Identification systématique et comparaison des profils exprimés de miARN exosomal chez les porcs infectés par la souche NADC 30- semblable au PRRSV

Résumé simple :Les exosomes jouent un rôle unique dans l’infection virale, la présentation des antigènes et la suppression/promotion de l’immunité corporelle. Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) est l’un des agents pathogènes les plus dommageables dans l’industrie porcine. Ici, nous avons utilisé la souche CHsx1401 de type PRRSV NADC30-pour infecter artificiellement des porcs âgés d'un jour, isoler des exosomes sériques et identifier 33 miARN exosomal exprimés de manière significativement différentielle (DE) entre les groupes d'infection et les groupes témoins, et 18 miARN DE associés à l’infection et à l’immunité par le SDRP ont été sélectionnés en tant que molécules fonctionnelles potentielles impliquées dans la régulation de l’infection par le virus SDRP par les exosomes.

Abstrait:Les exosomes sont des vésicules biologiques sécrétées et libérées par des cellules qui agissent comme médiateurs de la communication intercellulaire et jouent un rôle unique dans l'infection virale, la présentation des antigènes et la suppression/promotion de l'immunité corporelle. Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) est l'un des agents pathogènes les plus dommageables dans l'industrie porcine et peut provoquer des troubles de la reproduction chez les truies, des maladies respiratoires chez les porcs, une diminution des performances de croissance et d'autres maladies entraînant la mortalité des porcs. Dans cette étude, nous avons utilisé la souche CHsx1401 de type PRRSV NADC30-pour infecter artificiellement des 42-porcs d'un jour et isoler des exosomes sériques. Sur la base d’une technologie de séquençage à haut débit, 305 miARN ont été identifiés dans les exosomes sériques avant et après l’infection, parmi lesquels 33 miARN étaient exprimés de manière significativement différentielle entre les groupes (13 relativement régulés positivement et 20 relativement régulés négativement). L'analyse de conservation de séquence du génome CHsx1401 a identifié 8 régions conservées, parmi lesquelles un total de 16 miARN exprimés différentiellement (DE) devraient se lier à la région conservée la plus proche des 3.0 UTR du génome CHsx1401, incluant 5 miARN DE capables de se lier au CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Une analyse plus approfondie a révélé que les gènes cibles des miARN différentiellement exprimés étaient largement impliqués dans les voies de signalisation liées à la fonction exosomale et à l'immunité innée, et 18 miARN DE (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, etc.) associés à l'infection par le SDRP et à l'immunité ont été dépistés comme molécules fonctionnelles potentielles impliquées dans la régulation de l’infection par le virus SDRP par les exosomes.

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Mots clés:SDRPV ; exosome sérique ; miARN

1. Introduction

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) est un virus à ARN simple brin positif avec une structure d'enveloppe appartenant à l'ordre des Nidovirales, famille des Arteriviridae, genre Betaarterivirus [1,2]. Il est sphérique ou ellipsoïdal avec un diamètre de 50 à 65 nm au microscope électronique à congélation [3,4]. Le génome du PRRSV mesure environ 15 kb de longueur avec une coiffe de 50 et une queue de 30 polyA et contient au moins 10 cadres de lecture ouverts (ORF) flanqués de régions non traduites (UTR) aux extrémités 50 et 30 [5,6] et est enveloppé par une protéine de nucléocapside, avec un revêtement lipidique à double couche pour former des particules virales. Les exosomes appartiennent à des vésicules à structures membranaires monocouches et ont la même structure topologique que les cellules [7]. La forme est « en forme de coupe » ou « en forme de disque » au microscope électronique [8,9]. Les exosomes peuvent exister dans le système circulatoire pendant une longue période, et les substances contenues dans les exosomes peuvent être absorbées par des cellules adjacentes ou des cellules réceptrices distantes, puis réguler les cellules réceptrices pour participer à l'échange de matériel génétique entre cellules [10,11]. Ils sont principalement composés de substances de surface membranaire et de contenus transportés, notamment des récepteurs de surface cellulaire, des protéines membranaires, des protéines solubles, des lipides, de l'ARN (ARNm, miARN, ARNlnc et ARN viral, etc.), de l'ADN génomique, de l'ADN mitochondrial [12-14]. ]. Les microARN (miARN) sont une classe de 18 à 25 nucléotides (nt) de petits ARN monocaténaires endogènes non codants conservés au cours de l'évolution, qui inhibent le processus de traduction en induisant la dégradation de l'ARNm cible ou en se liant à 30 UTR de l'ARNm cible, menant au silençage post-transcriptionnel des gènes, puis à la régulation de l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel (15-17). On estime que les miARN régulent plus de 60 % des gènes des mammifères de manière post-transcriptionnelle [18,19]. Les miARN jouent un rôle important dans la communication intercellulaire et peuvent également être utilisés comme molécule fonctionnelle potentielle pour l’infection, la transmission et la défense des maladies et des virus (20). Un nombre croissant d'études ont montré que les miARN peuvent être présents dans les fluides corporels, tels que la salive, l'urine, le lait maternel et le sang, et agir via le système circulatoire des fluides corporels [21,22]. Les miARN exosomal sont considérés comme des régulateurs endogènes de l'expression des gènes et du métabolisme et peuvent indiquer diverses conditions pathologiques (23,24).

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Au cours des deux dernières décennies, il a été démontré que les miARN jouent un rôle crucial dans la régulation du développement des cellules immunitaires, des réponses immunitaires innées et des réponses immunitaires acquises. Certains autres miARN altéreraient l'infection par le SDRP de la manière suivante, cibleraient directement le génome du SDRP ou le récepteur du SDRP, ou joueraient un rôle en régulant la réponse immunitaire innée de l'hôte. La famille miR-26 peut endommager considérablement la réplication du virus, et miR-26a peut inhiber la réplication des souches de SDRP de type 1 et de type 2 dans les macrophages alvéolaires porcins (PAM) en régulant l'interféron de type I (IFN) voie, qui est plus efficace que miR-26b [25,26]. miR-30c et miR-125b sont identifiés pour moduler la réponse immunitaire innée de l'hôte en ciblant respectivement la voie IFN de type I et la voie NF-κB (27-29). MiR-23, miR-378 et miR-505 sont des facteurs hôtes antiviraux ciblant le SDRP et ont des sites cibles conservateurs dans les souches de SDRP de type 2 [30]. Dans le même temps, l'hôte miR -506 a été identifié pour inhiber la réplication du SDRP en ciblant directement le récepteur CD151 du SDRP dans les cellules MARC -145 [31]. miR-181 peut également inhiber indirectement la réplication du SDRP en régulant négativement le récepteur CD163 du SDRP dans les monocytes sanguins et les PAM (32). De plus, les miARN peuvent favoriser la réplication du SDRP en interférant avec la physiologie cellulaire fondamentale. MiR-24-3p et miR-22 ciblent directement 30 UTR de HO-1 lors d'une infection par le SDRP pour échapper à l'inhibition de l'hème oxygénase-1 (HO-1), un protéine de choc thermique (également connue sous le nom de HSP32) sur le SDRP [33,34]. Les porcs sont connus pour être plus sensibles au SDRPV et moins capables de se défendre contre l’entrée de cet agent pathogène dans l’organisme [35]. Dans la présente étude, l'immunité innée et l'immunité acquise des porcs infectés par ce virus ont été étudiées au niveau moléculaire en utilisant une souche répandue sur le terrain. Un kit d'isolement d'exosomes sériques, une microscopie électronique à transmission (TEM), une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et un Western blot (WB) ont été utilisés pour isoler et identifier les exosomes sériques avant et après l'infection par le SDRP, suivis d'une analyse de séquençage de petits ARN, d'une identification, et analyse des résultats d'expression différentielle à l'aide de méthodes bioinformatiques pour obtenir plusieurs miARN d'exosomes sériques associés au SDRP, suivie de l'identification des résultats des données à l'aide d'une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR).

2. Matériels et méthodes

2.1. Expériences sur les animaux

Six grands porcs blancs âgés d'un jour, en bonne santé, doubles négatifs pour l'antigène et l'anticorps du SDRP, ont été placés dans le système d'alimentation propre pour porcs à des fins d'isolement, de soins de santé et d'adaptation environnementale. Tous les porcs étaient libres de manger et de boire sans restrictions. Lorsqu'ils étaient familiers avec les conditions dans l'isolateur, les porcs ont été inoculés par voie nasale avec 2 mL 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-comme le CHsx1401, mentionné par les prédécesseurs [36,37]. Le sang des porcs avant (groupe témoin, n=6) et 7 jours après (groupe de traitement, n=6) l'inoculation du virus a été collecté dans la veine cave antérieure pour l'isolement du sérum. Les débris cellulaires présents dans le sérum ont été éliminés par centrifugation à 3 000 g pendant 15 min. Toutes les expériences sur les animaux de notre étude ont été approuvées par le comité d'éthique animale de l'Institut des sciences animales de l'Académie chinoise des sciences agricoles (CAAS) (Pékin, Chine), IAS 2022-130.

2.2. Isolement et purification des exosomes sériques

L'isolement et la purification des exosomes ont été réalisés à l'aide du kit exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, Allemagne, n° de catalogue 76064) selon le protocole du fabricant.

2.3. Microscopie électronique à transmission (TEM)

Les suspensions d'exosomes extraites ont été déposées sur le maillage de cuivre recouvert de carbo Formvar, et les exosomes ont été rincés avec du PBS et soumis à une coloration standard à l'acétate d'uranyle pendant 3 minutes à température ambiante. Après séchage de plusieurs minutes à température ambiante, la grille a été visualisée et photographiée à 100 kV au microscope électronique à transmission (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokyo, Japon).

2.4. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)

Les exosomes extraits ont été dilués avec 1 × PBS en modifiant le volume de 10 à 30 µL. Une fois l'échantillon testé, la concentration et la taille des exosomes sériques ont été analysées par un nano-analyseur à flux N30E en suivant les instructions du fabricant (NanoFCM, Xiamen, Chine).

2.5. Western Blot

Les échantillons d'exosomes extraits ont été ajoutés au lysat RIPA mélangé à un inhibiteur de protéase (Invitrogen, Waltham, MA, USA) et au fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) pour extraire la protéine de l'exosome, qui a été lysée sur de la glace pendant 30 min. Ensuite, selon les instructions du kit Bradford, nous avons quantifié la concentration de protéine sérique des exosomes. Les protéines des exosomes ont subi une dénaturation thermique. La même quantité de protéine a été séparée sur un gel SDS-PAGE à 12%, puis transférée sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, USA). Il a été trempé dans du TBST contenant 5% de lait écrémé en poudre et scellé pendant 1 h à température ambiante. Nous avons trempé la membrane dans l'anticorps primaire dilué (anticorps anti-CD9, Abcam, Boston, MA, USA, # ab92726 ; anticorps anti-CD81, Abcam, Boston, MA, USA, # ab109201) pendant une nuit à 4 ◦C, et récupéré l'anticorps primaire. Nous avons trempé la membrane dans l'anticorps secondaire dilué, l'avons incubée à température ambiante pendant 1 h et avons récupéré l'anticorps secondaire. Nous avons posé le film lavé de PBST sur le film de conservation, ajouté une solution chromogène mixte ECL a/b à volume égal et l'avons placé dans l'imageur à chimiluminescence.

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2.6. Séquençage de petits ARN exosomal et analyses de données

L'ARN total des exosomes a été extrait avec Trizol conformément aux instructions du fabricant. Nous avons ensuite détecté la concentration d’ARN et la valeur de densité optique (DO) ainsi que la dégradation et la pureté de l’ARN avec une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %. Pendant ce temps, Agilent Bioanalyzer 2100 a été utilisé pour détecter l'intégrité de l'ARN. Nous avons utilisé l’ARN total des exosomes après contrôle qualité. Conformément aux instructions du fabricant, nous avons utilisé le kit de préparation de petites bibliothèques d'ARN multiplex NEB NEXT pour Illumina® (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis). Le kit a préparé une petite bibliothèque d'ARNc et l'a séquencée pour produire 50 nt de lectures à une extrémité par la plate-forme Illumina Novaseq 6000. Toutes les procédures de préparation d'une petite bibliothèque d'ARN ont été réalisées par Novogene (Beijing, Chine). Les données après contrôle qualité ont été alignées sur le génome porcin de référence (Sus scrofa 11.1) à l’aide d’un nœud papillon. Les miARN connus ont été identifiés par la base de données miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, consultée le 14 janvier 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] et miRevo (v1.1). ) [40] et ont été utilisés pour prédire de nouveaux miARN. Dans le même temps, l'analyse de l'expression différentielle des miARN a été réalisée par DESeq (v1.24.0) [41], nécessitant un |fold change| > 1,6 et p < 0,05. L'alignement a été réalisé à l'aide de MEGA (V11) [42], suivi d'un score à base unique à l'aide de PHAST (v1.6.9) [43] et d'une évaluation des régions les plus conservées de 10 gènes viraux, dont WUH3 (numéro d'accès GenBank HM853973), VR2332 ( N° d'accès GenBank U87392), JXA1 (n° d'accès GenBank EF112445), CH-1a (n° d'accès GenBank AY032626), NADC30 (n° d'accès GenBank HN654459), HUN4 (n° d'accès GenBank EF635006), HLJZD 22-1812 (numéro d'accès GenBank MN648450), SC/DJY (numéro d'accès GenBank MT075480) et Lelystad (numéro d'accès GenBank M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] a été utilisé pour prédire la liaison de la séquence de miARN identifiée à l'UTR 3 0 du génome du virus CHsx1401. Miranda (v3.3a) et RNAhybrid ont été utilisés pour cibler la prédiction génétique. Le package profile [45] R a été utilisé pour l’analyse d’enrichissement fonctionnel GO (Gene Ontology) des gènes cibles et pour l’analyse d’enrichissement de la voie KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes).

2.7. Validation de l'expression des miARN par RT-qPCR

L'ARN total a été isolé des exosomes sériques à l'aide de Trizol (Invitrogen, Shanghai, Chine) conformément au protocole du fabricant. L'ARN isolé a été vérifié par RT-qPCR sur des échantillons (n ​​= 6 par groupe). L'ADNc a été synthétisé conformément aux instructions du kit de synthèse d'ADNc 1er brin de miARN (par tige-boucle) (Vazyme, Nanjing, Chine), et la quantification de la fluorescence a été réalisée en utilisant ABI 7500 selon le instructions du master mix miRNA universal SYBR qPCR (Vazyme, Nanjing, Chine). Les paramètres du cycle thermique utilisés étaient les suivants : la première étape : 95 ◦C pendant 30 s ; Étape 2 : 95 ◦C pendant 5 s, 60 ◦C pendant 34 s et 40 cycles ; Étape 3 : 95 ◦C pendant 15 s, 60 ◦C pendant 1 min et 95 ◦C pendant 15 s. Les séquences d'amorces des miARN, le gène U6, ont été utilisées comme référence (46) et répertoriées dans le tableau supplémentaire S1. Toutes les vérifications qRT-PCR ont été effectuées à l’aide de trois répétitions biologiques et de trois répétitions pour chaque échantillon. L'abondance relative des transcriptions a été calculée par la méthode 2-Ct, et SPSS (v22.0) et GraphPad Prism (v8.0) ont été utilisés respectivement pour l'analyse et la cartographie des données. p < 0,05 signifie que la différence est statistiquement significative.

3. Résultats

3.1. Valeur relative de l'antigène et de l'anticorps après l'inoculation du virus

Les résultats des tests d'antigène et d'anticorps du SDRP avant (jour 0) et après la provocation (jour 7) sont présentés dans le tableau 1. La détection sérologique de l'antigène et de l'anticorps du SDRP avant la provocation était négative et l'antigène était positif après le test, indiquant que les porcs ont été infectés avec succès par CHsx1401.

3.2. Isolement et identification des exosomes sériques

Les vésicules isolées du sérum ont été découvertes par TEM. La plupart des vésicules peuvent voir les exosomes concaves en forme de soucoupe ou de disque au milieu. Le bord membranaire des exosomes est visible et la morphologie est relativement complète (Figure 1A, B). L'analyse de suivi des nanoparticules a montré que 95,73 % des exosomes avaient un diamètre compris entre 30 et 150 nm, principalement autour de 72,25 nm, avec un diamètre moyen de 76,22 nm, ce qui était cohérent avec les caractéristiques de taille des exosomes (Figure 1C). Cette gamme de tailles était similaire à celle détectée par TEM et confirmait en outre l'identité de ces vésicules en tant qu'exosomes. L'analyse par Western blot a montré que les vésicules isolées des échantillons de sérum étaient positives pour les protéines CD9 et CD81 (Figure 1D). Les caractéristiques ci-dessus sont conformes aux normes d'identification des exosomes formulées par la Société internationale pour les vésicules d'extraction (ISEV) dans MISEV2018 (47).

Tableau 1. Antigène et anticorps du (jour 0) et (jour 7) avec le virus de provocation.

Figure 1. Principales caractéristiques des exosomes sériques. (A, B) montrent les caractéristiques morphologiques des vésicules par TEM. Les barres d'échelle sont respectivement de 500 nm et 100 nm. (C) NTA montre le diamètre et la concentration de la plupart des vésicules. (D) Le Western blot a montré la présence de marqueurs d’exosomes CD81 et CD9 dans les exosomes sériques. Remarque : Le mélange dans les résultats WB correspond à la suspension mélangée de l'échantillon isolée par le kit exoEasy Maxi.

3.3. Séquençage de petits ARN d’exosomes sériques

Pour chaque échantillon, les données propres ont atteint 0,5 Go et le pourcentage de base du Q30 était supérieur à 96,20 %. Les lectures propres de chaque échantillon ont été alignées sur le génome de référence du porc. Parmi les 12 échantillons, le groupe témoin a obtenu respectivement 10 920 887, 10 248 696, 10 109 117, 10 655 494, 9 217 285 et 9 782 523 lectures. Le groupe de traitement a obtenu respectivement 11 889 518, 10 593 504, 10 593 504, 12 846 080, 10 105 325, 11 729 451 et 9 789 542. En moyenne, 77,96 % du total des lectures propres comprenaient 19 à 22 nucléotides (nt) de longueur (Figure 2A). Les lectures après contrôle qualité représentaient plus de 92,59 % du total des lectures. Les lectures propres traitées étaient alignées sur le génome de référence porcin, et le taux cartographié de 12 bibliothèques sur le génome était supérieur à 92,30 %, et le taux cartographié était de 94,98 % (Figure 2B). Il a indiqué que la bibliothèque de miARN exosomiques sériques construite était de haute qualité et adaptée à une analyse plus approfondie. Les détails sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S2.

Figure 2. Aperçu des données du transcriptome des petits ARN. (A) Distribution de longueur des comptes de lecture d’échantillons d’exosomes sériques (nt=nucléotides) ; (B) taux de 12 échantillons mappés sur le génome de référence

3.4. Analyse d'expression différentielle des miARN

Après analyse quantitative de l’expression des miARN identifiés, les miARN ont été criblés selon les seuils décrits précédemment dans la section 2.6. Un total de 305 miARN ont été obtenus avant et après l'inoculation de la souche CHsx1401 (contrôle, n=6 ; traitement, n=6). Un total de 33 miARN différentiellement exprimés (DE) ont été identifiés entre les deux groupes, 13 miARN DE ont été régulés positivement et 20 miARN DE ont été régulés négativement dans le groupe de traitement (Figure 3 et tableau supplémentaire S3).

3.5. Analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes cibles des miARN

Un total de 7 283 gènes cibles ont été prédits par 33 miARN DE, et les fonctions des gènes cibles étaient principalement concentrées dans la régulation positive de la cascade MAPK, le processus de métabolisme des lipides, la régulation de la transduction du signal intracellulaire, les cascades ERK1 et ERK2, etc. (Figure 4A ). En termes de fonctions moléculaires, les gènes cibles des miARN exprimés différentiellement se concentrent principalement sur l'activité régulatrice de l'enzyme GTP, l'activité kinase, l'activité régulatrice de la nucléoside triphosphatase et d'autres fonctions liées à la transduction du signal et au métabolisme énergétique (Figure 4B). De plus, parmi les composants cellulaires, les gènes cibles participent principalement aux fonctions biologiques des polymères supramoléculaires, de Golgi, des autophagosomes, de la surface cellulaire, des endosomes précoces, etc. (Figure 4C). Les fonctions de ces composants sont étroitement liées à la formation des exosomes, ce qui explique également la précision du séquençage. L'analyse de l'enrichissement de la voie KEGG a montré que les gènes cibles étaient significativement enrichis en endocytose, la voie de signalisation MAPK, la voie de signalisation Rap1, la voie de signalisation des sphingolipides et la voie de signalisation PI3K Akt (p < 0,05) (Figure 5A. ). Parallèlement, les parcours enrichis ont été classés et analysés. Les résultats ont montré que la voie KEGG du gène cible était principalement enrichie en traitement de l’information environnementale, en maladies humaines et en systèmes biologiques (Figure 5B).

Figure 3. Expression différentielle des miARN dans les exosomes. (A) Terrain volcanique de miARN entre les groupes de contrôle et de traitement ; (B) carte thermique de regroupement hiérarchique des miARN DE entre les groupes de contrôle et de traitement.

Figure 4. Analyse d’enrichissement de la fonction GO des gènes cibles des miARN DE. (A) Processus biologique des gènes cibles des miARN DE ; (B) fonctions moléculaires des gènes cibles des miARN DE ; (C) composants cellulaires des gènes cibles des miARN DE

Figure 5. Analyse d’enrichissement de la voie KEGG des gènes cibles. (A) Voie KEGG considérablement enrichie avec les gènes cibles des miARN DE ; (B) classification des voies KEGG significativement enrichies.

3.6. Ciblage de la prédiction du miARN exosomal sérique et du génome du SDRPV CHsx1401

Selon le score phastCons d'une seule base après alignement par PHAST, un total de huit segments les plus conservés (bandes noires au-dessus de la carte des pics) ont été obtenus parmi les génomes viraux (Figure 6). Un total de 31 miARN DE se sont avérés se lier au segment conservé en prédisant les miARN liés au segment conservé. Parmi eux, dans la région conservée (14 644-15 020 nt) la plus proche des 30 UTR (14 870-15 020) du génome CHsx1401, 16 miARN DE devraient s'y lier, dont 5 miARN (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 et ssc-miR-6529) qui peuvent se lier au 30 UTR de CHsx1401. Parmi ces miARN, seul ssc-miR-223 a été régulé positivement après l'infection, et d'autres miARN ont été régulés négativement après l'infection. Voir le tableau supplémentaire S4 pour plus de détails.

Figure 6. Segments conservés dans le génome de la souche CHsx1401 prédits par PHAST

3.7. Criblage des miARN DE liés à la fonction des exosomes et au SDRP

Une variété de miARN différentiellement exprimés liés à la fonction des exosomes et du PRRSV ont été découverts par analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes cibles. Parmi eux, 11 miARN DE tels que ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 et ssc-miR-320 sont impliqués dans l'absorption des exosomes, et leurs gènes cibles sont principalement concentrés dans la famille des gènes Ras, la famille des annexines et la famille des gènes de ribosylation de l'ADP. Dix-huit miARN DE, dont sscmiR-10b, ssc-miR-124a et ssc-miR-128, participent aux voies liées au système immunitaire et leurs gènes cibles sont principalement concentrés dans le MAPK famille de gènes, famille de gènes PIK3 et famille de gènes de protéine phosphatase. Alors que 11 miARN DE sont impliqués dans l’invasion virale, les gènes cibles associés sont principalement concentrés dans la famille des gènes MAPK et la famille des gènes de la protéine phosphatase. De plus, plusieurs miARN exprimés de manière différentielle, tels que roman_102. Six miARN DE, dont ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-7137-3p et ssc-miR{{ 25}}, sont co-exprimés dans la fonction des exosomes, l'invasion du virus SDRP et les voies immunitaires, comme le montre la figure 7. Les détails sont présentés dans le tableau supplémentaire S5.

Figure 7. MiARN DE liés à l'absorption des exosomes, à l'invasion du SDRP et à l'immunité

3.8. Test QRT-PCR des miARN DE entre les deux groupes

Cinq miARN DE ont été sélectionnés au hasard pour vérification. Selon les résultats de la qRT-PCR, l'expression de ssc-miR-19a et ssc-miR-32 a augmenté dans le groupe de traitement, tandis que ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} et ssc-miR-34c ont montré une expression plus élevée dans le groupe témoin, conformément aux données de séquençage (Figure 8).

Figure 8. Cinq miARN DE validés par qRT-PCR

4. Discussion

Le SDRP reste un pathogène tenace dans l’industrie porcine mondiale, causant d’énormes pertes économiques dans le monde. À l’heure actuelle, la vaccination est principalement utilisée pour prévenir et contrôler le SDRP, parmi lesquels le vaccin à virus vivant modifié (MLV) est le plus largement utilisé [48]. Bien que ce vaccin ait été efficace pour réduire les épidémies et l’incidence du SDRP, il a également considérablement augmenté la variation génétique et la diversité du virus et a conduit à une recombinaison virale entre les virus vaccinaux sauvages et vivants sur le terrain [49,50]. Ces dernières années, la propagation et la prévalence du virus recombinant NADC30-, semblable à la souche du PRRSV, ont provoqué de multiples épidémies de syndrome reproducteur et respiratoire porcin en Chine. La similarité entre CHsx1401 et NADC30 utilisés dans cette étude est restée comprise entre 92,2 et 99,1 %. Depuis, c’est devenu une souche épidémique en Chine. Les exosomes, en tant que médiateurs de la communication cellulaire, sont largement présents dans divers fluides corporels et présentent des avantages uniques dans le diagnostic et le traitement des maladies (51, 52). Selon des rapports antérieurs, les exosomes jouent un rôle de communication important dans la présentation des antigènes [53], la réponse immunitaire [53,54], la réplication virale [54], le cancer [55], les maladies neurodégénératives [56], l'angiogenèse [57], les cellules tumorales. la migration [58] et l'invasion [59], et ont une grande valeur de recherche.

Dans cette étude, une technologie de séquençage à haut débit a été utilisée pour construire le profil d’expression des miARN des exosomes sériques, et 33 miARN DE ont été identifiés. Comme nous le savons tous, le miARN codé par l’hôte peut se lier au génome viral, puis réguler la réplication, la synthèse et la libération du virus pour limiter l’infection et affecter le processus pathologique (15). Des études sur les miARN ciblant le génome viral ont également été rapportées à plusieurs reprises chez les animaux. gga-miR-454 et gga-miR-130b dans la bursite infectieuse du poulet peuvent cibler le génome viral pour inhiber la réplication virale, tandis que gga-miR-21 cible directement la protéine virale VP1 pour inhiber traduction des protéines virales [60,61]. Dans les études sur le SDRP, ssc-miR-181 se lie spécifiquement à une région hautement conservée en aval du génome viral ORF4 et inhibe fortement la réplication du SDRP (62). Dans cette étude, la différence d'expression de ssc-miR-181 entre les deux groupes n'a pas atteint un niveau significatif. Dans notre étude, les génomes de neuf virus SDRP différents ont été comparés à ceux de la souche CHsx1401 et les huit segments les plus conservés ont été identifiés. Il a été prédit que 31 miARN DE pourraient se lier aux 8 segments les plus conservés de CHsx1401 et que 16 miARN DE pourraient se lier aux séquences conservées proches des 30 UTR de CHsx1401. Parmi eux, 5 miARN DE (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 et ssc-miR{{ 36}}) peuvent simultanément se lier au CHsx1401 30 UTR. De plus, il était prévu que l'expression régulée positivement de ssc-miR-223 se lierait à la cible 30 UTR du génome du PRRSV. Les résultats ont montré que les séquences conservées du génome du virus pourraient jouer un rôle clé dans sa pathogénicité, et que les miARN capables de se lier aux séquences conservées entre les génomes de différentes souches du SDRPV pourraient avoir une importance importante dans le contrôle de la pathogénicité du virus. Des études antérieures ont prouvé que certains miARN exprimés différentiellement étaient liés au SDRP et même directement impliqués dans la régulation du SDRP, notamment ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], soit-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] et ssc-miR{{57 }}un [67].

Le SDRP peut échapper à la défense de l'hôte en interférant avec la réponse immunitaire innée. Ce processus est régulé par de nombreuses voies de signalisation, notamment la voie de signalisation MAPK, la voie de signalisation PI3K Akt, l'autophagie, la chimiokine et la voie de signalisation TNF. À l’heure actuelle, la voie de signalisation MAPK comprend trois voies principales : la voie ERK1/2, JNK et p38. L'activation de la cascade MAPK peut favoriser l'apoptose des cellules hôtes, aider le virus à échapper à la réponse de défense immunitaire de l'hôte et favoriser la réplication du SDRP (68). De plus, l'activation des kinases c-Jun N-terminales (JNK) et de p38 peut également favoriser la libération du facteur inflammatoire IL-10 [68-70] et renforcer l'effet inflammatoire. En plus d’induire l’apoptose, le SDRP peut également induire une autophagie, ce qui peut favoriser la réplication du SDRP. L'activation de PI3K/Akt est nécessaire à l'entrée du virus et à la promotion de la réplication du virus, et l'Akt activé par le PRRSV inhibe l'apoptose des cellules hôtes en régulant négativement la voie JNK (71). TNF Il peut jouer un rôle important dans l'induction et la régulation de la réponse inflammatoire avec d'autres facteurs inflammatoires, mais l'expression du TNF est affectée par la régulation négative de la réplication du SDRP (72). Dans la présente étude, les miARN (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p, etc.) enrichis dans ces voies sont impliqués dans l'apoptose, l'autophagie et l'inflammation induites par le SDRPV et sont étroitement associés à la réponse immunitaire virale, à l'évasion immunitaire et à la réplication.

cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire

La membrane plasmique cellulaire est riche en une variété de radeaux lipidiques, et les sphingolipides riches en sphingolipides et en cholestérol (sphingomyéline et glycosphingolipides) sont des molécules clés des radeaux lipidiques. La reconnaissance des lipides par certaines protéines du virus peut être une condition nécessaire à l'entrée du virus [73]. Les virus d'enveloppe insèrent des glycoprotéines d'enveloppe virale dans des radeaux lipidiques au stade de l'entrée du virus, interagissent avec des récepteurs situés dans des radeaux lipidiques ou passent de leur état naturel à une forme activée pour initier ou favoriser l'internalisation/fusion virale, comme le HSV, le coronavirus du SRAS et virus de la diarrhée épidémique du porcelet [73,74]. Des études antérieures ont montré que l'élimination du cholestérol de la surface des cellules MARC-145 réduisait de manière significative l'infection par le SDRP, démontrant que l'inhibition de l'infection par le SDRP était spécifiquement médiée par l'élimination du cholestérol cellulaire. L'épuisement du cholestérol membranaire cellulaire a inhibé de manière significative l'entrée du virus, en particulier sa fixation, et sa libération (75). Le métabolisme des sphingolipides peut réguler la structure et l’adhésion des membranes, ce qui revêt une grande importance dans l’invasion du virus SDRP. L'endocytose était l'enrichissement le plus significatif de cette étude. L'endocytose est un mécanisme important d'absorption des exosomes par les cellules cibles. Des études antérieures ont montré que l'absorption des exosomes est un processus exigeant en énergie et dépendant du cytosquelette, ce qui met en évidence le rôle potentiel de l'endocytose dans ce processus (76). Il a été prouvé que plusieurs voies peuvent médier ce processus, notamment la phagocytose, la macropinocytose, la clathrine, etc. [77,78], ce qui a conduit à différentes classifications et rôles des substances endocytosées. L'enrichissement en miARN exosomal exprimés différentiellement dans cette voie indique que les exosomes jouent un rôle important dans l'infection par le SDRP et que la régulation du transport et de l'absorption du contenu dans les exosomes peut conduire à des modifications physiopathologiques dans les cellules et organes cibles.

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5. Conclusions

Grâce à l'identification et à l'analyse bioinformatique des miARN exosomiques sériques de porcs infectés par le SDRP, diverses voies liées au SDRP et des miARN différentiellement exprimés ont été obtenus dans cette étude, tels que ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, etc., qui jouent des rôles fonctionnels potentiels dans le SDRP -réponse immunitaire induite, invasion et absorption des exosomes. De plus, étant donné qu’un seul miARN peut cibler plusieurs gènes et qu’un seul gène est également régulé par plusieurs miARN, plusieurs miARN remplissent plusieurs fonctions dans les voies ci-dessus. Il a été vérifié que certains miARN régulent l'infection par le SDRP en agissant sur des récepteurs clés ou en ciblant directement le génome du virus, comme ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a, etc. Pendant ce temps, la présente étude a également prédit une variété de miARN qui peuvent se lier à le fragment le plus conservé des 30 UTR du génome du virus CHX1401, comprenant ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } et ssc-miR-6529, qui peuvent être importants pour réguler la pathogénicité virale.

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