent l'endosome et l'appareil de Golgi où la sous-unité A est clivée entre les fragments catalytiques A1 et C-terminaux A2 par la furine [6], bien que les fragments A1 et A2 soient toujours connectés par une liaison disulfure. La toxine atteint le RE et la liaison disulfure peut être réduite ; puis, un fragment A1 de l'holotoxine est libéré [7,8]. C'est à ce moment-là que l'influence du (II) stress ER se produit avec des fragments de toxines dépliés imitant des protéines, qui induisent une réponse protéique dépliée (UPR). Les sous-unités A et B sont capables de se lier à Bip, ce qui indique un stress ER [9,10]. Le fragment A1 clivé est transloqué vers le cytoplasme et dépure une adénine de l'ARNr 28S pour (III) inhiber la synthèse des protéines. La modification causée par Stx à l'ARNr 28S induit (IV) une réponse au stress ribotoxique (RSR), qui active la cascade de signalisation en aval [11]. Les influences (II) et/ou (IV) sont connues pour induire (V) une transcription génique particulière conduisant à la sécrétion de cytokines [12]. De plus, (II) et (IV) sont impliqués dans l'apoptose induite par (VI) Stxs (13-15).

Des expériences in vitro utilisant des tubules proximaux humains et des modèles de souris in vivo relient fortement les dommages tubulaires proximaux aux Stx. Les cultures primaires et les lignées cellulaires de tubules proximaux humains sont très sensibles aux Stx et présentent une libération de cytokines et une mort cellulaire, y compris l'apoptose (16-20). Les cellules épithéliales tubulaires proximales rénales primaires humaines (RPTEC) expriment le récepteur Gb3, sont très sensibles aux toxines Shiga et ont été utilisées dans de nombreux articles pour analyser des réactions biologiques telles que l'inhibition de la synthèse des protéines, la production de cytokines et l'induction de l'apoptose (17,20). . Les souris ayant reçu une injection de toxine Shiga de type 1 (Stx1) ont présenté une glycosurie, ce qui indique une réabsorption réduite du glucose par le tubule proximal (21). Ceux-ci suggèrent une toxicité du Stxs pour les tubules proximaux in vitro et in vivo. Dans les modèles de souris infectées par STEC, les observations fréquentes en histopathologie sont la nécrose des cellules épithéliales tubulaires et la desquamation des cellules dans la lumière des tubules proximaux (22-24). Les souris purifiées ayant reçu une injection de Stx (Stx1 ou Stx2) présentent également une desquamation des tubules proximaux avec des noyaux relativement intacts (25-27).

Bien que les dommages aux tubules proximaux associés à l'injection de Stx ou à l'infection par STEC aient été décrits sur le plan fonctionnel et histologique, les cibles génétiques impliquées dans les lésions des tubules proximaux n'ont pas encore été démontrées.

Ici, nous avons analysé les expressions génétiques dans des reins de souris injectés par Stx2-et dans une culture de cellules épithéliales tubulaires proximales rénales primaires humaines (RPTEC) traitées par Stx2-pour montrer les altérations génétiques associées aux tubules proximaux induites par Stx2.

2. Résultats

2.1. Stx2-Pathologie rénale de souris injectée

Pour identifier la pathologie rénale murine associée à Stx{{0}}, des coupes de tissus rénaux de souris ayant reçu une injection de Stx2- ont été colorées à l'acide périodique-Schiff (PAS). Une tache rose claire et intense sur le côté luminal des cellules épithéliales tubulaires indique le glycocalyx de la bordure en brosse, caractéristique des cellules tubulaires proximales. Nous avons déterminé que les cellules/noyaux situés à l'extérieur du glycocalyx (dans l'espace luminal) étaient détachés des cellules voisines et des membranes basales (c'est-à-dire des cellules desquamées). Sur les figures 1B (8 h après Stx2), C et D (48 h après Stx2), les cellules mues avec des noyaux relativement intacts sont représentées par des flèches. Nous avons également observé des débris cellulaires dans la lumière tubulaire proximale (têtes de flèches de la figure 1). Après l'administration de Stx2, ces lésions sont apparues assez clairement, alors qu'à 0 h (Figure 1A, sans Stx2), elles étaient négligeables.

Figure 1. Stx2 induit la desquamation des cellules tubulaires proximales dans le rein murin. Des colorations à l'acide périodique Schiff (PAS) de coupes de rein murin injectées par Stx2- sont présentées. (A) 0 h (naïf), (B) 8 h et (C) 48 h après l’injection de Stx2. Les flèches indiquent la desquamation des cellules tubulaires proximales. Les pointes de flèches indiquent les débris cellulaires. Un champ agrandi à l’intérieur de (C) est représenté en (D) avec des cellules de desquamation pointées par des flèches. Les barres entre (A – C) indiquent 50 µm. La barre d'échelle en (D) indique 10 µ

2.2. Expression de Gb3 dans les reins de souris et humains

2.2.1. Expression Gb3 du cortex rénal de souris

Comme les cellules tubulaires proximales présentaient des dommages histologiques dus à l'insulte Stx2, nous avons testé l'expression du globotriaosylcéramide (Gb3) du récepteur Stx2 dans le cortex rénal murin avec un marqueur tubulaire proximal, l'aquaporine -1 (AQP1). Comme le montre la figure 2, les cellules positives pour AQP1- présentaient une positivité pour Gb3 principalement du côté luminal des cellules (les cellules sont marquées par des pointes de flèches fermées, tandis que les lumières sont marquées par des astérisques). Nous avons également observé que les colorations tubulaires Gb3 négatives pour AQP1 collectaient vraisemblablement des cellules canalaires (figure 2, pointe de flèche ouverte), comme indiqué (28). L'intensité de la coloration Gb3 était plus forte dans les cellules AQP1 (-), cependant, le nombre de ce type de tubules était plus petit que celui des tubules proximaux doublement positifs Gb3/AQP1 dans le cortex. Les cellules endothéliales CD31-positives sont Gb3 négatives dans le rein de souris. Un contrôle d'anticorps correspondant à l'isotype pour Gb3 (IgM de rat) a été utilisé comme contrôle négatif. Les IgM de rat n'ont pas réagi avec le tissu rénal de souris (Figure S1)

2.2.2. Expression Gb3 du cortex rénal humain

Dans le tissu rénal humain, Gb3 était également positif dans les tubules proximaux AQP1-positifs (Figure 3, pointes de flèches fermées). La localisation de Gb3 dans les cellules tubulaires proximales était plus forte du côté luminal. Nous avons également observé des cellules AQP1 (−) Gb3 (+) (Figure 3, pointes de flèches ouvertes) comme nous l'avons fait dans les tissus murins. Les cellules endothéliales humaines expriment Gb3 (CD31/Gb3 double positif, Figure 3, astérisque). Les coupes de contrôle isotype avec IgM de rat n'ont pas montré de réaction positive dans le tissu rénal humain (Figure S2).

2.3. Analyse des puces à ADN

Comme les cellules épithéliales tubulaires proximales de souris et humaines sont positives pour Gb3, cela suggère que ce type de cellule est directement affecté par Stx2. Afin de déterminer les gènes affectés par Stx2-dans les cellules tubulaires proximales murines et humaines, nous avons extrait l'ARN total des reins de souris ayant reçu une injection de Stx2-et des RPTEC primaires humains traités par Stx2-et analysé expression génique par puce à ADN

2.3.1. Gènes exprimés différemment dans les reins de souris et dans le RPTEC

Des gènes différentiellement exprimés (DEG), communs aux reins de souris et au RPTEC, ont été sélectionnés. La base de la sélection des DEG courants est que (1) les gènes avec un changement de log2- fois (par rapport à 0 h) supérieur à 1 ou inférieur à −1 dans les reins de souris et la puce à ADN RPTEC au moins dans un - le point temporel et (2) la distribution du changement log2-fold d'un gène s'adapte aux courbes cubiques plutôt qu'aux courbes quadratiques pour mieux s'adapter aux pics d'expression génique au milieu du temps dans le microréseau rénal. Avec les deux critères ci-dessus, nous avons sélectionné 58 gènes communs entre le rein de souris traité au Stx2- et le RPTEC humain (Figure 4A). Les modèles d'expression de ces 58 gènes dans le rein de souris sont présentés dans une carte thermique (Figure 4B). La plupart des gènes ont été régulés positivement quelques heures après l'injection de Stx2 ; cependant, certains gènes avaient des modèles d'expression antérieurs. Les gènes qui présentaient plus d'un changement de log2-fois ont été répertoriés pour chaque instant (Tableau 1).

Figure 4. Analyse de puces à ADN. (A) Parmi les gènes analysés par micropuce, 147 gènes (cerclés en vert) et 4013 gènes (entourés en rouge) provenant respectivement du rein de souris traité par Stx2- et du RPTEC, ont été détectés comme ayant log{ {4}} fois le changement inférieur à −1 ou supérieur à 1. Les gènes qui ont été modifiés par le traitement Stx2 contre 0 h dans les deux puces à ADN (gènes/DEG communs exprimés différentiellement) totalisaient 58 (zones superposées rouges et vertes). (B) La carte thermique des 58 gènes communs est présentée dans la chronologie d’échantillonnage des reins de souris. Z est égal à 0 désigne une moyenne des valeurs de changement log2- fois d'un gène et reflète une tendance de l'expression du gène. Ainsi, une couleur verdâtre représente une valeur inférieure à la moyenne d’un gène particulier dans une rangée, alors qu’une couleur rougeâtre représente un changement supérieur à la moyenne. Les données log2-fold des 58 gènes de l'ensemble de données de 72 h injecté par PBS par rapport à 0 h sont présentées dans le tableau S3 à titre de référence. (C) Le graphique à barres d’enrichissement Metascape GO est affiché. L'axe X montre les valeurs −log10 p des termes GO enrichis dans 58 DEG communs, indiquant qu'un nombre plus élevé de termes GO enrichis est plus probablement pertinent pour le système. Les 20 principaux termes GO enrichis sont affichés. (D) L’analyse STRING de 58 DEG courants est présentée dans les six clusters les plus connectés/liés. Les couleurs sphériques désignent les gènes appartenant au même cluster. Les relations d'actions entre les gènes sont représentées par un code de couleur et de forme d'extrémité. ENSG00000279576 a maintenant été codé ENSP00000485396, ce qui désigne l'identification humaine du gène MALAT1.

Pour analyser la fonctionnalité des DEG courants, nous avons utilisé la plateforme Metascape. Il attribue des termes d'ontologie génétique (GO), qui comprennent la fonction moléculaire, le composant cellulaire et le processus biologique, à des gènes sélectionnés. Nous avons déposé les 58 DEG communs sur Metascape et obtenu les 20 principaux termes GO auxquels appartiennent ces DEG (Figure 4C). Les termes GO sont répertoriés avec les gènes correspondants dans le tableau S1. Pour voir une liste de gènes dans chaque terme GO illustré à la figure 4C, veuillez vous référer à l'enrichissement du tableau S2 Metascape. Les termes GO associés à la mort cellulaire, à l'inflammation et aux cascades de signalisation ont été classés dans le top 20 comme prévu ; cependant, le rythme circadien a attiré l'attention en tant que nouveau terme GO. Les connexions connues de gènes communs ont été montrées avec l'analyse STRING (Figure 4D). Dans cette analyse, les gènes ont été regroupés en six groupes différents qui ont été représentés par une forte association de liaison, d'influences (catalyse, activation ou inhibition), ainsi que de co-expression de gènes.

2.3.2. Tendance de l’expression génétique

Les traces de plusieurs expressions géniques sont présentées dans des graphiques avec l'axe des x pour le temps (h) après l'injection de Stx2 et l'axe des y pour le changement de log2-fold par rapport à 0 h (Figure 5). Ainsi, la valeur de l'axe y est égale à 1 signifie un changement de 2- fois par rapport à l'expression 0 h.

Figure 5. Gènes différentiellement exprimés avec chronologie d’échantillonnage de souris. (A) Les modèles d’expression d’ARNm PDK4 et CEBPB sont présentés. (B) les gènes immédiats et précoces. (C) Expressions des protéines matricellulaires CYR61 (CCN1) et CTGF (CCN2). (D) Les gènes DDIT3 (CHOP, GADD153) liés à l'UPR, le partenaire de liaison DDIT3 CEBPB et le facteur de rétroaction négative PPP1R15A (GADD34) sont présentés. (E) Les facteurs de transcription DDIT3 (CHOP, GADD153) et ATF3 et GDF15, qui sont régulés transcriptionnellement par ces facteurs, sont présentés. (F) Les gènes associés à l’UPR et au RSR sont présentés. (G) EDN1 en relation avec les gènes UPR sont tracés. (H) Les premiers pics d’EDN1 et EGR1 et le pic suivant de PER1 sont présentés avec une augmentation progressive ultérieure des trois gènes. (I) Les gènes du groupe violet de la figure 4D sont des gènes liés au rythme circadien. (J) Les gènes centraux circadiens PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 et Clock sont présentés. (K) PER1 et les gènes rénaux régulés par l’horloge circadienne sont présentés. (L) Les gènes inflammatoires avec les gènes liés à la voie NF-kB sont présentés. Pour voir les points de données log2 individuels, veuillez vous référer à la figure supplémentaire S4. La figure S5, montrant le log2 moyen avec des barres d'écart type, est présentée à titre de référence.

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