Effet synergique de la pigmentation anti-scinatage des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche et de la glabridine

Résumé pour enquêter sur la synergiqueEffet de Cistanchecôté phényle éthanol (PHGS) et glabridine (GLA) contre la pigmentation cutanée, le rapport de masse de PHGS et GLA a été dépisté par une expérience d'inhibition de la tyrosinase in vitro, Trinitrophénylhydrazine (DPPH) et DPH) et DPH) et DPH) et 2, 2- diazo-bis (3- éthyl-benzothiazole -6- expériences de piégeage de diammonium d'acide sulfonique (ABTS +). index.

LeinflammatoireUn modèle de cellules HACAT induit par le lipopolysaccharide (LPS) a été établi, et l'effet anti-inflammatoire du médicament a été évalué en inhibant la libération d'interleukine -6 (IL -6) et le facteur de nécrose tumorale- (TNF-). Le modèle de stress oxydatif des cellules HACAT induit par le chlorhydrate d'azodiisobuamidine (AAPH) a été établi, et l'activité accrue de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) a été utilisée comme indice pour évaluer l'effet antioxydant du médicament. Le rapport de masse optimal de PHGS et de GLA a été déterminé par les modèles de trois cellules ci-dessus. Les résultats ont montré que les solutions aqueuses de PHGS / GLA (1∶1), PHGS / GLA (5∶1) et PHGS / GLA (10∶1) préparées avec M (Phgs) ∶m (GLA) =1 ∶1, 5∶1, 10∶1 ont montré une bonne activité inhibitrice et synergique sur l'activité tyrosinase et une activité inhibitrice. Les taux d'inhibition de PHGS / GLA (1∶1),
Les solutions aqueuses (1 0 ∶1) et GLA (1 0 ∶1) avec une concentration en masse de 0,4 g / L étaient respectivement de 94,37%, 92,93% et 88,06%. Les taux de récupération des radicaux libres DPPH étaient respectivement de 89,44%, 88,72,% et 88,10%.
Les taux de piégeage des radicaux libres ABTS + étaient de 1 0 0,13%, 100,0,1% et 99,87%, respectivement. Lorsque la concentration en masse de PHGS / GLA était de 25 ug / ml, PHGS / GLA (1∶1), PHGS / GLA (5∶1) et PHGS / GLA (10∶1) Les solutions aqueuses n'ont montré aucune cytotoxicité aux cellules B16F10 et HACAT. L'inhibition de l'activité de la tyrosinase dans la solution aqueuse PHGS / GLA (1 ∶1) était plus forte (activité tyrosinase 23,80%), et la teneur en mélanine (30,90%) a été significativement diminuée. La solution aqueuse PHGS / GLA (1∶1) a montré le meilleur effet d'inhibition sur IL -6 et la libération de TNF, et la capacité d'améliorer l'activité de SOD et CAT. La combinaison de PHGS et de GLA a montré de bonnes performances synergiques, supérieure A à un médicament unique et supérieur à la solution aqueuse PHGS / GLA (5∶1) et PHGS / GLA (10∶1). La combinaison de PHGS et de GLA a joué un rôle synergique dans l'amélioration de la pigmentation cutanée en inhibant la production de mélanine et les effets anti-inflammatoires et antioxydants.

 

Mots-clés Cistanche Gényléthanoïdes Glycosides; glabridin; effets synergiques; pigmentation anti-dikin; anti-oxydation; anti-inflammatoire; drogue

 

 

 

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La pigmentation cutanée est une maladie cutanée causée par des facteurs tels que les blessures, l'inflammation cutanée et le rayonnement ultraviolet [1-2]. Ces facteurs peuvent entraîner une augmentation anormale de la mélanine, qui à son tour provoque des problèmes tels que le chloasma, les taches de rousseur et l'hyperpigmentation post-inflammatoire (PIH) [3-4], affectant l'état mental et la qualité de vie des gens. À l'heure actuelle, le traitement de la pigmentation cutanée se concentre principalement sur l'inhibition de la tyrosinase, une enzyme clé dans la formation de la mélanine [5-6].
Les dernières recherches [7-8] montrent que la pigmentation de la peau dépend du lien étroit entre les kératinocytes et les mélanocytes dans l'épiderme. Une fois que les radicaux libres et les facteurs inflammatoires libérés par les kératinocytes entrent en contact avec les mélanocytes, ils induiront une augmentation de l'activité de la tyrosinase, conduisant à une augmentation de la teneur en mélanine. Ils accéléreront également le transport de la mélanine et provoqueront le dépôt de la mélanine à la surface de la peau. Par conséquent, le traitement de la pigmentation cutanée nécessite une variété de mesures telles que l'inhibition de la production de mélanine, de l'anti-inflammatoire et de l'anti-oxydation.

À l'heure actuelle, bien que les préparations traditionnelles de médicaments, telles que l'hydroquinone et l'hydroquinone, aient certains effets dans le traitement de la pigmentation de la peau, leurs modes d'action sont relativement simples et peuvent produire des réactions indésirables [9-10]. En comparaison, les médicaments naturels sont en vigueur naturels et légers et sont de plus en plus reconnus et loués par les consommateurs [11-12]. En particulier, la combinaison de plusieurs extraits de plantes [13-14] peut non seulement inhiber la production de mélanine, mais a également plusieurs effets tels que des effets anti-inflammatoires et antioxydants, fournissant de nouvelles idées et méthodes de traitement de la pigmentation cutanée.
Cistanche Deserticola Ma a une valeur médicinale unique et est connue sous le nom de "ginseng du désert". Des études ont montré que l'ingrédient caractéristique du glycoside phényléthanoïde contenu dans la cistanche a une bonne activité antioxydante [15] et des effets anti-inflammatoires [16], et a également un certain effet inhibiteur de la tyrosinase [17]. La glycyrrhizine est un composant flavonoïde de Glycyrrhiza glabra L., qui a un puissant effet de blanchiment et est connu sous le nom de "or blanchissant" [18]. La médecine traditionnelle chinoise de la pigmentation cutanée commence généralement à trouver un problème de rate et de rein, de nettoyer la chaleur et de détoxifier, et de reconstituer le Qi et le sang [19].
Les glycosides phényléthanoliques de Cistanche déserticola peuvent reconstituer le yang rénal et bénéficier de l'essence et du sang, tandis que Glycyrrhiza glabra peut reconstituer la rate et le Qi, effacer la chaleur et se détoxifier. Les deux peuvent travailler ensemble pour résister à la pigmentation. La combinaison des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche déserticola et de la glabridine peut résister à la pigmentation cutanée de plusieurs dimensions et cibles, protéger contre les rayons ultraviolets dans l'ensemble de la bande, inhiber synergistiquement la tyrosinase et réduire la production de mélanine, et peut également réduire les radiques libres et les facteurs inflammatoires, réduire les influencations des cœurs et le stress oxydatoire, et régulier les facteurs inflammatoires, le transport des facteurs inflammatoires. Cependant, il y a peu de rapports dans la littérature sur l'inhibition synergique de la pigmentation cutanée par les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche déserticola et de glabridine.
Cet article a l'intention d'explorer s'il existe un effet synergique entre les pphényléthanoïdesglycosides de Cistanche déserticola (PHGS) et la glabridine (GLA) à travers des expériences biochimiques in vitro et l'établissement de modèles à 3 cellules, ND obtient le rapport de masse de composé optimal pour un effet synergique. Il devrait fournir un soutien théorique et des conseils pratiques pour le développement de produits naturels de soins de la peau des plantes et aider à promouvoir l'industrie des soins de la peau à se développer dans une direction plus naturelle, saine et efficace.

 

 

Où: Une réaction est l'absorbance de la solution d'échantillon, la solution de T-tyrosine, le PBS et la solution de tyrosinase; Un contrôle de réaction est l'absorbance de la solution d'échantillon, la solution de T-tyrosine, la solution N et PBS; Un blanc est l'absorbance de la solution de T-tyrosine, de la solution PBS et de la solution de tyrosinase; Un contrôle vide est l'absorbance des solutions L-Tyrosine et PBS.

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1.3.2 Détermination de la capacité de piégeage des radicaux libres DPPH

Premièrement, pèse avec précision {{0}}. 0 197 g (0. 0 5 mmol) de DPPH et le dissoudre dans 25 0 ml de l'anhydrous pour préparer une solution de travail dPH avec une concentration de {{13}. 2. 2. mmol / l. Ensuite, les PHG et GLA ont été préparés dans une solution d'éthanol PHGS et une solution d'éthanol GLA avec des concentrations de masse de 0. 0 01, 0,01, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 mg / ml respectivement en utilisant de l'éthanol 50% par volume, et une solution d'éthanol VC a été préparée de la même manière. Ensuite, la solution d'éthanol PHGS et la solution d'éthanol GLA ont été mélangées uniformément à M (solution PHGS) ∶ M (solution de GLA)=40 ∶1, 20∶1, 10∶1, 5∶1, 1∶1, 1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶40 pour obtenir 9 types de PHG / solutions d'éthanol de PHG / GLA avec des raculations différents, qui ont enregistré des PHG / Solutions d'éthanol GLA avec des ratons massifs, qui ont enregistré des PHG / GLA avec des solutions massiques de PHGS / GLANO (40∶1) ~ PHGS / GLA (1∶40) Solutions d'éthanol. Enfin, ajoutez 100 μL de différentes solutions d'échantillon et 100 μL de solution de travail DPPH à la plaque de puits 96-, bien mélanger et ne pas s'éloigner de la lumière à température ambiante pendant 30 min. Mesurez l'absorbance à 517 nm avec un marqueur enzymatique. VC a été utilisé comme contrôle positif, et chaque expérience a été répétée 3 fois. Calculez le taux de piégeage des radicaux libres DPPH (%) selon la formule (2).
DPPH Taux de piégeage des radicaux libres /%=(1 −𝐴1 --𝐴3𝐴2) × 100 (2) où: A1 est l'absorbance de la solution d'échantillon + solution de travail DPPH; L'A2 est l'absorbance de 50% d'éthanol en volume + solution de travail DPPH; A3 est l'absorbance de la solution d'échantillon + 50% d'éthanol par volume.

1.3.3 Détermination de la capacité de piégeage des radicaux libres ABTS +

Tout d'abord, pesez 1 g (1,82 mmol) d'ABT et dissolvez-le dans de l'eau désionisée pour préparer une solution de travail ABTS avec une concentration finale de 7,4 mmol / L; peser 0. 5 g de persulfate de potassium et le dissoudre dans de l'eau déionisée pour préparer une solution de travail de persulfate de potassium avec une concentration finale de 2,6 mmol / L; Mélanger la solution de travail ABTS et la solution de travail persulfate de potassium en volumes égaux et réagissez pendant 12 h dans l'obscurité pour préparer la solution de travail ABTS +. Ensuite, selon la méthode de la section 1.3.2, préparez la solution d'éthanol PHGS, la solution d'éthanol GLA, la solution d'éthanol N et VC, ainsi que la solution d'éthanol PHGS / GLA (40∶1) ~ PHGS / GLA (1∶40).
Enfin, ajoutez 40 μL de différentes solutions d'échantillon et 160 μL de solution de travail ABTS + à la plaque de puits 96-, bien mélanger, réagir à température ambiante dans l'obscurité pendant 6 min et mesurer l'absorbance de la solution à 734 nm à l'aide d'un lecteur ELISA. Calculez le taux de piégeage des radicaux libres ABTS + (%) selon la formule (3).

 

Où: A1 est l'absorbance de la solution d'échantillon + solution de travail ABTS +; A2 est l'absorbance de l'eau déionisée + ABTS + solution de travail; A3 est l'absorbance de la solution d'échantillon + l'eau déionisée.

 

1.4 Expérience cellulaire

1.4.1 Culture cellulaire

Après que les cellules B16F10 et HACAT soient relancées, elles sont inoculées dans du milieu de glucose à haute teneur en DMEM (contenant un mélange de 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine par une fraction de masse) et cultivés dans un incubateur à 37 degrés, 5% de fraction de volume de CO2 et 70% d'humidité pendant 24 h. L'état de croissance cellulaire est observé au microscope, et le milieu est remplacé ou sous-culture en fonction de l'état de croissance cellulaire.

 

1.4.2 Groupement expérimental

Les cellules B16F10 et Hacat dans la phase de croissance logarithmique sont inoculées dans des plaques de puits 96- avec des nombres de cellules appropriées et cultivées pendant 24 h pour permettre aux cellules d'adhérer à la paroi. Des solutions d'échantillons de différentes concentrations de masse sont préparées à l'aide d'un milieu de culture DMEM. Le groupe normal, le groupe modèle, le groupe PHGS à faible dose (125 ug / ml), le groupe PHGS à dose moyenne (250 ug / ml), le groupe GLG à haute dose (500 ug / ml), le groupe GLA à faible dose (6,25 ug / ml), groupe GLA à dose moyenne (12,5 ug / ml), groupe GLA (25 ug / ml) Le groupe PHGS / GLA (5∶1) et le groupe médium de culture PHGS / GLA (10∶1) ont été mis en place.

Dans le modèle de pigmentation B16F10 induit par UVB, les cellules du groupe de modèles ont été ajoutées avec 30 μL de PBS (pH =7. 4) et placés 3 cm directement en dessous de l'irradiateur UVB pendant 110 s; Le groupe expérimental a été prétraité avec 100 μL de solutions d'échantillon de différentes concentrations de masse pendant 1 h, puis ajoutées avec 30 μL de PBS et placée 3 cm directement sous l'irradiateur UVB pendant 110 s; Le groupe normal a toujours utilisé le milieu de culture DMEM à haute glucose; Le groupe vide n'a pas été inoculé avec des cellules, mais avec une quantité égale de milieu de culture à la place.

Dans le modèle d'inflammation des cellules HACAT induit par le LPS, le groupe modèle a été cultivé avec une solution de PBS de LPS à une concentration de 20 ug / ml pendant 24 h; Le groupe expérimental a été prétraité avec des solutions d'échantillon de 100 μl de différentes concentrations de masse pendant 24 h, puis ajoutées avec une solution de LPS 20 ug / ml pendant 24 h; Le groupe normal a toujours utilisé le milieu DMEM à haute glucose; Le groupe vide n'a pas été inoculé avec des cellules, mais avec une quantité égale de milieu de culture.

Dans le modèle de stress oxydatif des cellules HACAT induit par AAPH, le groupe modèle a été cultivé avec 100 ml de solution AAPH (2,5 mmol) à une concentration de 25 mmol / L pendant 24 h; Le groupe expérimental a été prétraité avec 100 μl de solutions d'échantillon de différentes concentrations de masse pendant 24 h, puis ajoutées avec une solution AAPH à une concentration de 25 mmol / L pendant 24 h; Le groupe normal a toujours utilisé le milieu DMEM à haute glucose; Le groupe vide n'a pas été inoculé avec des cellules, mais avec une quantité égale de milieu de culture.

Chaque groupe a été mis en place avec 3 puits répétés et cultivés dans un incubateur à 37 degrés, une fraction de volume de CO2 5% et une humidité de 70%.

1.4.3 Dosage de cytotoxicité

La méthode CCK8 a été utilisée pour déterminer la cytotoxicité. B16F1 0 et les cellules HACAT dans la phase de croissance logarithmique ont été digérées avec 0,25% de trypsine pendant 3 min. Après la fin de la digestion, le milieu de culture a été soufflé à plusieurs reprises pour faire une suspension cellulaire avec une densité de 1 × 104 cellules / ml. Les cellules ont été uniformément inoculées dans une plaque de puits 96-, 100 μl par puits, et du PBS a été ajouté aux puits autour des cellules. Une fois les cellules qui ont adhéré à la paroi, différentes concentrations de masse de solution d'échantillon ont été ajoutées, 3 puits répliquées par groupe et cultivés dans un incubateur à 37 degrés, 5% de fraction de volume de CO2 et 70% d'humidité pendant 24, 48 et 72 h, puis la solution a été rejetée. Tous les groupes ont été ajoutés avec 100 μL de milieu de culture complet contenant 10% de fraction de volume CCK8 et incubés pendant 60 min. L'absorbance de la solution à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur ELISA. La viabilité cellulaire (%) a été calculée en fonction de la formule (4).

 

 

Où: un groupe expérimental est l'absorbance des puits contenant des cellules et une solution d'échantillon sous irradiation UVB; Un groupe normal est l'absorbance des puits contenant des cellules et une solution d'échantillon sans irradiation UVB; Un groupe vide est l'absorbance des puits contenant du milieu de culture mais pas de cellules.

 

1.4.5 Détermination du contenu de la mélanine

La teneur en mélanine a été déterminée par la méthode de lyse NaOH. Après avoir traité les cellules pendant 72 h selon la méthode de la section 1.4.2, le surnageant a été jeté et lavé deux fois avec du PBS, et 100 μL de solution aqueuse NaOH contenant 10% de DMSO en volume (concentration de 1 mol / L) a été ajoutée. Après avoir été placé dans un four à 90 degrés pendant 1 h, l'absorbance de la solution à 490 nm a été déterminée par un marqueur enzymatique. L'expérience a été répétée 3 fois. La teneur en mélanine (%) a été calculée en fonction de la formule (5).

 

1.5 Détermination de la teneur en facteurs inflammatoires et de l'indice de stress oxydatif

Après avoir traité les cellules pendant 48 h selon la méthode de la section 1.4.2, les cellules HACAT de chaque groupe ont été collectées avec un grattoir cellulaire, centrifugées et le surnageant a été collecté. Le contenu d'IL -6 et de TNF- a été déterminé en fonction des instructions du kit ELISA.
Après avoir traité les cellules pendant 48 h selon la méthode de la section 1.4.2, les cellules HACAT de chaque groupe ont été collectées avec un grattoir cellulaire, et les cellules ont été brisées par congélation et décongélation répétés. Les cellules ont été centrifugées à 12000 r / min à 4 degrés pendant 10 min et le surnageant a été collecté. L'activité SOD et la teneur en CAT ont été déterminées en fonction des instructions du kit ELISA.

1.6 Détermination de l'indice combiné
La méthode de l'indice combiné (IC) [20] a été utilisée pour déterminer si les PHG et GLA dans différents rapports de masse avaient un effet synergique dans l'inhibition de l'activité de la tyrosinase et de l'anti-oxydation. L'indice de combinaison a été calculé en fonction de la formule (6):

Wherein: D1 and D2 are the mass concentrations (mg/mL) of the two drugs when the activity reaches x% in the combined treatment; DX is the mass concentration (mg/mL) required for the activity to reach x% when the two substances are used alone. Compusyn software was used for calculation. CI>1 indique un effet antagoniste, CI =1 indique un effet additif, et CI<1 indicates a synergistic effect.

 

1.7 Analyse des données

Toutes les données sont exprimées en "moyenne arithmétique ± écart type (𝑥̅ ± 𝑠)". Le logiciel Graph Prism 9.5. 0 a été utilisé pour l'analyse statistique. Une analyse de variance unidirectionnelle a été utilisée pour la comparaison entre plusieurs groupes. P<0.05 was considered statistically significant.