Le ciblage de la cathepsine B par le cycloastragénol améliore l'immunité antitumorale des lymphocytes T CD8 en inhibant la dégradation du CMH-I Partie 1

ABSTRAIT

Arrière-planLa perte d'antigènes tumoraux et la déplétion des cellules T CD8 causées par la voie PD-1/PD-L1 sont des facteurs importants pour l'échappement immunitaire tumoral. Ces dernières années, les recherches sur la médecine traditionnelle chinoise dans le traitement des tumeurs se sont multipliées. Le cycloastragénol (CAG), une molécule active efficace dans Astragalus membranaceus, s'est avéré avoir des fonctions antivirales, anti-âge, anti-inflammatoires et autres. Cependant, son effet antitumoral et son mécanisme ne sont pas clairs.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages anioniques des radicaux libres thymine.

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MéthodesL'effet antitumoral de CAG a été étudié dans des modèles de tumeurs transplantées de souris MC38 et CT26. L'effet antitumoral du CAG a été analysé plus en détail par séquençage multi-omique unicellulaire. La technologie de profilage d'accessibilité sensible à la cible a été utilisée pour trouver la protéine cible de CAG. Par la suite, le mécanisme antitumoral de CAG a été exploré en utilisant la microscopie confocale, l'immunoprécipitation et la transfection de plasmides mutants. Enfin, l'effet antitumoral combiné des anticorps CAG et PD -1 chez la souris ou les organoïdes a été étudié.

RésultatsNous avons constaté que le CAG inhibait efficacement la croissance tumorale in vivo. Notre atlas multi-omique unicellulaire a démontré que le CAG favorisait la présentation des antigènes de surface des cellules tumorales et se caractérisait par la fonction de destruction améliorée des cellules CD8 plus T. Mécaniquement, CAG s'est lié à sa protéine cible, la cathepsine B, qui a ensuite inhibé la dégradation lysosomale du complexe majeur d'histocompatibilité I (MHC-I) et promu l'agrégat n de MHC-I à la membrane cellulaire, stimulant la pré-station de l'antigène tumoral. . Pendant ce temps, la combinaison de CAG avec l'anticorps PD -1 a efficacement amélioré la destruction des cellules CD8 plus tueuses de tumeurs chez les souris xénogreffes et les organoïdes du cancer colorectal. Conclusion Nos données ont rapporté pour la première fois que la régulation à la baisse de la cathepsine B confère une immunité antitumorale et explique le mécanisme antitumoral du produit naturel CAG.

INTRODUCTION

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus répandus dans le monde. Son taux d'incidence et son taux de mortalité se classent parmi les trois principaux, menaçant gravement la vie et la santé humaines.1 Les méthodes de traitement courantes comprennent la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, les médicaments ciblés et l'immunothérapie.2–4 Cependant, les cellules cancéreuses présentent généralement une perte d'antigènes de surface et expriment des niveaux élevés de molécules inhibitrices pour échapper à la surveillance des cellules immunitaires. Par conséquent, pour résoudre le problème de l'évasion immunitaire de la tumeur, les chercheurs ont développé des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires et une thérapie néo-antigène pour bloquer le masquage des cellules cancéreuses sur les cellules immunitaires.5–8 Bien que les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires puissent restaurer les cellules immunitaires épuisées, l'antigène de surface du cancer cellules n'a pas été amélioré de manière significative. Par conséquent, il est particulièrement important de trouver des médicaments qui peuvent favoriser la présentation des antigènes de surface tumorale. La reconnaissance des cellules cancéreuses par les lymphocytes T cytotoxiques CD8 plus dépend de la voie TCR/CD3/complexe majeur d'histocompatibilité (MHC-I). Le TCR reçoit l'antigène présent par la protéine CI de la membrane des cellules dendritiques/cellules cancéreuses et transmet le signal pour connecter étroitement CD3, qui s'étend ensuite plus profondément dans le cytoplasme.9 10 En même temps, avec l'activation du signal CD28/B7 , les lymphocytes T CD8 plus peuvent être coactivés pour reconnaître et tuer les cellules cancéreuses.11 Des études récentes ont montré que, dans le processus de progression tumorale, les lysosomes entraînent la réduction de l'agrégation du CMH-I à la surface des cellules cancéreuses, ce qui n'est pas efficace. présentent des antigènes.12 13 Liu et al ont rapporté que l'inhibition de PCSK9 peut empêcher la dégradation du MHC-I dans les lysosomes et permettre au MHC-I de retourner à la membrane cellulaire pour présenter des antigènes.12 Par conséquent, la restauration de la fonction de présentation d'antigène du CMH-I est particulièrement important pour bloquer la fuite immunitaire tumorale.

Un nombre croissant d'études ont montré que l'application de molécules actives de la médecine traditionnelle chinoise dans l'intervention antitumorale a de grandes perspectives.14 15 Le cycloastragénol (CAG) est une molécule active efficace dans Astragalus membranaceus, qui a des propriétés antivirales, antibactériennes, anti- inflammatoires et d'autres effets pharmacologiques, mais son effet antitumoral est rarement rapporté.16–19 Dans cette étude, nous avons constaté que le CAG inhibait la croissance des tumeurs tran tées des tumeurs cancéreuses du côlon. Le mécanisme consistait principalement à inhiber la dégradation du CMH-I, médiée par cathepsine B (CTSB), favorisant la présentation antigénique des cellules cancéreuses, puis améliorant la capacité de destruction des cellules CD8 plus T.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Anticorps et réactifs

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 pour cent). Anticorps de CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID : AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID : AB_1557426 ), Actine (Cat#{{ 5}}Ig, PRID : AB_2782959 ), tubuline (Cat#10094-1-AP, PRID : AB_2210695) ​​et kit de détection immunohistochimique anti-souris/lapin (Cat#PK10006) ont été achetés chez Proteintech. Anticorps de H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID : AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID : AB_626853), et CTSB (Cat#sc-365558, PRID : AB_10842446) ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology. L'anticorps de Ki-67 (Cat#12202, PRID : AB_2620142) a été acheté auprès de Cell Signaling Technology. L'anticorps de Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID : AB_303877) a été acheté auprès d'Abcam. Anticorps de cytométrie en flux de CD45-V500 (Cat#561487, RRID : AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID : AB_2833003) et CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID : AB_2868802) ont été achetés auprès de BD Bioscience. L'anticorps de cytométrie en flux de Gzmb-FITC (Cat # 515403, RRID : AB_2114575) a été acheté auprès de BioLegend. Anticorps de cytométrie en flux de NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID :AB_469664) et IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. Le milieu DMEM (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) et le sérum bovin fœtal (Cat#C04001-500) ont été achetés auprès de Biological Industries. Le sérum de chèvre (Cat # 88RNG001) et le kit de test de protéines Pierce BCA (Cat # 23225) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. Les anticorps anti-PD humaine-1 (Cat#BE0188, RRID : AB_1095031 8) et anti-PD de souris-1 (Cat#BE0146, RRID : AB_1094905 3) ont été achetés chez Bio X cell. Le kit de dissociation des tissus tumoraux MACS (Cat#130-095-929) a été acheté auprès de Miltenyi Biotec.

Culture de cellules

Les lignées cellulaires de cancer du côlon de souris MC38 et CT26 ont été conservées dans notre laboratoire.20 Les lignées de cancer du côlon humain HCT-116 ont été obtenues auprès de la Type Culture Collection de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Les cellules MC38, CT26 et HCT-116 ont été cultivées dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 degrés dans un incubateur à 5 % de CO2.

Expérience de greffe de tumeur

Des souris C57BL/6JGpt femelles âgées de six à huit semaines, des souris BALB/c et des souris nues BALB/,c ont été achetées auprès de GemPharmatech (Nanjing, Chine). Des cellules cancéreuses MC38 ou CT26 (1 x 106) ont été inoculées par voie sous-cutanée à chaque souris. Lorsque la tumeur atteint 100 mm3, le micro a été divisé au hasard en groupe salin tamponné au phosphate (PBS) (par exemple, une fois par jour) et le groupe CAG (par exemple, 50 mg/kg une fois par jour). Les volumes des tumeurs ont été déterminés par mesure au pied à coulisse à l'aide de la formule V=longueur × largeur2/2. Lorsque le volume tumoral des souris du groupe PBS a atteint 1000 mm3, la tumeur des souris a été prélevée, photographiée et pesée.

Dissociation unicellulaire de la souris pour l'ARN/ATACseq unicellulaire

Les tumeurs solides de souris ont été digérées à l'aide du kit de dissociation des tumeurs pour obtenir des cellules individuelles unicellulaires. Single celSingle-cell s avec une concentration de 1000 cellules/1000 cellules chargées sur les cellules uniques 10×genomics chromium controller selon le protocole du fabricant 10×genomics. Des réactifs de transcription inverse, des billes de gel à code-barres et de l'huile de séparation ont été mélangés avec les cellules pour générer des billes de gel dans des émulsions (GEM) pour la transcription inverse. Prétraitement des données scRNA-seq et contrôle de quai.

Basé sur le génome de référence de souris GRCm38 (mm10), le pipeline CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) pour traiter l'ARN unicellulaire données de séquence pour chaque expérience (GSE197229). Les matrices d'expression génique numérique ont été sélectionnées dans R (V.4.0.4) à l'aide du package Seurat (V.4.0.0).21 Avant l'analyse dBeforem, les cellules ont été filtrées par numéro UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Prétraitement et contrôle qualité des données SeaTac-seq

Les données ATAC-seq à cellule unique (GSE197229) ont été prétraitées par cell ranger-at (V.2.0.0) avec la ligne de commande count. Pour le traitement et l'analyse ultérieurs des données scATAC-seq, nous avons utilisé le package ArchR (V.1.0.1).24 Ensuite, nous avons utilisé la fonction addArchRGethe nome ('mm10') pour l'annotation du génome et créé un fichier arrow avec la fonction cre ArrowFiles avec les paramètres par défaut. Ensuite, nous avons utilisé la fonction filterDoublets pour supprimer les doublets potentiels et créé un projet ArchR en utilisant la fonction ArchRProject avec les paramètres par défaut. Nous avons ensuite utilisé le package Harmony pour supprimer l'effet de lot par la fonction addHarmony.25 Pour la réduction de la dimensionnalité, nous utilisons la fonction addIterativeLSI dans ArchR pour exécuter avec les paramètres def t. Pour l'incorporation d'une seule cellule, nous avons sélectionné l'objet reduceDims avec harmonie et utilisé la fonction addTSNE avec le paramètre 'perplexity=30' pour la visualisation.

Analyse intégrée des données siRNA-seq et scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Pour améliorer la précision des prédictions afin de mieux intégrer les deux jeux de données, nous avons à nouveau intégré les données scATAC-seq et scRNA-seq en utilisant le mode "intégration contrainte". En bref, nous avons annoté les données scATAC-seq avec des types de cellules basés sur les scores génétiques de scATAC-seq. Ensuite, nous avons créé une liste restreinte telle que la similarité de l'expression génique n'a été calculée que dans le même type de cellule pour scATAC-seq et scRNA-seq. Le regroupement non supervisé avec t-SNE a révélé 13 grappes de sous-cellules, qui ont été annotées par des marqueurs connus ou putatifs dans le tableau supplémentaire en ligne 1.

Trajectoire de lignée pseudo-temporelle

La trajectoire de lignée cellulaire des cellules cancéreuses a été déduite à l'aide du package R Monocle2 (V.2.18.0). processus biologiques de manière robuste et précise.27 Nous avons utilisé la fonction « differentialGeneTest » pour dériver le DEG de chaque cluster, et après avoir construit la trajectoire cellulaire, nous avons détecté les gènes exprimés de manière différentielle dans le pseudo-temps. Tous les gènes pseudo-dépendants du temps ont été visualisés par la fonction de carte thermique plot_pseudotime_ en prenant un objet CellDataSet. Les tracés de trajectoire de lignée et les courbes d'expression lisse basées sur CellDataSet ont été générés par plot_cell_trajectory et plot_gènes_en_pseudotemps, respectivement.28

Appel de variation du numéro de copie à cellule unique

Pour identifier les cellules malignes avec des variations clonales du nombre de copies chromosomiques à grande échelle (CNV), nous avons utilisé le package inferCNV R pour déduire les profils génétiques de chaque cellule en fonction de l'expression moyenne de grands ensembles de gènes dans chaque région chromosomique du génome de la tumeur par rapport à cellules normales.29 Sur une base échantillon par échantillon, les cellules immunitaires ont été utilisées comme référence pour estimer les CNV dans les cellules cancéreuses.

Analyse d'enrichissement

Les analyses de la voie KEGG et des annotations GO ont été effectuées à l'aide du package R clusterProfiler (V.3.11.1) avec les paramètres de PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 et MaxGSSize=500.20L'analyse de l'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) a été appliquée à l'aide de 50 ensembles de gènes caractéristiques (h.all.V.7.4.symbols.gmt) pour identifier les voies fonctionnelles via le logiciel GSEA (V.4.1.0), avec des critères de dépistage de P-value nominale<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Analyse PCR quantitative en temps réel

Les cellules MC38 et HCT-116 ont été ensemencées dans des plaques à six puits pendant 6 heures, puis traitées avec du CAG pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid et centrifugées à 180g pendant 5 min à 4 degrés. Dans le même temps, après broyage du tissu tumoral. L'ARN total a été extrait des cellules MC38, HCT-116 et du tissu tumoral à l'aide du réactif TRIzol, conformément aux instructions du fabricant. Le volume de réaction était de 20 µL contenant : 1 µg d'ARN, 5 µL de SuperMix qRT 5×Hiscript III et RNase Free dH2 O. L'ADNc a été soumis à une PCR quantitative, avec un volume de réaction de 10 µL avec 1 µL d'ADNc, 5 µL de mélange qPCR, 0,75 µL d'amorces 5 µM (avant et arrière) et 3,25 µL de dH2O sans RNase. Les amorces ont été synthétisées par GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Chine) selon les séquences suivantes (tableau supplémentaire en ligne 2).

Découverte de cible via une approche de profilage d'accessibilité adaptée à la cible

Le criblage des protéines de liaison au CAG a été effectué comme décrit précédemment.31 32 En bref, l'approche de profilage d'accessibilité sensible à la cible (TRAP) a été utilisée pour découvrir les protéines de liaison au CAG dans le milieu cellulaire en surveillant la lysine induite par l'engagement du ligand l'accessibilité change au niveau du protéome. En bref, deux boîtes de cellules ont été traitées avec 1 0 µM de CAG et de diméthylsulfoxyde (DMSO), respectivement. Après 1- heures d'incubation, les cellules ont été perméabilisées par un tampon M-PER (Thermo Scientific) et les lysats résultants ont été marqués de manière covalente par l'ajout de complexe de formaldéhyde et de borane pyridine qui, ensemble, marquent spécifiquement les résidus de lysine protéique à température ambiante pour le profilage d'accessibilité . Ensuite, les lysats ont été précipités par un solvant organique et les culots collectés ont été redissous dans 8 mol/L d'urée, réduits par du dithiothréitol (DTT) à 56 degrés pendant 30 min, suivis d'une alkylation à l'aide d'iodoacétamide (IAA) dans l'obscurité pendant 30 min. Une quantité appropriée de solution de DTT a été ajoutée à nouveau pour réagir avec l'excès d'IAA. Par la suite, le protéome a été dilué avec une solution de bicarbonate d'ammonium jusqu'à ce que la concentration finale d'urée atteigne 1mol/L. Les digestions de protéines collectées ont été dessalées sur des colonnes C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, États-Unis) et les peptides enrichis ont été séchés et reconstitués dans une solution aqueuse à 0, 1% d'acide formique (FA). Le système AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) a été utilisé pour analyser les échantillons pour le profilage quantitatif des changements d'accessibilité de la lysine en réponse à la liaison CAG pour la découverte de cibles. L'acquisition de la dépendance des données en mode positif a été utilisée pour l'acquisition des données. L'analyse des données a été effectuée à l'aide de PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Canada). Plus précisément, l'alkylation cys a été sélectionnée comme modification fixe, et l'oxydation de la méthionine et la diméthylation de la lysine, obtenues par marquage TRAP, ont été définies comme modifications variables. En bref, les peptides contenant la diméthylation induite par TRAP et présentant des changements d'abondance significatifs avec et sans incubation CAG ont été désignés comme peptides sensibles à la cible. Le rapport de l'abondance de chaque peptide marqué par TRAP indique l'étendue du changement d'accessibilité et est intimement associé à l'affinité de liaison au ligand. Le test t de Student a été effectué pour évaluer si les changements d'accessibilité détectés des peptides marqués sont statistiquement significatifs. Une p-value intergroupe (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Culture organoïde

Les organoïdes du cancer colorectal humain ont été construits et cultivés par Chongqing Kingbiotech.33 Des échantillons de tissus de patients acquis par l'opération chirurgicale ont été hachés en morceaux aussi petits que possible par des ciseaux stériles. Les morceaux de tissu ont été soigneusement mélangés avec du Matrigel (Corning, Cat # 356231) dans un rapport approximatif de 1:4 sur de la glace. Le traitement ultérieur fait référence à des protocoles publiés. En bref, les suspensions de pièces-Matrigel ont été ensemencées rapidement dans la plaque multipuits pour former des gouttelettes hémisphériques et transférées à 37 degrés pendant 15 à 20 minutes, permettant aux gouttelettes de se solidifier. Ajouter la quantité appropriée de milieu de culture (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​à chaque puits et changer le milieu tous les 2 à 4 jours.

Isolement et culture de lymphocytes T CD8 humains

Ajouter le même volume de solution saline normale au sang périphérique de personnes en bonne santé contenant des anticoagulants pour diluer le sang total. Ajouter un certain volume de solution de séparation dans un tube à centrifuger de 15 ml, ajouter lentement le sang total dilué le long de la paroi du tube jusqu'au sommet de la solution de séparation et centrifuger à 750 g pendant 20 minutes. Après centrifugation, utilisez une pipette pour aspirer soigneusement les monocytes de la couche blanche moyenne dans un tube à centrifuger de 15 ml, ajoutez un certain volume de PBS pour remettre en suspension, centrifugez 250 g pendant 5 minutes et jetez le surnageant. Après avoir ajouté des billes magnétiques CD8 humaines aux précipités cellulaires, les cellules T CD8 ont été triées par colonne de tri LS. Des cellules T CD8 ont été ajoutées à la plaque perforée pré-enduite de 5 µg/mL d'anticorps CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat # 16-0032-38, RRID : AB_2865578), puis de 10 ng/mL d'IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) et 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID : AB_468920) des anticorps fonctionnels ont été ajoutés et cultivés pendant 24 heures.

Coculture

Après que les organoïdes aient été incubés avec du CAG pendant 24 heures, le milieu de culture frais a été remplacé, puis les organoïdes et les lymphocytes T CD8 activés ont été suspendus dans le gel matriciel, puis la suspension a été ajoutée à la plaque à six puits et placée dans le 37 incubateur de degré pendant 15 minutes, puis 2 ml de milieu de culture complet sans sérum ont été ajoutés pendant 24 heures.

Western blot

Les cellules MC38 et HCT-116 ont été ensemencées dans des plaques à six puits pendant 6 heures, puis traitées avec du CAG pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid et centrifugées à 180 g pendant 5 minutes à 4 degrés. La protéine totale a été lysée avec une lyse WB-IP contenant 1 % d'inhibiteur de protéase pendant 30 minutes sur de la glace. Les protéines totales ont été évaluées à l'aide d'un kit de quantification des protéines BCA. Les échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS de 10 à 12 % et transférés sur des membranes de PVDF (fluorure de polyvinylidène) à 350 mA pendant 90 minutes. Les membranes PVDF ont été bloquées avec 5 % de BSA pendant 1 heure, les bandes avec l'anticorps primaire indiqué pendant une nuit et avec l'anticorps secondaire incubé pendant 90 minutes à température ambiante. Enfin, les bandes ont été détectées à l'aide d'un système de substrat chimioluminescent LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Cytométrie en flux

Après la digestion du tissu tumoral et la suspension unicellulaire a été préparée. La coloration de surface a été réalisée avec des anticorps d'antigène de surface dans le tampon FCM (cytométrie en flux) (PBS contenant 1% de FBS) et colorée sur de la glace avec des anticorps appropriés pendant 30 minutes. Des colorants réactifs (eBioscience) ont été utilisés pour éliminer les cellules mortes. La coloration intracellulaire des cytokines a été réalisée avec une solution de fixation de cellules BD/solution de membrane extracellulaire, et les cellules ont été fixées et imprégnées, puis colorées avec des anticorps contre les cytokines dans un tampon Perm/Wash (BD Biosciences).

Plasmides mutants CTSB transfectés

Les cellules HCT-116 ont été ensemencées dans des plaques à puits 6- pendant 12 heures, puis transfectées avec des plasmides mutants CTSB-WT-EGFP ou CTSB (Y75A, A77V et G198A) pendant 36 heures.

Interférence de transfection ou plasmide de surexpression de CTSB dans des cellules MC38 ou des cellules HCT-116

Les cellules MC38 (1 × 106 /puits) ont été inoculées dans des plaques 6-puits pendant 6 heures, puis transfectées avec de l'ARN interférent CTSB (séquence : Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT et Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) pendant 48 heures, et les niveaux d'expression d'ARNm ou de protéines de Ctsb et H2-k1 ont été détectés. Des cellules HCT-116 (1 × 106/puits) ont été inoculées dans des plaques à puits 6- pendant 6 heures, puis transfectées avec une interférence CTSB (séquence : GCTGGTCA ACTAGTCAACAA) ou un plasmide de surexpression pendant 48 heures, et l'ARNm ou les niveaux d'expression protéique de CTSB et HLA-A ont été détectés.

Technologie d'accueil

La structure 3D de CTSB a été téléchargée à partir de la base de données de protéines (PDB ID : 2iPP) et les structures de CAG ont été téléchargées à partir de PubChem. Le processus d'amarrage a été effectué dans Autodock 2 avec un amarrage grossier à l'aide d'un algorithme de recuit simulé et un raffinement ultérieur à l'aide d'un algorithme génétique.

Test de décalage thermique cellulaire

Les cellules MC38 ont été ensemencées dans des plaques de 10cm pendant la nuit, puis traitées avec du CAG ou du DMSO à 0,1 % pendant 2 heures supplémentaires. Les cellules ont été collectées, lavées avec du PBS froid et centrifugées à 180 g pendant 5 minutes. Les cellules ont ensuite été réparties uniformément dans des tubes de centrifugation (70 µL chaque tube) et chauffées pendant 3 min à la température suivante : 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 et 67 degrés, les échantillons ont été refroidis pendant 3 min à des températures et puis conservé sur glace. Ensuite, les échantillons ont été placés dans un réfrigérateur à -80 degrés pendant la nuit. Les échantillons ont été décongelés à température ambiante pendant 30 minutes puis réfrigérés à -80 degrés pendant 4 heures. Enfin, les échantillons ont été centrifugés à 12, 000 g pendant 25 min, le surnageant ajouté au tampon de charge et analysés par Western blot.

Coloration immunohistochimique

Des sections de paraffine de tissu tumoral ont été immergées dans du xylène pendant 20 minutes pour déparaffiner, puis dans de l'éthanol à 100 %, 75 % et 50 % pendant 10 minutes. Après que les tranches aient été soumises à une réparation antigénique avec une solution de réparation antigénique au citrate de sodium, le peroxyde d'hydrogène endogène a été inactivé avec du peroxyde d'hydrogène à 3 %. Après blocage avec 5% de sérum de chèvre pendant 1 heure, l'anticorps anti-Ki67 (1:200) a été ajouté et incubé pendant une nuit à 4 degrés. Le polymère marqué HRP anti-souris/lapin (100 µL) a été ajouté et les échantillons ont été incubés à 37 degrés pendant 30 min, suivis de 100 µL de solution de travail DAB et d'une incubation à température ambiante pendant 5 min. Après 1 minute de coloration avec de l'hématoxyline, les échantillons ont été lavés dans 50 %, 75 % et 100 % d'éthanol et de xylène pendant 5 minutes, et une gomme neutre a été utilisée pour sceller le film. Le film a été observé et photographié au microscope.

Statistiqueanalyse

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism (V.8.0). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Une analyse de variance unidirectionnelle suivie du test post hoc de Dunnett a été utilisée pour évaluer les différences lorsqu'il y avait plus de deux groupes. Le test t de Student a été utilisé pour évaluer la différence significative entre les deux groupes. Une signification statistique a été fixée à p<0.05.

RÉSULTATS

Analyse multi-omique unicellulaire de CAG inhibant la croissance du cancer du côlon transplanté chez la souris

Pour déterminer si le CAG a un effet antitumoral, nous avons d'abord transplanté des cellules cancéreuses MC38 dans des souris C57BL/6. Nous avons noté que le CAG inhibait de manière significative la croissance des tumeurs (figure supplémentaire en ligne S1A, B). Par la suite, nous avons transplanté des cellules CT26 dans des souris BALB/c et avons découvert que le CAG inhibait également la croissance des tumeurs (figure supplémentaire en ligne S1C, D).

Pour révéler davantage le mécanisme spécifique par lequel le CAG inhibe la croissance tumorale, nous l'avons analysé à l'aide des techniques scRNA-seq et scATAC-seq (figure 1A). Nous avons divisé la population cellulaire en quatre groupes : cellules cancéreuses, fibroblastes, cellules myéloïdes et lymphocytes (figure 1B, figure supplémentaire en ligne S2A, B). Nous avons constaté que les cellules cancéreuses (52 %) et les fibroblastes (41 %) étaient principalement infiltrés dans les tissus tumoraux, tandis que les cellules immunitaires ne représentaient que 7 % . Nous avons ensuite divisé les cellules cancéreuses en huit sous-ensembles et les fibroblastes en trois sous-ensembles (figure 1C – E). Par la suite, l'analyse d'enrichissement des gènes hautement exprimés dans chaque population cellulaire a montré que les voies moléculaires du CMH-I dans les cellules cancéreuses étaient enrichies, tout comme les signaux antitumoraux des cellules T et des cellules NK (figure supplémentaire en ligne S2C). Ensuite, quatre groupes de cellules ont également été trouvés en utilisant l'analyse d'intégration scATAC-seq et scRNA-seq (figure 2D – G). Suite à la comparaison, nous avons constaté que les cellules cancéreuses (cellules C01, C03), les cellules CD8 plus T, les cellules Spp1 plus TAM et les fibroblastes (cellules F01 et F02) sont apparues dans le séquençage ATAC (figure 1F, G), et en outre, hautement exprimées des facteurs de transcription ont été enrichis dans ces cellules (figure 1H). Grâce à ces analyses, nous supposons que l'inhibition de la croissance tumorale par CAG est étroitement liée aux changements dans ces cellules.

Cag favorise la présentation de l'antigène des cellules tumorales

Pour analyser le mécanisme antitumoral du CAG, nous avons d'abord analysé la population de cellules tumorales et divisé les cellules cancéreuses en huit sous-groupes (figure 2A, B, figure supplémentaire en ligne S3A). Les résultats ont montré que, par rapport au groupe PBS, les cellules du groupe C05 ont diminué de manière significative tandis que les cellules du groupe C07 ont augmenté (figure 2C). Pendant ce temps, pour vérifier l'exactitude de notre regroupement de cellules tumorales, nous avons comparé le CNV des lymphocytes et des cellules myéloïdes comme cellules de référence. Les résultats ont montré que la CNV des cellules cancéreuses était significativement plus élevée que celle des cellules immunitaires (figure supplémentaire en ligne S3B). Lors de l'analyse des sous-ensembles de cellules cancéreuses, nous avons constaté que les gènes de réponse à l'interféron Isg15, Irf7, Ifit3 et Ifi47 étaient fortement exprimés dans les populations de cellules C07 et C08 du groupe CAG par rapport au groupe PBS (figure supplémentaire en ligne S3C). L'analyse de la population de cellules tumorales a révélé que les voies liées à la présentation de l'antigène étaient considérablement enrichies dans plusieurs populations de cellules. Par conséquent, nous supposons que le CAG peut favoriser la présentation antigénique des cellules cancéreuses pour jouer un rôle antitumoral (figure 2D). Ensuite, nous avons sélectionné les gènes liés à la présentation de l'antigène et avons constaté que le niveau d'expression dans le groupe CAG était significativement plus élevé que celui dans le groupe PBS (figure 2E, figure supplémentaire en ligne S3D). Nous avons également constaté que le CAG favorisait la présentation de l'antigène dans les tissus tumoraux (figure 2F, G).

Ensuite, nous avons utilisé scATAC-seq pour analyser les raisons spécifiques de la présentation de l'antigène des cellules tumorales favorisant le CAG. Nous avons constaté que la population de cellules tumorales exprimait fortement les facteurs de transcription Fos, Junb, Jund, Fosb et Fosl1 (figure 2H, I). Par la suite, nous avons construit une carte de l'interaction entre les facteurs de transcription et les gènes correspondants pour expliquer que le CAG favorisait l'expression des gènes liés à la présentation de l'antigène des cellules tumorales (figure 2J). Dans les tissus tumoraux, nous avons également constaté que les facteurs de transcription Junb, Fos, Jund et Fosb étaient significativement surexprimés dans le groupe PBS sous traitement CAG (figure 2K – N, figure supplémentaire en ligne S3E-I). Jusqu'à présent, nous avons découvert que le CAG peut favoriser l'expression des facteurs de transcription des gènes liés à la présentation de l'antigène, améliorant ainsi la fonction de présentation de l'antigène des cellules cancéreuses. Cependant, la façon dont ces cellules cancéreuses réagissent aux réponses des cellules immunitaires reste incertaine.

Pour découvrir le phénomène par lequel CAG favorise la présentation antigénique des cellules cancéreuses, nous avons effectué une analyse de trajectoire pour étudier comment les cellules cancéreuses s'altèrent en réponse aux réponses des cellules immunitaires. Nous avons constaté qu'au fil du temps, les cellules cancéreuses C07 se transformaient en cellules C05, C06 et C08, et l'enrichissement génétique montrait également que les cellules cancéreuses se transformeraient en présentation antigénique (figure 3A–E).

CAG améliore la fonction de destruction des cellules immunitaires

Ces résultats montrent que le CAG peut présenter des antigènes de cellules tumorales, donc l'amélioration de la présentation des antigènes des cellules tumorales conduira-t-elle à l'amélioration de la fonction des cellules immunitaires ? Pour comprendre cela, nous avons analysé les lymphocytes et les cellules myéloïdes, respectivement. Les résultats ont montré que le CAG favorisait l'infiltration des cellules CD8 plus T dans les tissus tumoraux, et l'infiltration des cellules CD8 plus T et des cellules NK était également augmentée, détectée par cytométrie en flux (figure supplémentaire en ligne S4A-F). Nous avons également observé que CAG augmentait l'expression des gènes Ifitm2, Cxcr6 et S100a6 dans les cellules CD8 plus T,

Gènes Fcer1g, Gzmb, AW112010 et Zfp36i2 dans les cellules NK, et gènes Nfkbia et Junb dans les cellules CD4 plus T (figure supplémentaire en ligne S4G). L'expression d'Ifng et de Gzmb dans les cellules CD8 plus T a également été considérablement améliorée, comme détecté par cytométrie en flux (figure supplémentaire en ligne S4H, I). De plus, nous avons constaté qu'après le traitement CAG, l'expression des récepteurs inhibiteurs Lag3, Tigit et Havcr2 à la surface des lymphocytes T CD8 plus a diminué, et l'expression des gènes Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 et Pdcd1, caractérisant le l'activation des cellules CD8 plus T a augmenté de manière significative (figure supplémentaire en ligne S4J). Pour vérifier davantage que le CAG améliorait la fonction de destruction des cellules CD8 plus T en favorisant une meilleure présentation de l'antigène tumoral, nous avons transplanté des cellules CT26 dans des tumeurs transplantées chez des souris nues et avons observé que le CAG ne pouvait pas inhiber efficacement la croissance des tumeurs (figure supplémentaire en ligne S4K-M ).

Suite à cela, nous avons analysé les cellules myéloïdes et constaté que les cellules Spp1 plus TAM augmentaient après le traitement CAG, tandis que le nombre de cellules C1qc plus TAM diminuait et le nombre de monocytes Il1b plus augmentait (figure supplémentaire en ligne S5A-D). Après le traitement CAG, les cellules Spp1 plus TAM et C1qc plus TAM étaient plus sensibles à la transformation pro-inflammatoire TAM. L'analyse d'enrichissement a révélé qu'elle se concentrait principalement sur Tnf-, Ifn-g et la voie de signalisation de la réponse inflammatoire (figure supplémentaire en ligne S5E-H). Sur la base des résultats mentionnés ci-dessus, nous en déduisons que le CAG améliore la fonction de reconnaissance et de destruction des cellules immunitaires en favorisant la présentation de l'antigène dans les cellules cancéreuses. Cependant, la façon dont le CAG est réglementé n'est pas claire.

Découverte de la protéine cible CAG CTSB par piège

Ensuite, nous étudierons la protéine cible CAG spécifique qui joue un rôle antitumoral. Nous avons choisi les cellules cancéreuses comme objet de recherche parce que nous avons découvert que le CAG peut améliorer la présentation antigénique des cellules cancéreuses, améliorant ainsi la fonction de destruction des cellules immunitaires. Nous avons d'abord synthétisé le dérivé biotine de CAG et avons découvert que seul 3-OH pouvait réagir (figure supplémentaire en ligne S6A). Nous avons ensuite recherché si la CAG-biotine favorise également l'expression de gènes liés à la présentation de l'antigène dans la lignée cellulaire tumorale MC38 de souris. Les résultats montrent que la CAG-biotine n'a pas affecté l'expression des gènes H2-K1, Cd74 et Anxa1 (figure supplémentaire en ligne S6B-D).

Par conséquent, nous avons utilisé la précédente méthode de recherche de cible TRAP au laboratoire.32 CAG et DMSO ont tous deux été incubés avec la lignée cellulaire MC38 (figure 4A). Nous avons sélectionné la protéine avec FC supérieur ou égal à 2 et ap inférieur ou égal à 0.05 comme protéine cible candidate de CAG. Partant du principe que la liaison de petites molécules aux protéines conduira à la faible efficacité de marquage de la lysine, nous avons sélectionné le CTSB pour l'étude (figure 4B). Ensuite, nous avons utilisé un test de décalage thermique cellulaire (figure 4C) et une thermophorèse à micro-échelle (MST) (figure 4D) pour vérifier la liaison entre CAG et CTSB, et avons constaté que l'affinité entre CAG et CTSB était de 26,6 nM (figure 4D). Par la suite, nous avons prédit les sites de liaison entre CAG et CTSB en fonction de la structure cristalline de la protéine CTSB dans la bibliothèque PDB. Nous avons constaté que les groupes hydroxyle aux deux extrémités de CAG et les sites ALA77 et GLY198 de CTSB étaient liés par une liaison hydrogène, tandis que les sites TYR75, PRO76 et ALA173 de CAG et CTSB étaient liés par la force de van der Waals (figure 4E) . Pour vérifier le site de liaison entre CAG et CTSB, nous avons transfecté le plasmide mutant de CTSB dans des cellules HCT-116. Les résultats montrent que l'affinité entre le plasmide mutant à A77V et G198A et CAG était des centaines de fois supérieure à celle du plasmide WT (figure 4F, G). Dans la section suivante, nous explorons le mécanisme spécifique par lequel le CAG joue un rôle antitumoral via le CTSB.

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