Stx2 induit une expression génique différentielle et perturbe les gènes du rythme circadien dans le tubule proximal Ⅱ

3. Discussion

3.1. La pathologie tubulaire proximale chez les patients STEC et les modèles animaux

L'oligurie est un signe denécrose tubulaire aiguë(ATN). En raison de l'ATN, les cellules épithéliales desquamées obstruent la lumière des tubules pour réduire le flux de liquide, ce qui apparaît comme une oligurie. Chez les patients STEC, l’oligurie et l’anurie sont souvent des signes évocateurs d’ATN. La réduction de la fonction du tubule proximal au cours des premiers stades de la maladie infectieuse STEC a été démontrée par une augmentation du 2MG et du NAG urinaires [3,33]. La B2MG est une petite protéine de 12 kDa qui est librement filtrée à travers les glomérules et complètement absorbée par les tubules proximaux dans un état sain. Cependant, une fois que les tubules proximaux sont endommagés, la quantité de 2MG dans l’urine augmente, servant ainsi de biomarqueur pour la fonction tubulaire proximale. NAG est une grande enzyme lysosomale de 130 kDa et la principale glucosidase du tubule proximal. En raison de sa grande taille, le glomérule ne peut pas filtrer le NAG alors que les tubules proximaux endommagés sécrètent du NAG dans l'urine. Ainsi, une augmentation du NAG urinaire est un autre biomarqueur des lésions tubulaires proximales. L'histopathologie glomérulaire telle que les capillaires obstrués par la fibrine est une découverte fréquente chez les patients STEC ; cependant, les données urinaires ci-dessus suggèrent des lésions tubulaires proximales dans la maladie antérieure. De plus, l'urine des patients STEC contient des cylindres constitués d'épithélium tubulaire résultant de la desquamation de cellules tubulaires proximales endommagées [1]. Dans les modèles animaux, la desquamation des cellules tubulaires proximales est souvent constatée à la fois dans les modèles d'infection STEC et d'injection Stx (25-27,34). Dans la présente étude, nous avons constaté une desquamation des cellules tubulaires proximales dans les reins murins injectés par Stx2-, suggérant une altération tubulaire proximale induite par Stx2- (Figure 1). Nous avons également détecté le récepteur Gb3 Stx2 chez la souris ettubules proximaux du rein humainavec une expression latérale luminale qui indique une interaction directe de Stx2 avec les tubules proximaux (Figures 2 et 3). PDK4 phosphoryle la pyruvate déshydrogénase pour inhiber son activité, entraînant une diminution de l'utilisation du glucose et une augmentation du métabolisme des graisses en réponse à un jeûne et à une famine prolongés. Il protège les cellules épithéliales détachées contre la mort cellulaire induite par le détachement (anoikis) [35]. PDK4 avait initialement un pic à 4 h, puis un autre pic à 8 h (Figure 5A). Il a été réduit à 12 h, mais à partir de là, il a augmenté progressivement jusqu'à 72 h avec un changement log2- fois et a fini par 3 (12- changement fois) (Figure 5A). Le détachement des cellules épithéliales s'est produit dans les cellules tubulaires proximales de souris injectées par Stx 2- (desquamation) avec une morphologie relativement intacte (Figure 1), cela peut refléter une régulation positive de PDK4.

EXTRAIT DE CISTANCHE TUBULOSA EN POUDRE POUR LE REIN

Comme NHERF1 (SLC9A3R1) contribue à l’adhésion normale des cellules à la matrice extracellulaire [36], à l’organisation du cytosquelette d’actine et au maintien de la morphologie cellulaire, une expression réduite de ce gène peut avoir des conséquences telles que la desquamation des cellules (Figure 5K).

L'effet de Stx2 sur les tubules proximaux semble être un facteur très important pour les maladies infectieuses STEC ; cependant, les modifications de l'expression des gènes se concentrant sur les cellules tubulaires proximales in vivo n'étaient pas disponibles auparavant. Gardiens et coll. [37] ont montré des gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les reins de souris ayant reçu une injection de LPS Stx2+, de sorte que la plupart des gènes antérieurs et largement modifiés provenaient de l'influence du LPS et que les gènes modifiés très tard provenaient de l'effet Stx2. . Leurs données ont montré des informations précieuses sur les expressions différentielles des gènes du rein, mais n'ont pas séparé les types de cellules responsables de ce changement. Dans la présente étude, nous avons essayé de rechercher les DEG associés aux cellules tubulaires proximales en comparant les données de micropuces provenant de souris.rein et tubulaire proximal primaire humaincellules traitées avec Stx2.

3.2. Facteurs tubulaires proximaux impliqués dans la pathologie induite par Stx2- en relation avec les activités Stx2 connues dans les cellules exprimant Gb3

3.2.1. Activité (I), transduction du signal induite par la liaison de Stxs à Gb3

Les sous-unités B des Stx induisent une tyrosine kinase src non réceptrice Oui phosphorylation [4]. Le Oui phosphorylé active les molécules de signalisation en aval par son activité kinase et conduit au remodelage du cytosquelette [5]. La phosphorylation de la protéine associée à Yes (YAP) dans Y357 par Yes est connue pour induire une translocation nucléaire de YAP où elle agit comme un co-activateur transcriptionnel pour induire des gènes cibles tels que CTGF (38). Les protéines matricellulaires CYR61 (CCN1) et CTGF (CCN2) sont sécrétées dans la matrice extracellulaire (ECM) et contribuent au maintien de l'adhésion cellule-ECM en se liant aux intégrines des récepteurs et aux protéoglycanes d'héparane sulfate attachés à la surface des cellules (HSPG) (39, 40). La molécule clé de la transcription de CCN1 et 2 est YAP, et elle est maintenue inactive (phosphorylée au niveau du résidu sérine 127) dans un état normal sous la voie de signalisation Hippo. Une fois qu'une faible adhésion cellule-cellule est détectée, YAP (S127) n'est plus phosphorylé, ce qui lui permet de pénétrer dans le noyau, et la transcription de CCN1 et 2 augmente (41-43). CCN1 et 2 agissent comme des molécules cicatrisantes pour réparer les tissus perdus en cellules [38,44]. Dans notre ensemble de données, CCN1 et 2 présentaient de petits pics à un moment antérieur (6 h). Cela peut refléter l’activation Oui induite par la liaison Stx2. Des heures plus tard, la desquamation peut avoir déclenché une activation supplémentaire de YAP en désactivant la voie de signalisation Hippo pour induire une plus grande expression de CCN1 et 2 à 12 h ou plus tard (Figure 5C).

3.2.2. Activité (II), induisant le stress ER/UPR

Les Stx atteignent le RE, où les fragments A1 clivés et les sous-unités B imitent les protéines dépliées (9, 10, 45, 46). La protéine régulée par le glucose de 78 kDa (Grp78, protéine de liaison de l'immunoglobuline (Bip)) ancre trois protéines clés de l'UPR. Enzyme nécessitant l'inositol -1 (Ire -1), protéine kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK ) et activation du facteur de transcription 6 (ATF6) dans la membrane ER à l'état normal. Cependant, en raison de l’affinité plus élevée de Grp78 pour les protéines dépliées, il libère ces protéines ancrées. ATF6 est activé après la libération et augmente les NA mR CHOP (DDIT3) et X-box Binding Protein 1 (XBP-1), tandis que Ire-1 épisse l'ARNm de XBP-1 pour produire XBP{{ 22}} protéine, qui contribue à la transcription CHOP (DDIT3). L'activation de PERK conduit à l'activation d'ATF4 qui augmente également l'ARNm de CHOP (DDIT3). Par conséquent, une augmentation de l’ARNm de CHOP (DDIT3) est une caractéristique de l’UPR (47, 48). Il est rapporté que les Stx induisent l'UPR et que CHOP (DDIT3) est régulé positivement dans notre ensemble de données (Figure 5D – G).

Le GDF15 appartient à la famille des facteurs de croissance transformants bêta (TGF). Récemment, il a été démontré que le GDF15 médie la perte de poids induite par la metformine, un médicament diabétique (49). Chez les souris ayant reçu de la metformine par voie orale, l’ARNm du GDF15 intestinal et rénal a augmenté, entraînant une élévation du GDF15 sérique. Le GDF15 en circulation agit via un récepteur restreint au tronc cérébral pour supprimer la prise alimentaire et réduire le poids corporel (50). Chez les souris ayant reçu de la metformine, l'augmentation du GDF15 rénal est au moins en partie régulée par CHOP (DDIT3). Dans notre ensemble de données de reins de souris ayant reçu une injection de Stx2-, CHOP (DDIT3) a augmenté initialement à 4 h avec un très petit pic, puis a commencé à avoir une tendance à la hausse vers 48 h où il a maintenu le niveau d'un log{{16 }} changement de pli autour de 1,3 (Figure 5E). Selon l'analyse groupée STRING, GDF15 reçoit un apport actif des facteurs de transcription CHOP (DDIT3) et ATF3 (Figure 5E) [51,52]. Le poids murin injecté par Stx2- a commencé à diminuer ou à s'écarter du contrôle salin après 24 h (Figure S3B). Une augmentation de l'ARNm de GDF15 dans le rein à 12 h peut avoir incité le tronc cérébral à réduire la consommation alimentaire, ce qui à son tour s'est traduit par une perte de poids (Figures 5E et S3B). Alors que le niveau d'expression de GDF15 restait élevé après 24 h, les souris ont continué à perdre du poids (Figures 5E et S3B).

En cas de stress ER, PERK est libéré de Grp78 (Bip) et s'oligomérise pour phosphoryler et inhiber eIF2, conduisant à une répression globale de la traduction, à l'exception de quelques protéines sensibles à l'UPR telles que ATF4, CHOP et Grp78. GADD34 (sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 1 15A (PPP1R15A)) est l'une des protéines augmentées sous l'inhibition associée à eIF2 phosphorylée (eIF2 (P)) et régulée positivement dans notre ensemble de données (Figure 5D, G). GADD34 est une protéine phosphatase-1 qui déphosphoryle eIF2 (P) pour réguler négativement l'inhibition de la synthèse des protéines induite par l'UPR (53). L'expression GADD34 (PPP1R15A) devient un changement de log2- fois supérieur à 1 après 12 h de Stx2 dans notre ensemble de données et continue d'augmenter jusqu'à 24 h lorsqu'elle se stabilise (le changement de log 2- fois est égal à 2,1) et maintient cela niveau jusqu’à la fin (Figure 5D,G). Cela suggère que l'UPR induit par Stx2- a eu une rétroaction négative après 12 h. L'augmentation de la transcription et de la traduction de CHOP (DDIT3, GADD153) est une caractéristique du stress ER et le modèle d'expression différentielle ressemble à GADD34, sauf que log2 supérieur à 1 se produit après 24 h et se stabilise progressivement par la suite (log2 est égal à 1,3) (Figure 5D, G). En outre, CEBPB, le partenaire dimérisant prédominant de CHOP, est régulé positivement dans notre ensemble de données (Figure 5D, G). Ces résultats suggèrent que même si le stress ER induit par Stx2- commence très tôt dans le temps, il augmente l'effet jusqu'à 24 h et maintient ce niveau de stress ER jusqu'à la fin tandis qu'un bras de rétroaction négative s'équilibre également simultanément.

3.2.3. Activité (III), activité de la protéine d'inactivation des ribosomes (RIP)

En clivant une adénine de l'ARNr, les Stx inhibent la synthèse protéique de novo. L'ARNr dépuriné influence l'altération de la morphologie ribosomale, qui active la transduction du signal [11] connue sous le nom de réponse au stress ribotoxique (RSR), conduisant à une activation génique caractéristique (voir paragraphe suivant).

3.2.4. Activité (IV), activité de réponse au stress ribotoxique (RSR)

ZAK (une MAPKKK) est la kinase connue dans RSR et active les voies en aval de la kinase terminale JUN N (JNK) et p38 MAPK (12, 15). Stx1 induit l'expression des ARNm de JUN et FOS dans les cellules épithéliales intestinales humaines et cet événement a nécessité une activité RIP positive de Stx1 qui serait sous contrôle RSR [15]. Une autre molécule en aval de RSR, p38 MAPK, est connue pour induire des gènes de réponse précoce tels que JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 et ATF3 (54), qui ont tous été exprimés de manière différentielle dans notre ensemble de données. Les voies JNK et p38 MAPK sont également connues pour être activées en aval des événements d'Ire-1 sous UPR (Figures 4B, D et 5B, E, F) [47]. Pour cette raison, les Stxs peuvent activer ces deux voies via RSR et/ou UPR. La voie extracellulaire de la kinase régulée par le signal (ERK) 1/2 se trouve également en aval de RSR [55] et le gène DUSP1 (MKP1) est connu pour être induit par la voie ERK1/2 [56]. Stx1 et l'anisomycine (un autre inhibiteur de la synthèse des protéines) sont capables d'induire l'expression de DUSP1 dans les cellules Caco-2 (57). Dans notre ensemble de données, l'expression de DUSP1 a été induite, ce qui peut indiquer l'activation de ERK1/2 (Figure 4B, D).

3.2.5. Activité (V), transcription génique particulière menant à la cytokine

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 après 24 et 48 h, respectivement (figure 5F). Cela suggère que les gènes hat sous les deux voies NF-κB, IκB (classique) et RelB (alternative), sont induits. Lorsque l'expression différentielle de CHOP (DDIT3) dépasse log2 supérieur à 1 après 24 h, le rein de souris subit un UPR, ce qui active PERK phosphoryle la sous-unité alpha du facteur 2 d'initiation de la traduction eucaryote (eIF2) pour inhiber la traduction de NFKBIA (60). Pour cette raison, une augmentation de l'ARNm de NFKBIA peut ne pas inhiber une grande partie de la voie NF-κB, la transcription des facteurs inflammatoires est donc autorisée (Figure 5L).

Sobbe et coll. [61] ont montré que les voies NF-κB classiques (RelA-p50) et alternatives (RelB-p52) étaient actives chez les souris ayant reçu une injection de Stx, détectant une régulation positive des cytokines cibles de RelA CCL20, CXCL1 et CXCL10 qui étaient également exprimées différentiellement dans notre ensemble de données (Figure 5L).

3.2.6. Activité (VI), apoptose induite par Stxs

La caspase 3 clivée a été trouvée dans la mort cellulaire associée à Stxs (13, 15, 62). Il a été démontré que l'activation de la caspase -3 ou l'induction de l'apoptose par Stxs se produit dans le contexte du RSR et de l'UPR. Dans le RSR induit par Stxs, les voies p38 MAPK et JNK sont impliquées (15), ainsi que l'activation de ERK est rapportée (55). L'UPR, en revanche, est connu pour induire les voies NF-κB, JNK et p38 MAPK. CHOP (DDIT3) sous UPR s'avère impliqué dans l'apoptose (63) et il a également été démontré dans l'apoptose associée à Stxs (13). L'implication de JNK dans l'apoptose induite par l'UPR a également été rapportée (64). Dans notre ensemble de données, plusieurs DEG tels que CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN et JUNB sont impliqués dans RSR et UPR (Figure 5B, F).

3.3. Dysrégulation circadienne par Stx2

Une augmentation de l'endothéline sérique-1 (ET-1, EDN1) survient chez les patients STEC-HUS [65]. De plus, expérimentalement, Stx2 induit l'expression d'EDN1 en activant des cascades de transduction de signal impliquant des MAPK (66), tandis que l'UPR est connu pour induire la transcription d'EDN1 (67). Dans notre ensemble de données, l'expression d'EDN1 induite par le traitement Stx2 dans les cellules tubulaires proximales du rein de souris et de l'humain (Figure 5G). Comme l’expression du gène EDN1 était un dénominateur commun des cellules épithéliales tubulaires proximales du rein de souris et de l’humain, cela montre que l’expression d’EDN1 se produit, au moins en partie, dans les cellules épithéliales tubulaires proximales in vivo en plus des cellules endothéliales. De plus, l'ET sécrété -1 induit l'expression d'EGR1 via l'activation de MAPK (68). Nos données confirment la régulation positive de EGR1 au moment où EDN1 est régulée positivement (Figure 5H). EGR1 induit l’expression du facteur clé du rythme circadien PER1 [69], ajustant ainsi l’amplitude d’autres facteurs circadiens (Figure 5H).

Dans la régulation circadienne, l'hétérodimère de CLOCK-BAML1 (ARNTL) régule positivement PER1 et CRY1. En retour, l'hétérodimère PER1-CRY1 se lie à CLOCK-BAML1 (ARNTL) pour supprimer sa propre transcription, créant ainsi une boucle négative du rythme circadien. Ainsi, les pics d'expression des gènes régulateurs positifs (CLOCK et BAML1 (ARNTL)) et des gènes régulateurs négatifs (PER1 et CRY1) se produisent à une heure alternée. Lorsque CLOCK et BAML1 (ARNTL) ont une augmentation d'expression, PER1 et CRY1 sont diminués, et le modèle change dans les heures suivantes. Lorsque nous avons ajouté les valeurs de changement log2-fold de CLOCK et BAML1 (ARNTL) au graphique (Figure 5J), au cours des points temporels précédents, PER1 et BAML1 (ARNTL) ont montré un modèle rythmique opposé avec des pics nets/étroits, cependant, après 24 heures, les pics ont commencé à devenir ternes et à augmenter continuellement sans rythme. Cela implique que Stx2 a influencé le rythme circadien rénal, y compris au sein des tubules proximaux. Bien qu'une autre expérience de confirmation soit nécessaire, nos données combinées à la littérature publiée décrivant l'effet de PER1 sur la régulation circadienne rénale lors de stimuli [70,71], suggèrent une implication possible de Stx2 dans les perturbations du rythme circadien et ses effets sur les fonctions tubulaires proximales en réduisant les gènes de l'horloge rénale. facteurs régulés tels que SGLT1 (SLC5A1) (Figure 5K). En effet, nous avons observé une glycosurie chez des souris ayant reçu une injection de Stx2- qui se reproduisent dans une autre étude avec des souris ayant reçu une injection de Stx1- [21], indiquant un dysfonctionnement du SGLT1 (SLC5A1) dans les tubules proximaux (Tableau 3). À notre connaissance, il s'agit du premier rapport indiquant l'implication de Stx2 dans les troubles du rythme circadien rénal.

4. Conclusions

Nous avons déterminé des gènes importants concernant les expressions associées aux tubules proximaux qui ont été modifiées par Stx2. L'expression différentielle de ces gènes est supposée être le résultat des activités de Stx2 telles que l'induction de l'UPR, le RSR associé à la dépurination de l'ARNr et la transduction du signal induite par la liaison du récepteur membranaire Gb3. Le gène le plus fortement exprimé, GDF15, peut influencer la perte de poids provoquée par Stx2 via les récepteurs restreints au tronc cérébral en réduisant la consommation alimentaire. La matrice extracellulaire et l'adhésion cellulaire peuvent être influencées par PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 et CTGF qui provoquent une histopathologie spécifique à Stx2- et une desquamation. De plus, une perturbation du rythme circadien rénal par Stx2 peut entraîner des défauts fonctionnels tubulaires proximaux tels que la réabsorption du glucose.

5. Matériels et méthodes

5.1. Animaux Souris

(C57BL/6, mâle, 19-22 g, exempt d'agent pathogène spécifique) ont été achetés auprès de Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japon). La nourriture et l'eau étaient distribuées à volonté. Les souris ont été maintenues avec un cycle lumière-obscurité standard de 12 h : 12 h au cours duquel la lumière est allumée à 7 heures du matin et s'éteint à 19 heures. La température ambiante des animaux a été maintenue autour de 24 ◦C. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité universitaire de protection des animaux.

5.2. Tissu rénal humain

Des tissus cadavériques sans aucun identifiant personnel ont été utilisés dans cette étude et sont considérés comme exemptés par les directives d'investigation humaine de l'Université.

5.3. Culture de cellules

La culture primaire de cellules épithéliales tubulaires proximales rénales humaines (RPTEC) a été achetée chez Clonetics (Walkersville, MD, USA) et maintenue à 37 ° C, atmosphère à 5% de CO2. Les cellules ont été cultivées dans un milieu de croissance de cellules épithéliales rénales additionné de facteur de croissance épidermique humain, d'hydrocortisone, d'épinéphrine, d'insuline, de tri-iodothyronine, de transferrine, de GA-1000 et de FBS.

5.4. Purification du Stx2 sans LPS L'élimination du LPS de Stx2 a été réalisée comme décrit précédemment (72). En bref, la colonne conjuguée à l'anticorps anti-Stx2 11E10 a été utilisée pour obtenir la fraction Stx2, et la fraction a ensuite été passée sur Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) pour supprimer LPS. La fraction Stx2 a été filtrée avec un filtre 0,2 µm et le niveau de LPS a été testé avec le test de lysat d'amibocytes de Limulus (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA). La fraction Stx2 a été déterminée comme ayant moins de 0,03 unité d’endotoxine (UE)/mL. Le type de variante Stx2 était Stx2a.

5.5. Administration de Stx2 à des souris Une dose de 2LD50 (5 ng Stx2/20 g de poids corporel), qui tue les souris en quatre jours (Figure S3A), a été injectée à des souris par voie intrapéritonéale dans un volume de 0,1 ml dans une solution saline sans LPS. (Otsuka pharmaceutique, Japon). L'injection de toxine a été effectuée entre 7 h et 9 h, au cours de laquelle des souris ayant reçu un traitement plus long ont reçu Stx2 à 7 h, suivies d'un échantillonnage de 24, 48 et 72 h à 7 h.

5.6. Collecte d'urine et mesure du glucose urinaire Après 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 et 84 h d'injection de Stx2, l'urine a été prélevée et 10 µL ont été déposés sur une lame de chimie sèche Fuji GLU- Le P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japon) et le glucose urinaire ont été mesurés avec Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) dans l'établissement géré par. L'urine provenant de l'injection pré-Stx2 a été utilisée comme échantillon à 0 h. La collecte d'urine a été réalisée avec deux souris

5.7. Traitement des tissus Après 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 et 72 h d'injection de Stx2, trois souris par instant ont été euthanasiées par du CO2 et les reins ont été prélevés. La moitié d'un rein a été fixée avec une solution saline tamponnée au paraformaldéhyde/phosphate à 4 % pendant 7 jours à 4 ◦C et traitée pour la coupe en paraffine. Une autre moitié du rein a été utilisée pour extraire l’ARN pour l’analyse par micropuce. Trois souris sans aucun traitement ont été utilisées comme contrôle normal (naïf ou 0 h). Trois souris ont reçu une injection de PBS (véhicule) et ont été sacrifiées au bout de 72 h et ont servi de véhicule témoin pour montrer qu'il existe des changements négligeables dans l'expression des gènes par rapport au contrôle normal.

5.8. Coloration à l'acide périodique-Schiff (PAS) Les coupes de paraffine ont été hydratées et colorées avec une solution d'acide périodique 0, 5 %, suivies d'un rinçage à l'eau distillée. Les coupes ont été transférées au réactif de Schiff. Après avoir soigneusement lavé les coupes avec une solution de bisulfite de sodium à 0,6 %, elles ont été contre-colorées à l'hématoxyline.

5.9. Traitement Stx2 dans le RPTEC humain Les cellules RPTEC ont été traitées avec 10 ng/mL de Stx2 pendant 6, 13 et 19 h sous 37 °C, 5 % de CO2. RPTEC sans traitement Stx2 a été utilisé comme contrôle. Deux répliques biologiques ont été réalisées par instant. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été utilisées pour l’extraction de l’ARN.

5.10. Coloration par immunofluorescence flottante Pour le traitement des sections flottantes, une souris normale a été perfusée-fixée comme décrit dans Obata et al. [69]. Les reins murins ont ensuite été disséqués et immergés dans 4% de PFA/PBS pendant 3 h à 4 °C sous agitation douce. Les tissus ont été lavés avec du PBS et cryoprotégés avec 30 % de saccharose/PBS à 4 °C pendant la nuit ou jusqu'à ce qu'ils coulent au fond. Des coupes épaisses congelées (50 µm) ont été coupées avec un microtome coulissant avec des réglages congelés. Les coupes ont été bloquées avec un anticorps IgM de chèvre anti-rat à 1:50 dans du PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) pendant 1 h et incubées avec un anticorps anti-Gb3/CD77 à 1:100 dans le bloc de blocage. solution ou contrôle isotype (IgM de rat) à une concentration adaptée à celle de l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ◦C. Après lavage, les coupes ont été incubées avec un anticorps secondaire (IgM anti-rat Alexa Fluor 488, dilution 1: 2000 dans du PBS) pendant 2 h à 4 °C. Les coupes ont été colorées pour d'autres sondes AQP1 (dilution 1: 1000, Sigma-Aldrich Japon, Tokyo, Japon) et CD31 (550274, dilution 1:50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) avec des anticorps secondaires anti-IgG de lapin Alexa Fluor 546 (dilution 1 : 2000 dans du PBS) et IgG anti-souris Alexa Fluor 647 (dilution 1 : 2000 dans du PBS), respectivement. Après lavage avec du PBS, une coloration au 40,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI, D21490, Thermo Fisher) a été réalisée pendant 15 minutes à 4 ◦C. Les coupes ont été immergées dans des fluides dans un puits de la plaque à puits 96- (en forme de U) avec un petit rougissement de peinture à chaque changement de solution. L'étape de lavage a été effectuée dans des puits plus grands, tels que des plaques à puits 12- ou 6-. Un milieu de montage aqueux a été utilisé pour le recouvrement. Pour la préparation des tissus humains, le rein post-mortem a été fixé dans du formol à 20 % pendant 2 semaines et traité pour une préparation flottante comme pour les tissus de souris, à une exception près, l'anticorps anti-CD31 humain (CBL468, dilution 1:20, Merck KGaA, Darmstadt , Allemagne) a été utilisé.

5.11. Analyse des puces à ADN

La moitié du rein est immergée dans 2 ml de RNALater (Ambion, Austin, TX, USA) à 4 ◦C et l'ARN total a été extrait avec le kit Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA). Des tableaux Mouse Genome 430A 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, Californie, États-Unis) ont été utilisés. Les fichiers CEL ont été obtenus et normalisés avec une moyenne multi-puces robuste (RMA), le calcul du nombre de copies d'ARN et des changements de repli par rapport à 0 h ont été effectués dans R (v.3.6.0) avec son package affy [73] et RankProd 2.0 [74]. Les données sont affichées sous forme de valeurs de modification log2-fold. L'ensemble de données est déposé sur Gene Expression Omnibus (GEO) (numéro d'accès GSE172465). À partir des cellules RPTEC, l'ARN total a été extrait avec le système d'isolation d'ARN total RNAgents (Promega, Tokyo, Japon). Une micropuce à oligonucléotides du génome humain entier (puce à ADN oligonucléotidique 44K, Agilent Technologies, Tokyo, Japon) a été utilisée pour des expériences sur micropuces. Les échantillons d'ARN total ont été utilisés pour la préparation de sondes d'ADNc marquées Cy5- et Cy3-. Les échantillons marqués au fluorophore ont été hybridés sur chaque lame de verre et lavés, puis numérisés avec un scanner de puces à ADN (modèle G2505A ; Agilent Technologies). Le logiciel d'extraction de caractéristiques et d'analyse d'images (Agilent Technologies) a été utilisé pour localiser et délimiter chaque point du réseau et pour intégrer les intensités, qui ont ensuite été filtrées et normalisées à l'aide de la méthode de lissage des nuages ​​de points pondérés localement. La reproductibilité de l'analyse des puces à ADN a été évaluée par deux répétitions d'échange de colorant dans chaque expérience. Les différences d'expression de l'ARNm entre le RPTEC témoin et le RPTEC traité au Stx2- récolté à 6, 10 ou 19 h ont été comparées. Les données au format TXT du logiciel GeneSpring ont été utilisées pour déterminer les noms de gènes à partir de l'ID de la sonde et convertir les modifications de pli en modifications de journal2-de pli. L'ensemble de données est déposé auprès de GEO (numéro d'accès GSE172466).

5.12. Analyse bioinformatique des données de puces à ADN et visualisation Dans les données de rein de souris et de puces à ADN RPTEC, les gènes qui sont communs aux deux et dont le changement d'expression était plus de 2-fois diminué ou augmenté (ou log2- fois le changement est soit inférieur à -1, soit supérieur à 1) à tout moment ont été sélectionnés par R. De plus, dans les données de microréseaux de rein de souris. Les altérations génétiques adaptées aux courbes cubiques ont été choisies à l'aide du package R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ maSigPro.html (dernière consultation le 4 janvier 2022)] [75]. La courbe cubique convient pour s'adapter à l'augmentation ou à la diminution de ces gènes au cours du temps. Un degré polynomial plus élevé tel qu'une courbe cubique permet de mieux sélectionner des gènes présentant de multiples altérations au cours du temps qu'une courbe quadratique. Les gènes qui se comportaient selon une trajectoire similaire ont été regroupés et leurs modèles de diminution/augmentation ont été visualisés par une carte thermique utilisant les gplots du package R [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (consulté pour la dernière fois le 4 janvier). 2022)] [76]. L'ontologie des gènes (GO) a été attribuée et les fonctions de GO parmi les gènes communs ont été enrichies à l'aide de Metascape [//metascape.org (dernière consultation le 4 janvier 2022)] [77]. La connexion/relation des gènes communs a été analysée à l'aide de STRING [https://string-db.org/ (dernière consultation le 4 janvier 2022)] [78]. L'association entre les gènes communs a été recherchée manuellement ainsi qu'à l'aide de la fonction d'exploration de texte de STRING.

Les références

1. Gianantonio, C. ; Vitacco, M. ; Mendilaharzu, F. ; Rutty, A. ; Mendilaharzu, J. Le syndrome hémolytique-urémique.J. Pédiatre.1964, 64, 478–491. [RéfCross] 

2. Vitski, BH ; Suzuki, Y. ; Strauss, L. ; Churg, J. Le syndrome hémolytique-urémique : une étude des altérations pathologiques rénales.Suis. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T. ; Faire son.; Igarashi, T. ; Yamanaka, T. ; Yoshiya, K. ; Kobayashi, N. La déficience par la vérotoxine de la fonction tubulaire contribue aux lésions rénales observées dans le syndrome hémolytique et urémique.J. Infecter.1993, 27, 339–341. [RéfCross] 

4. Katagiri, YU ; Mori, T. ; Nakajima, H. ; Katagiri, C. ; Taguchi, T. ; Takeda, T. ; Kiyokawa, N. ; Fujimoto, J. Activation de la kinase de la famille Src oui induite par la liaison de la toxine Shiga au globotriaosyl céramide (Gb3/CD77) dans des microdomaines de faible densité et insolubles dans les détergents.J. Biol. Chimique.1999, 274, 35278–35282. [RéfCross] 

5. Takenouchi, H. ; Kiyokawa, N. ; Taguchi, T. ; Matsui, J. ; Katagiri, YU; Okita, H. ; Okuda, K. ; Fujimoto, J. La liaison de la toxine Shiga au globotriaosyl céramide induit des signaux intracellulaires qui interviennent dans le remodelage du cytosquelette dans les cellules dérivées du carcinome rénal humain.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [RéfCross] [PubMed] 

6. Garré, O. ; van Deurs, B. ; Sandvig, K. Clivage induit par la furine et activation de la toxine Shiga.J. Biol. Chimique.1995, 270, 10817–10821. [RéfCross] 

7. Majoul, I. ; Ferrari, D. ; Söling, HD Réduction des liaisons disulfure des protéines en milieu oxydant. Le pont disulfure de la sous-unité A de la toxine cholérique est réduit dans le réticulum endoplasmique.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [RéfCross] 

8. Spooner, RA; Watson, PD ; Marsden, CJ; Smith, DC ; Moore, KAH ; Cuisinier, JP ; Seigneur, JM; Roberts, LM La protéine disulfure isomérase réduit la ricine à ses chaînes A et B dans le réticulum endoplasmique.Biochimie. J.2004, 383, 285–293. [RéfCross] 

9. Yu, M. ; Haslam, la toxine DB Shiga est transportée à partir du réticulum endoplasmique après interaction avec le chaperon luminal HEDJ/ERdj3.Infecter. Immunisé.2005, 73, 2524–2532. [RéfCross] 

10. Falguières, T. ; Johannes, la sous-unité B de la toxine L. Shiga se lie au chaperon BiP et à la protéine nucléolaire B23.Biol. Cellule2006, 98, 125–134. [RéfCross]