Une réponse cytotoxique soutenue des cellules mononucléées du sang périphérique provenant de personnes non vaccinées admises à l'unité de soins intensifs en raison d'un COVID critique -19 est essentielle pour éviter une issue fatale

Abstrait: L'objectif principal de cette étude était de déterminer l'influence de l'activité cytotoxique des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sur le résultat des individus non vaccinés atteints de COVID critique-19 admis en soins intensifs. Des échantillons de sang de 23 personnes ont été prélevés à l'admission, puis toutes les 2 semaines pendant 13 semaines jusqu'au décès (groupe Exitus) (n=13) ou à la sortie (groupe Survie) (n=10). Nous n'avons pas trouvé de différences significatives entre les groupes dans les données sociodémographiques, cliniques ou biochimiques pouvant influencer l'issue fatale. Cependant, la cytotoxicité cellulaire directe des PBMC des individus du groupe Exitus contre les cellules Vero E6 pseudotypées infectées par le SRAS-CoV -2- était significativement réduite à l'admission (−2, 69- fois ; p=0. 0234) et après 4 semaines aux soins intensifs (−5,58-fois ; p=0,0290), en comparaison avec les individus qui ont survécu, et cela ne s'est pas amélioré pendant l'hospitalisation. In vitro, le traitement par IL-15 de ces cellules n'a restauré une cytotoxicité efficace à aucun moment jusqu'à l'issue fatale, et une expression accrue de marqueurs d'épuisement immunitaire a été observée dans NKT, CD4+ et CD. 8+ Cellules T. Cependant, le traitement par IL-15 des PBMC des individus du groupe Survie a significativement augmenté la cytotoxicité à la semaine 4 (6,18-fois ; p=0,0303). Par conséquent, les traitements immunomodulateurs capables de surmonter l’épuisement immunitaire et d’induire une activité cytotoxique soutenue et efficace pourraient être essentiels à la survie pendant l’hospitalisation en raison d’un COVID critique-19.

Mots clés : SRAS-CoV-2 ; COVID-19 ; réponse immunitaire; réponse cytotoxique ; IL-15

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1. Présentation

Plusieurs cas de pneumonie virale atypique liés à une épidémie dans un marché de fruits de mer de la ville de Wuhan (province du Hubei, Chine) ont été détectés en décembre 2019. Un nouveau coronavirus appelé coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a rapidement s'est propagé à travers le monde, provoquant la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) [1]. Depuis lors, environ 626 millions de cas de COVID-19 et 6,5 millions de décès associés ont été signalés dans le monde (mis à jour en octobre 2022) [2]. Différents facteurs de risque et comorbidités peuvent influencer la progression du COVID-19 parmi les individus, ce qui a affecté la comparaison des données cliniques entre les pays touchés depuis le début de la pandémie [3]. Cependant, il a été déterminé que les manifestations cliniques du COVID-19 peuvent varier d'une infection asymptomatique au syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) [4]. Parmi les différents facteurs de risque associés à une probabilité plus élevée de développer une forme grave de COVID-19 figurent la vieillesse, le sexe masculin et les comorbidités antérieures telles que le diabète, l'hypertension et/ou l'obésité [5,6]. Un COVID grave et critique-19 a également été associé à une cytopénie, principalement des lymphocytes T CD4+, ainsi qu'à un épuisement excessif des lymphocytes T tueurs naturels (NK) et CD8+, qui entraîne un état d'immunodépression incapable d'éliminer l'infection, en plus du développement de complications graves telles qu'une tempête de cytokines et des événements thrombotiques [7]. La principale cause de développement d'une forme grave de la maladie et de décès chez les patients atteints de COVID-19 a été considérée comme une réponse inflammatoire excessive pouvant favoriser le développement d'un choc et/ou d'une hypercytokinémie avec dysfonctionnement multiorganique [4]. Ce syndrome est connu sous le nom de tempête de cytokines [8] et s’apparente à la maladie de la lymphohistiocytose hémophagocytaire (sHLH), qui consiste en un état d’hyperinflammation déclenché par une infection virale [9,10]. Cela peut être lié au fait que le SRAS-CoV-2 utilise le récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) pour infecter les cellules cibles. La liaison du SRAS-CoV-2 au récepteur ACE2, largement exprimé par les cellules de différents tissus [11], entraîne une augmentation de l'angiotensine II, qui active le facteur nucléaire-κB (NF-κB). L'activation de ce facteur de transcription essentiel stimule l'expression de cytokines pro-inflammatoires, de chimiokines et de molécules d'adhésion [12]. Malgré cette réponse inflammatoire excessive, il semble inefficace d’éliminer l’infection et, en raison de l’activation des lymphocytes T, peut aboutir à l’apoptose [13]. Cette tempête de cytokines peut être responsable d'une lymphopénie [12,14] mais également d'une diminution des taux de lymphocytes T NK et CD8+ avec un phénotype épuisé et d'une expression accrue de récepteurs inhibiteurs tels que NKG2A dans les cellules NK et PD{{47. }} dans les lymphocytes T CD8+ [15,16]. De plus, l'expression de marqueurs de dégranulation tels que CD107a est généralement réduite à la surface de ces cellules [15], prouvant l'existence d'une altération de la capacité à éliminer les cellules infectées chez les individus atteints de COVID sévère et critique-19 [17 ]. Malgré la réponse mondiale rapide pour développer et administrer des vaccins efficaces, l’émergence de nouveaux variants susceptibles d’échapper à la réponse immunitaire induite par le vaccin a entraîné un déclin rapide de la protection contre les maladies symptomatiques [18]. Par conséquent, il est nécessaire de poursuivre la recherche de thérapies efficaces contre le COVID-19. Plusieurs traitements ont été testés pour améliorer l’état des personnes hospitalisées en raison d’une maladie grave et critique, mais aucun n’a encore été prouvé comme étant spécifique pour éliminer les cellules infectées ou réduire le taux d’infection [15,19]. Par conséquent, les traitements de soutien tels que l'oxygénothérapie et la fluidothérapie restent parmi les stratégies les plus importantes appliquées pour la prise en charge de ces personnes [2,4,16,20]. Des traitements non spécifiques tels que les corticostéroïdes ont également été bénéfiques pour contrôler et réduire la réponse inflammatoire excessive [21,22]. Récemment, plusieurs médicaments ont été autorisés par la FDA pour le traitement des personnes atteintes de COVID léger à modéré-19, comme le molnupiravir, le nirmatrelvir et le ritonavir, mais uniquement en cas d'urgence pour les personnes présentant un risque élevé. évoluer vers une maladie grave [23-26]. Le molnupiravir présente une activité antivirale à large spectre en raison de sa capacité à induire une mutagenèse d'ARN par interférence avec plusieurs ARN polymérases virales ARN-dépendantes (RdRp), y compris la RdRp utilisée par le SRAS-CoV-2 pour la réplication et la transcription de son Génome ARN [27]. Il a également été démontré que l'association du nirmatrelvir et du ritonavir était capable d'arrêter la propagation de l'infection dans des modèles animaux en inhibant la principale protéase virale 3CLpro du SRAS-CoV-2- 2 [28]. Cependant, ces médicaments antiviraux doivent être administrés en conjonction avec d’autres mesures telles que les vaccins afin de déclencher une puissante réponse immunitaire cytotoxique capable d’éliminer les cellules infectées. La plupart des cellules ayant une activité cytotoxique, telles que les lymphocytes T CD8+ et les cellules NK et NKT, nécessitent la présence d'interleukine-15 (IL-15) pour leur fonction et leur régulation homéostatique (29). L'IL-15 prépare les lymphocytes T CD8+ à leur activation par des antigènes spécifiques et améliore également la cytotoxicité et la prolifération des cellules NK. Par conséquent, l'IL-15 peut améliorer les réponses immunitaires cellulaires innées et adaptatives contre les cellules infectées [22,25]. L'IL-15 empêche également l'apoptose des cellules NK et T en régulant positivement les facteurs anti-apoptotiques tels que Bcl-2 et en régulant négativement les facteurs pro-apoptotiques tels que GSK-3 [26], évitant ainsi la cytopénie. En conséquence, l'IL-15 a été proposée comme nouvelle cytokine immunomodulatrice en immunothérapie anticancéreuse et a été considérée comme un adjuvant dans les schémas vaccinaux (26,30). Les essais cliniques de phase 1 avec une perfusion iv en bolus humain d'IL-15 (rhIL-15) ou du superagoniste de l'IL-15 N-803 ont démontré que cette cytokine peut induire une expansion et/ou une activation significative. de cellules effectrices CD4+, CD8+ et NK in vivo, et par conséquent, il a été appliqué pour traiter le cancer ou les infections virales telles que le VIH [31-35]. Par conséquent, l'utilisation d'agents immunomodulateurs tels que l'IL-15 qui peuvent restaurer l'activité cytotoxique chez les personnes hospitalisées en raison d'un COVID critique-19 pourrait être utile pour aider à éliminer le virus de l'organisme. Dans cette étude observationnelle et longitudinale, nous avons caractérisé l'évolution de la réponse immunitaire cytotoxique contre le SRAS-CoV-2 dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) isolées d'individus diagnostiqués avec le COVID-19 qui ont été admis dans le programme intensif. unité de soins intensifs (USI) en raison de complications graves, ainsi que l'influence de cette réponse sur le résultat final par rapport à d'autres facteurs de risque essentiels. Nous avons également évalué la capacité de ces cellules à répondre au traitement par IL-15 et à améliorer leur réponse antivirale cytotoxique. Les résultats obtenus dans cette étude pourraient contribuer à une meilleure compréhension du rôle de la réponse cytotoxique dans l’issue fatale du COVID-19 et à progresser vers le développement de traitements immunomodulateurs efficaces favorisant la clairance virale.

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2. Matériels et méthodes

2.1. Sujets d'étude

Vingt-trois personnes atteintes d'un COVID critique-19 admises à l'unité de soins intensifs de l'hôpital universitaire Ramón y Cajal (Madrid, Espagne) d'octobre 2020 à avril 2021 ont été recrutées pour cette étude. Cette période couvrait à la fois les deuxième et troisième vagues pandémiques de COVID-19 en Espagne (de juin à décembre 2020 et de décembre 2020 à mars 2021, respectivement). Les participants ont été recrutés au hasard lors de leur hospitalisation selon les critères suivants : autorisation d'un consentement éclairé écrit ou oral devant témoin pour participer à l'étude, hospitalisés à l'USI en raison d'un COVID critique-19, SARS-CoV positif-2 Test RT-qPCR sur frottis nasopharyngé réalisé à l'admission à l'hôpital selon des protocoles internes validés, âgé de plus de 18 ans et non vacciné contre le SRAS-CoV-2 au moment de l'infection. Des échantillons de sang périphérique et des données cliniques ont été collectés toutes les 2 semaines pendant un total de 13 semaines, et les échantillons de sang ont été traités et cryoconservés jusqu'au moment de l'analyse. Cette période a été calculée en tenant compte du fait que la durée d'hospitalisation en Espagne lors des premières vagues pandémiques était estimée à 35 jours en moyenne [36], ce qui a permis de réaliser au moins deux cycles complets de recrutement et de suivi. Après 13 semaines, les participants ont été répartis en deux groupes selon l'issue finale : issue fatale (n=13), désormais Exitus ; ou sortie d'hôpital (n=10), désormais Survival.

2.2. Déclaration éthique

Les personnes ayant participé à cette étude ont été recrutées à l'hôpital universitaire Ramón y Cajal (Madrid, Espagne). Tous ont donné leur consentement écrit éclairé pour participer à l'étude ou ont été témoins du consentement oral avec le consentement écrit d'un représentant pour éviter de manipuler des documents contaminés. Les lois espagnoles et européennes actuelles sur la protection des données garantissent la confidentialité et l'anonymat de tous les participants. Le protocole de cette étude (CEI PI 32_2020-v2) a été préparé conformément à la Déclaration d'Helsinki et préalablement examiné et approuvé par les comités d'éthique de l'Instituto de Salud Carlos III (IRB IORG0006384) et de l'hôpital participant.

2.3. Cellules

Cinq millilitres de sang total ont été collectés dans des tubes EDTA Vacutainer (Becton Dickinson, Madrid, Espagne) et immédiatement traités pour isoler les PMBC et le plasma par centrifugation sur gradient de densité Ficoll-Hypaque (Pharmacia Corporation, North Peapack, NJ, USA), puis ils ont été cryoconservé jusqu'à l'analyse. La viabilité cellulaire après décongélation a été évaluée par microscopie optique et cytométrie en flux. La lignée cellulaire Vero E6 (rein de singe vert d'Afrique) (ECACC 85020206) a été aimablement fournie par le Dr Antonio Alcami (CBM Severo Ochoa, Madrid, Espagne), et ces cellules ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de SVF, 2 mM de L- glutamine et 100 unités/mL de pénicilline et de streptomycine (Lonza, Bâle, Suisse).

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2.4. Test d'infection pseudotypé par le SRAS-CoV-2

L'activité cytotoxique contre le SRAS-CoV-2 des PBMC des participants a été analysée à l'aide de cellules Vero E6 infectées par le virus pseudotypé à cycle unique pNL4-3∆env_SARS CoV-2-S ∆19(G614)_Ren. Ce virus code pour la glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 avec la mutation D614G dans le génome du VIH-1, ainsi que pour le gène de la luciférase Renilla généré comme décrit précédemment [37,38]. Des variantes du SRAS-CoV-2 contenant la mutation D614G dans la protéine Spike (S) ont commencé à circuler au début de la pandémie et sont devenues rapidement dominantes dans de nombreuses régions [39,40]. En bref, une monocouche de Vero E6 a été infectée par pNL4-3∆env_ SARS-CoV-2-S∆19(G614)_Ren (100 ng p24 Gag/puits ) pendant 48 heures. Ensuite, les cellules ont été lavées et co-cultivées pendant 1 h avec les PBMC des participants (rapport 1:1), préalablement traitées ou non avec de l'IL-15 (13 ng/mL) pendant 48 h. La dose d'IL-15 utilisée pour cette étude a été sélectionnée en tenant compte de la dose décrite précédemment qui provoque l'effet le plus élevé sur la prolifération des NK (10–25 ng/mL) [41] et également de l'expansion préférentielle de la mémoire cytotoxique. Cellules T CD8+ (inférieures ou égales à 5 ng/mL) [42]. L'activité cytotoxique des PBMC sur la monocouche de Vero E6 a été déterminée après élimination du surnageant avec les cellules en suspension et dissociation des cellules Vero E6 de la plaque avec une solution trypsine-EDTA (Sigma Aldrich-Merck, Darmstadt, Allemagne) et quantification ultérieure de l'activité de la caspase -3 dans les cellules détachées par luminescence à l'aide du système d'analyse Caspase-Glo 3/7 (Promega, Madison, WI, USA). Afin de déterminer quelles populations de cellules cytotoxiques étaient responsables de cette activité, les PBMC ont été collectées dans le surnageant puis analysées par cytométrie en flux.

2.5. Analyse par cytométrie en flux

Pour la coloration des marqueurs de phénotypage de la surface cellulaire, les anticorps conjugués suivants ont été utilisés : CD{{0}}PE, CD8-APC-H7, CD56-FITC et CD1{{24. }}7a-PE-Cy7, acheté auprès de BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Pour la coloration des marqueurs d'épuisement, les anticorps conjugués suivants ont été utilisés : CD3-BV510, CD8-APC-H7, CD56-FITC et PD1-BV650, achetés auprès de BD Biosciences, ainsi que CD4-PE, achetés auprès d'Immunostep SL (Salamanque, Espagne) et TIGIT-AlexaFluor700 achetés auprès de Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Les échantillons ont été acquis à l'aide du cytomètre en flux BD LSRFortessa X-20 avec le logiciel FACS Diva v 6.0 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), puis analysés à l'aide du logiciel FlowJo v10.0.7 (Tree Star Inc., Ashland, OR , ETATS-UNIS).

2.6. Détection de l'ARNémie du SRAS-CoV-2

L'ARN total a été extrait d'échantillons de plasma à l'aide du kit QIAamp MinElute Virus (Qiagen Iberia, Madrid, Espagne) dans un extracteur automatisé QIAcube (Qiagen, Hilden, Allemagne). La détection de l'ARN du SRAS-CoV-2 a été réalisée par test RT-qPCR avec des cibles dans les gènes de l'enveloppe (E) et de la nucléocapside (N), comme décrit précédemment [43], qui fait partie des directives provisoires du World Health Organisation (OMS) pour les tests de diagnostic du SRAS-CoV- 2 [44]. Les échantillons étaient considérés comme positifs pour l’analyse lorsque la valeur du cycle de quantification (Cq) était inférieure à 45 cycles.

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2.7. Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques et graphiques ont été réalisés à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 8.4.3 (GraphPad Software Inc., San Diego, Californie, États-Unis). Les comparaisons de groupes ont été effectuées à l'aide du test U de Mann – Whitney, du test de classement signé par paires appariées de Wilcoxon, de l'ANOVA unidirectionnelle et du test de comparaisons multiples de Tukey. Le test exact de Fisher a été utilisé pour évaluer les différences dans les caractéristiques cliniques entre les deux groupes. Les valeurs de p < 0.{{10}}5 (bilatéral) ont été considérées comme statistiquement significatives. La moyenne et l'écart type ont été utilisés pour calculer la statistique d de Cohen à l'aide d'un calculateur de taille d'effet Excel [45]. Une taille d'effet de 0,2, 0,5, 0,8 ou supérieure ou égale à 1,2 était une indication de tailles d'effet petites, moyennes, grandes et très grandes, respectivement [46].

3. Résultats

3.1. Caractéristiques des participants

Cette étude observationnelle et longitudinale a inclus 23 patients diagnostiqués avec COVID-19 qui ont été admis aux soins intensifs en raison de complications graves. Des échantillons de sang ont été prélevés toutes les 2 semaines pendant un total de 13 semaines ou jusqu'au résultat final. Aucun des participants à cette étude n’était vacciné contre le COVID-19 au moment de l’infection et de l’hospitalisation. Les principales caractéristiques sociodémographiques et cliniques de tous les participants sont résumées dans le tableau 1.

Tableau 1. Données démographiques et cliniques de tous les participants du groupe Exitus et du groupe Survie recrutés pour cette étude.

L'âge médian du groupe Exitus était de 65,0 ans (IQR 62,0–69,0), tandis que l'âge médian du groupe Survie était de 63,{{7}. } ans (IQR 59.0–68,5). La plupart des participants (73,9 %) étaient des hommes et 65,2 % présentaient au moins une comorbidité. Les principales comorbidités étaient la dyslipidémie (52,2 %), l'hypertension (39,1 %) et le diabète sucré (26,1 %). La plupart des patients ont reçu des corticoïdes (82,6 %), des antibiotiques (82,6 %) et des anticoagulants (82,6 %) comme traitement standard. Ils ont également reçu d'autres traitements comme le tocilizumab (17,4 %) et le remdesivir (8,7 %). Les signes et symptômes les plus courants étaient la pneumonie (1 00 %), la toux et l'expectoration (87, 0 %), la dyspnée (87,0 %) et la fièvre (87,0 %). Durant leur séjour à l'USI, 12 patients (92,3 %) du groupe Exitus et 10 patients (100 %) du groupe Survie ont nécessité une ventilation mécanique invasive. Nous n'avons pas trouvé de différences significatives entre les deux groupes dans les données sociodémographiques et cliniques. Nous avons également analysé les données de biochimie sanguine au départ (premier échantillon) entre les deux groupes, et nous n'avons pas non plus trouvé de différences significatives entre les groupes. Des informations plus détaillées sur les données cliniques, les hospitalisations et les données de biochimie sanguine de chaque participant sont présentées dans les tableaux supplémentaires S1 et S2.

3.2. Durée du séjour à l'hôpital et aux soins intensifs

La durée médiane d'hospitalisation était de 59,0 (IQR 36,0–100.0) jours dans le groupe Exitus et de 73. 0 (IQR 44,5–90.{{20}}) jours dans le groupe Survie (Figure 1A). La durée médiane du séjour en soins intensifs était de 49,0 (IQR 25,5 à 82,0) jours dans le groupe Exitus et de 44,0 (IQR 25,0 à 66,5) jours dans le groupe Survie (Figure 1B). Aucune différence significative dans ces paramètres n'a été trouvée entre les deux groupes.

Figure 1. Durée du séjour à l’hôpital et en soins intensifs. Durée du séjour à l'hôpital (A) et aux soins intensifs (B) (jours) chez les personnes atteintes d'un COVID critique-19 qui ont été divisées en deux groupes en fonction de l'issue finale : issue fatale, groupe Exitus (points remplis) ; ou rétablissement et sortie de l’hôpital, groupe de survie (points vides). Chaque point correspond à un individu et les lignes verticales représentent la moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney.

3.3. Niveaux de lymphocytes du sang périphérique

Les individus du groupe Exitus présentaient une lymphopénie (<1000 cells/mm3 ) only at the time of hospitalization (t = 0), but at Week 2, all participants showed levels of lymphocytes above the threshold for lymphopenia (Figure 2). Lymphocyte count was 1.54 (p = 0.0318; Cohen's d = 1.00)- and 1.71 (p = 0.0030; Cohen's d = 3.17)-fold higher in patients from the Survival group in comparison with the Exitus group at baseline and after 4 weeks of hospitalization, respectively. Although both groups showed an increase in the levels of lymphocytes in peripheral blood during hospitalization, they remained on average 1.54-fold higher in individuals of the Survival group in comparison with the participants of the Exitus group for at least 10 weeks. In the Survival group, the lymphocyte counts steadily increased until Week 6 of hospitalization and then decreased until Week 10.

Figure 2. Nombre de lymphocytes du sang périphérique pendant une hospitalisation en raison d'un COVID critique-19. Le nombre de lymphocytes (cellules/mm3) a été déterminé toutes les 2 semaines pendant un total de 13 semaines ou jusqu'au résultat final à partir d'échantillons de sang provenant des participants des groupes Exitus (points remplis) et Survie (points vides). Le seuil de lymphopénie est indiqué à 1 000 cellules/mm3 avec une ligne pointillée. Chaque point correspond à la moyenne des données et les lignes verticales représentent SEM. La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney et, au sein des groupes, le test U de Wilcoxon a été utilisé.

3.4. Activité cytotoxique des PBMC contre les cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV pseudotypé-2

Nous avons évalué l'activité cytotoxique des PBMC des patients hospitalisés dans les échantillons longitudinaux en quantifiant l'activation de la caspase-3 dans une monocouche de cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV pseudotypé-2 après co-culture pendant 1 h ( rapport 1:1). La capacité cytotoxique des PBMC isolées chez les individus du groupe Exitus n'a pas changé de manière significative au cours de l'hospitalisation et est restée faible jusqu'à l'issue fatale (Figure 3). Cette activité cytotoxique n'a pas augmenté de manière significative lorsque ces cellules ont été stimulées par IL-15 pendant 48 h. Dans le groupe Survie, l'activité cytotoxique des PBMC a été augmentée de 2,69-fois (p=0,0234 ; d de Cohen=1,12) dans l'échantillon basal (t {{17} }) par rapport au groupe Exitus, et elle a augmenté régulièrement jusqu'à la semaine 6 d'hospitalisation. Cette augmentation a montré une signification statistique dans la comparaison entre les groupes à la semaine 4 (5,58-fois ; p=0,0290 ; d de Cohen=1,28). À partir de la semaine 6, l'activité cytotoxique a diminué dans le groupe Survie jusqu'à la sortie de l'hôpital, ce qui était conforme à la diminution du nombre de lymphocytes au cours de la même semaine d'hospitalisation (voir Figure 2). Le traitement par IL-15 a augmenté de 2,30-fois en moyenne l'activité cytotoxique des PBMC des individus du groupe Survie dans tous les échantillons au cours du suivi. Après 4 semaines d'hospitalisation, l'activité cytotoxique induite par l'IL-15- a été multipliée par 6,18- (p=0,0303 ; d de Cohen=1,05) dans les PBMC du individus du groupe Survie.

Figure 3. Cytotoxicité cellulaire directe des PBMC isolées de patients hospitalisés atteints d'un COVID critique-19. La capacité cytotoxique des PBMC des individus des groupes Exitus (points remplis) et Survival (points vides) a été mesurée en quantifiant l'activité de la caspase-3 dans une monocouche de cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV pseudotypé-2 après co-culture (1:1) pendant 1 h dans des conditions basales (lignes grises) ou après traitement avec IL-15 pendant 48 h (lignes noires). Chaque point correspond à la moyenne des données et les lignes verticales représentent SEM. La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney et, au sein des groupes, le test U de Wilcoxon a été utilisé.

3.5. Niveaux de cellules NK et NKT

Les niveaux de cellules présentant des phénotypes cytotoxiques ont été analysés dans les PBMC co-cultivées avec des cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV pseudotypé-2. Nous n'avons pas trouvé de différences significatives entre les niveaux de cellules de phénotype NK (CD3-CD56+) entre les deux groupes d'individus, même après un traitement par IL-15 (Figure 4A). L'expression du marqueur de dégranulation CD107a à la surface de ces cellules est restée inchangée chez les individus du groupe Exitus. Bien que cette expression ait augmenté régulièrement à partir de la semaine 4 jusqu'à la sortie de l'hôpital dans le groupe Survie, cette différence n'a pas atteint une signification statistique dans la comparaison avec le groupe Sortie (Figure 4B). Le traitement par IL-15 n'a pas modifié de manière significative l'expression de CD107a dans ces cellules. À partir de la semaine 4, les PBMC des individus des deux groupes ont montré une augmentation des niveaux de cellules avec un phénotype NKT (CD3+CD56+) qui était 4,17-fois plus élevée dans les PBMC de les individus du groupe Exitus à la semaine 6, bien que cette différence ne soit pas significative (p=0,0571 ; Cohen's d=3,15) (Figure 5A). Cette augmentation était légèrement plus élevée lorsque les cellules étaient traitées avec IL-15 dans les deux groupes, bien que les données n'atteignent pas non plus une signification statistique (Figure 5A). L'expression de CD107a n'a pas changé de manière significative entre les deux groupes ou après un traitement par IL-15 (Figure 5B).

Figure 4. Niveaux de cellules NK dans les PBMC provenant de personnes hospitalisées pour un COVID critique-19. (A) Les niveaux totaux de cellules NK (CD3-CD56+) et (B) l'expression du marqueur de dégranulation CD107a dans ces cellules ont été évalués dans des PBMC dans des conditions basales (lignes grises) ou après traitement avec IL-15 pendant 48 h (lignes noires) après co-culture (1:1) avec des cellules Vero E6 infectées par le SARS-CoV pseudotypé-2 pendant 1 h. Chaque point correspond à la moyenne des données et les lignes verticales représentent SEM. La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney et, au sein des groupes, le test U de Wilcoxon a été utilisé.

Figure 5. Niveaux de cellules NKT dans les PBMC provenant de personnes hospitalisées pour un COVID critique-19. Les niveaux totaux de cellules NKT (CD3+CD56+) (A) et l'expression du marqueur de dégranulation CD107a dans ces cellules (B) ont été évalués dans des conditions basales (lignes grises) ou après traitement par IL{ {5}} pendant 48 h (lignes noires) après co-culture (1:1) pendant 1 h avec des cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV pseudotypé-2. Chaque point correspond à la moyenne des données et les lignes verticales représentent SEM. La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney et, au sein des groupes, le test U de Wilcoxon a été utilisé.

3.6. Niveaux de cellules T CD8+

Le nombre de CD8 a été augmenté de 2,07- fois (p=0,0409 ; d de Cohen=0,94) dans l'échantillon basal (t=0) du groupe Exitus en comparaison avec le groupe Survie, et ces niveaux sont restés stables jusqu’à l’issue fatale (Figure 6A). L'IL-15 n'a pas produit d'effet bénéfique significatif sur les niveaux de cette population cellulaire. Dans le groupe Survie, les lymphocytes T CD8+ étaient réduits de 1,51- fois en moyenne par rapport au groupe Exitus (Figure 6A). L'expression de CD107a a diminué de 1,53- fois (p=0,0313) à la semaine 4 dans les cellules T CD8+ des individus du groupe Exitus, et elle est restée inchangée jusqu'à l'issue fatale. résultat. Le traitement par IL-15 a montré un léger bénéfice dans l'expression de ce marqueur de dégranulation, mais cette différence n'était pas significative (Figure 6B). Dans le groupe Survie, il y a également eu une diminution de l'expression de CD107a dans les lymphocytes T CD8+ à la semaine 4, puis il y a eu une augmentation, mais aucune signification n'a été obtenue avant ou après le traitement par IL{{26. }} (Figure 6B).

Figure 6. Niveaux de lymphocytes T CD8+ dans les PBMC provenant de personnes hospitalisées pour un COVID critique-19. (A) Les niveaux totaux de lymphocytes T CD8+ (CD3+CD8+) et (B) l'expression du marqueur de dégranulation CD107a dans ces cellules ont été évalués dans des PBMC dans des conditions basales (gris lignes) ou après traitement par IL-15 pendant 48 h (lignes noires) après co-culture (1:1) avec des cellules Vero E6 infectées par le SARS-CoV pseudotypé-2 pendant 1 h. Chaque point correspond à la moyenne des données et les lignes verticales représentent SEM. La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney et, au sein des groupes, le test U de Wilcoxon a été utilisé.

3.7. Niveaux de marqueurs d’épuisement

Les niveaux d'expression des marqueurs d'épuisement immunitaire PD-1 (Programmed cell death protein) et TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig et ITIM domains) ont été analysés par cytométrie en flux dans des lymphocytes T CD4+ et des cellules cytotoxiques de tous les participants. Les échantillons obtenus au moment de l'admission à l'hôpital (t=0) jusqu'à la semaine 6 d'hospitalisation ont été analysés, en raison du manque d'échantillons disponibles après cette période. Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ des individus du groupe Exitus ont montré des niveaux de PD-1 qui ont été significativement augmentés de 1,72 (p=0,0095 ; d de Cohen {{ 11}}.87)- et 2.92-fois (p=0.0317 ; d de Cohen=2.07) après 4 semaines d'hospitalisation, respectivement, en comparaison avec les individus du Groupe de survie (Figure 7A, B, graphiques de gauche). Dans les cellules NKT, les niveaux de TIGIT ont augmenté de manière significative entre le moment de l'admission à l'hôpital et jusqu'à 6 semaines d'hospitalisation chez les individus du groupe Exitus, et ces niveaux ont été augmentés de 1,76- fois (p=0,0357 ; Cohen's d=0.33) après 2 semaines d'hospitalisation, en comparaison avec le groupe Survie (Figure 7C, graphique de droite).

Aucune différence significative entre les groupes n'a été observée dans les niveaux d'expression de ces marqueurs d'épuisement dans les cellules NK (Figure 7D).

Figure 7. Niveaux d'expression des marqueurs d'épuisement dans les PBMC d'individus hospitalisés pour un COVID critique-19. Niveaux d'expression de PD-1 et TIGIT dans les cellules T CD4+ (A), les cellules T CD8+ (B), les cellules NKT (C) et les cellules NK (D). Chaque point correspond à la moyenne des données et les lignes verticales représentent SEM. La signification statistique entre les groupes a été calculée à l'aide du test U de Mann – Whitney et, au sein des groupes, l'ANOVA a été utilisée.

3.8. Quantification de l'ARNémie du SRAS-CoV-2 dans le plasma

La présence d'ARN du SRAS-CoV-2 a été analysée dans le plasma de tous les individus de l'échantillon basal (t=0), et aucun résultat positif n'a été obtenu chez aucun participant, avec des valeurs de Cq inférieures à la limite. de détection positive de 45 cycles.

4. Discussion

L'infection par le SRAS-CoV-2 peut provoquer plusieurs présentations cliniques du COVID-19 allant d'une infection asymptomatique à une maladie grave, critique, voire mortelle [4]. Même si la vaccination générale de la population a considérablement réduit les formes graves de la maladie, l'émergence de nouveaux variants du SRAS-CoV-2 augmente le nombre d'individus qui développent un COVID critique-19 et doivent être soignés. hospitalisés en raison d’infections révolutionnaires [47,48]. Par conséquent, il reste prioritaire de développer des stratégies préventives et thérapeutiques susceptibles d’éviter le développement de formes critiques de COVID-19 et d’issues mortelles chez les patients hospitalisés. Il a été décrit que les personnes âgées présentant des comorbidités présentent un risque plus élevé de développer un COVID grave et critique{{1{{30}}}} [49]. En Espagne, les prédicteurs indépendants les plus significatifs de décès dus au COVID-19 sont les hommes de plus de 50 ans présentant des comorbidités associées telles que l'hypertension et le diabète [36]. Dans notre étude, la plupart des participants des deux groupes présentaient ces caractéristiques, sans différences significatives entre elles dans les données sociodémographiques, cliniques ou biochimiques pouvant influencer la gravité de la maladie ou son issue fatale. En fait, les deux groupes ont montré des niveaux accrus de paramètres biochimiques qui ont été associés à un risque plus élevé d’évolution défavorable du COVID-19, tels que la protéine C-réactive (CRP) et la lactate déshydrogénase (LDH) [50-56 ]. D'un autre côté, bien qu'il ait été rapporté que les personnes atteintes d'un COVID grave-19 peuvent présenter une anémie à ARN du SRAS-CoV-2 détectable [54], qui a été liée à un risque accru de mortalité [55], aucun des participants à notre étude ne présentait d'ARN détectable dans le sérum, nous n'avons donc pas pu établir de corrélation entre une virémie détectable et une issue fatale. Enfin, le COVID-19 présente une durée d'hospitalisation et un taux de mortalité plus élevés par rapport à d'autres maladies infectieuses nécessitant des admissions en soins intensifs, telles que la pneumonie nosocomiale (CAP) ou la septicémie [56], et cela a été estimé dans 35 jours en moyenne pour les personnes hospitalisées en Espagne lors des premières vagues pandémiques [36]. Dans notre étude, la durée médiane du séjour à l'hôpital était similaire entre les groupes Sortie et Survie (59,0 et 73,0 jours, respectivement), et 50 % de tous les participants sont restés plus de 40 jours en soins intensifs. Par conséquent, d’autres facteurs différentiels doivent être pris en compte pour expliquer l’issue fatale dans le groupe Exitus et la guérison dans le groupe Survie.

Avantages de la cistanche tubulosa-renforcer le système immunitaire

La lymphopénie est également considérée comme un facteur de risque de gravité de la maladie, liée à une durée d'hospitalisation plus longue [57]. Dans notre étude, 73,9 % des participants des groupes Exitus et Survival présentaient un faible nombre de lymphocytes. Cependant, le taux de lymphocytes totaux était en moyenne plus élevé chez les participants du groupe Survie que chez les participants du groupe Exitus. Ceci est conforme à l'observation précédente selon laquelle les individus décédés à cause du COVID-19 développent une lymphopénie plus sévère au fil du temps par rapport à ceux qui survivent [58] et que ces lymphocytes présentent généralement un phénotype épuisé, ce qui entraîne une immunodéficience progressive [15,16]. Étant donné qu'une réponse antivirale cytotoxique efficace est essentielle pour le contrôle des infections virales, y compris le SRAS-CoV-2 [17], la reconstitution immunitaire est cruciale pour la guérison du COVID-19. L’accélération de cette reconstitution immunitaire dépend grandement de l’expansion périphérique homéostatique des lymphocytes, ce qui pourrait être une bonne stratégie pour améliorer le sort des individus hospitalisés en raison d’un COVID sévère-19 [58]. L'IL-15 est une cytokine nécessaire au fonctionnement et à l'homéostasie des cellules T CD8+, NK et NKT [29], et elle a été proposée comme nouveau traitement immunomodulateur pour plusieurs maladies telles que le cancer. et l'infection par le VIH [26,30,35,59]. Par conséquent, dans cette étude, nous avons évalué si un traitement in vitro par IL-15 pourrait améliorer la réponse cytotoxique dans les PBMC d'individus hospitalisés atteints de COVID grave et critique-19 à mesure que l'infection progressait, afin de déterminer sa validité. comme candidat pour stimuler la reconstitution immunitaire pendant le COVID-19. Avec la dose testée, nous avons observé une augmentation globale de la réponse cytotoxique contre les cellules cibles infectées par le SARS-CoV pseudotypé-2 dans les PBMC des individus ayant survécu au COVID-19 après 44 jours en moyenne d'hospitalisation à l'USI. Cette réponse cytotoxique a été effectivement augmentée de 2,3-fois en moyenne lors du traitement par IL-15 dans tous les échantillons collectés au cours du suivi, la semaine 6 d'hospitalisation étant le tournant à partir duquel le nombre de lymphocytes et l'activité cytotoxique a commencé à diminuer jusqu'à la sortie de l'hôpital. Bien qu'ils partagent des caractéristiques sociodémographiques, cliniques et biochimiques similaires et qu'ils aient été hospitalisés pendant presque la même durée (59 jours au total, dont 49 jours en soins intensifs), le groupe d'individus qui n'ont pas survécu au COVID{{34} } ont montré des PBMC qui ne répondaient pas en présence des cellules cibles infectées, même lorsqu'elles étaient stimulées par l'IL-15. Les taux totaux de lymphocytes étaient supérieurs au seuil de lymphopénie chez les individus de ce groupe depuis la semaine 2 d'hospitalisation. Cependant, ces niveaux n'ont pas augmenté de manière significative pendant la durée de l'hospitalisation et aucune réponse antivirale efficace n'a été détectée, même en présence d'IL-15 à la dose testée. L'absence de réponse à l'IL-15 a été décrite pour d'autres infections chroniques telles que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de l'hépatite C (VHC), le virus de l'hépatite B (VHB) et le virus lymphotrope T humain (HTLV), dans lequel l'épuisement immunitaire peut affecter l'expression du récepteur spécifique de l'IL-15, CD122, dans les cellules T CD8+ [60], les rendant insensibles à ce stimulus homéostatique. L'épuisement immunitaire caractéristique du COVID-19 a non seulement été observé dans les cellules T CD8+ mais également dans d'autres types de cellules cytotoxiques telles que les cellules NK et NKT [15,16]. Par conséquent, l'absence de réponse à l'IL-15 dans les PBMC du groupe Exitus pourrait être liée à un épuisement immunitaire accru qui n'a pas pu être surmonté par le traitement par l'IL-15 seul à la dose testée. Cela a également été observé dans les essais cliniques de phase I dans lesquels la monothérapie par IL-15 était inefficace malgré l'énorme expansion des cellules cytotoxiques [31,32]. Par conséquent, d’autres traitements de costimulation seraient nécessaires pour induire une réponse efficace chez ces individus, tels que des inhibiteurs de points de contrôle immunologiques ou des anticorps monoclonaux ciblant les cellules infectées, afin d’améliorer la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC).

Nous avons également déterminé les types de cellules qui étaient principalement impliqués dans le développement de cette réponse cytotoxique améliorée dans le groupe d'individus qui ont survécu au COVID-19. Il a été démontré que la présence de lymphocytes T CD8+ fonctionnels est essentielle pour protéger les modèles animaux du développement de COVID-19 sévères [61,62]. De plus, l'absence d'une réponse cytotoxique efficace médiée par la CD8-a été désignée comme un facteur essentiel de la susceptibilité accrue des personnes âgées à développer un COVID grave ou critique-19 [63]. Étonnamment, les niveaux de lymphocytes T CD8+ étaient 2,07-fois (p=0,0409) plus élevés dans le groupe Exitus au moment de l'hospitalisation (t=0) , et ils sont restés améliorés jusqu'à l'issue fatale, par rapport au groupe Survie. Bien que les individus du groupe Exitus aient présenté un nombre de lymphocytes légèrement supérieur au seuil de lymphopénie, ces niveaux sont restés presque inchangés tout au long de leur hospitalisation. De plus, il a été décrit que la lymphopénie peut conduire à un schéma de suppression et d'activation coexistantes dans lequel il y a une perte périphérique de lymphocytes T simultanément à la prolifération intense du pool de lymphocytes T CD8+ [64,65]. Cela expliquerait les taux légèrement accrus de lymphocytes T CD8+ observés dans les PBMC des participants du groupe Exitus depuis la semaine 6 d'hospitalisation, malgré le fait que les taux totaux de lymphocytes restent inchangés et supérieurs au seuil de lymphopénie, indiquant également une réduction potentielle des lymphocytes T CD4+. Cependant, ces cellules T CD8+ ont montré une faible activité cytotoxique, comme l'a déterminé la faible expression du marqueur de dégranulation CD107a à la surface cellulaire, alors que l'expression de ce marqueur a augmenté dans les cellules T CD8+ de les participants du groupe Survie à partir de la semaine 4. L'expression de CD107a est considérée comme un biomarqueur pour évaluer la capacité cytotoxique [66], et il a été décrit comme étant réduite à la surface des cellules isolées d'individus atteints de COVID-19, en comparaison avec des donneurs sains non infectés [15 ].

Par conséquent, l'expression accrue de CD107a à la surface des cellules T CD8+ peut expliquer au moins partiellement la contribution de ces cellules à l'activité cytotoxique accrue observée dans les PBMC des participants du groupe Survie. De plus, nous avons observé une expression accrue du marqueur d'épuisement PD-1 dans les cellules T CD4+ et CD8+ des individus du groupe Exitus, ce qui peut également contribuer à la réduction de la cytotoxicité. activité et réponse à l'IL-15 de ces cellules. D'autres populations cellulaires peuvent être impliquées dans l'activité cytotoxique contre les cellules pseudotypées infectées par le SRAS-CoV-2-, telles que les cellules NK et NKT. Comme c'est le cas pour d'autres infections aiguës graves, les cellules NK peuvent être recrutées sur le site d'infection par le SRAS-CoV-2 [67], ce qui expliquerait le nombre réduit de cellules NK en circulation observées chez tous les participants. De plus, la tempête de cytokines qui se développe lors d'un COVID grave et critique-19 pourrait entraîner un statut dysfonctionnel des cellules NK qui exprimeraient des niveaux élevés de récepteurs de points de contrôle inhibiteurs tels que NKG2A ou PD-1 [68]. Dans notre étude, les niveaux de cellules NK étaient similaires entre les deux groupes jusqu'à la semaine 6, au cours de laquelle les participants du groupe Survie ont montré une augmentation progressive jusqu'à la sortie de l'hôpital. Ceci est corrélé à une expression accrue de CD107a, qui a été associée dans les cellules NK à une sécrétion accrue de cytokines et à une lyse améliorée des cellules cibles [7,69], bien que le pourcentage de cellules NK exprimant des marqueurs d'activation tels que CD107a ait été décrit comme étant plus faible chez les individus atteints de COVID-19 par rapport aux témoins sains [70]. À l'inverse, bien que les niveaux de cellules NKT aient été considérablement améliorés dans le groupe Survie à partir de la semaine 6, l'expression de CD107a est restée presque inchangée, alors qu'ils ont montré des niveaux accrus du marqueur d'épuisement TIGIT à la surface cellulaire qui ont augmenté régulièrement jusqu'à la semaine 6 d'hospitalisation. . L’une des limites les plus importantes de notre étude était la taille réduite de l’échantillon. Néanmoins, une signification statistique a été obtenue entre les groupes pour plusieurs paramètres essentiels qui ont également montré une ampleur d'effet importante ou très importante lorsque les différences regroupées entre les groupes ont été calculées.

cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire

5. Conclusions

En conclusion, la contribution la plus importante de cette étude à la lutte contre l'immunopathologie provoquée par l'infection par le SRAS-CoV-2 est la confirmation que la capacité antivirale altérée des PBMC semble être un facteur critique dans la progression vers un COVID mortel{ {2}}, même au-dessus d'autres facteurs sociodémographiques, cliniques et biochimiques. Par conséquent, l'utilisation de traitements immunomodulateurs susceptibles d'améliorer la cytotoxicité peut contribuer à un résultat positif pendant l'hospitalisation en raison d'un COVID critique-19. L'activité cytotoxique accrue médiée par l'IL-15 chez les individus du groupe Survie ne reposait probablement pas sur une augmentation des niveaux de cellules cytotoxiques mais sur l'immunocompétence de ces cellules à répondre à un tel stimulus. Par conséquent, la surveillance de l'expression de marqueurs d'épuisement et de la réactivité aux stimuli homéostatiques tels que l'IL-15 de ces populations cellulaires chez les individus hospitalisés pourrait être utile comme marqueur prédictif d'une issue fatale afin d'initier des mesures supplémentaires pour prévenir il. Par conséquent, cette étude observationnelle est une preuve de concept selon laquelle l'utilisation de l'IL-15 chez les personnes hospitalisées avec le COVID-19 pourrait améliorer la réponse immunitaire antivirale, bien que ce stimulus à lui seul ne serait pas efficace chez les personnes présentant des symptômes inconscients. cellules en raison d'un épuisement immunitaire ou d'une altération de la voie de signalisation IL-15R, ce qui est essentiel dans la prévention de l'épuisement [71], même lorsqu'elles présentent un nombre de lymphocytes supérieur au seuil de lymphopénie. D'autres études avec une population plus large sont nécessaires pour évaluer les combinaisons de doses croissantes d'IL-15 avec d'autres agents immunomodulateurs tels que des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire ou des anticorps monoclonaux ciblant les cellules infectées pour aider à restaurer et à améliorer la réponse antivirale pendant les formes critiques de COVID. -19.

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