Le ciblage de la cathepsine B par le cycloastragénol améliore l'immunité antitumorale des lymphocytes T CD8 en inhibant la dégradation du CMH-I, partie 2

Le CAG inhibe la dégradation lysosomale du CMH-I médiée par le CTSB

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages anioniques des radicaux libres thymine.

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Des études antérieures ont démontré que le MHC-I est principalement dégradé dans les lysosomes au cours de la progression tumorale, entraînant une fuite immunitaire tumorale.12 13 Nous spéculons si le CAG peut également réguler l'expression du MHC-I sur la membrane cellulaire via sa protéine cible CTSB . Nous avons d'abord utilisé l'interférence ARN pour faire tomber l'expression de CTSB dans la lignée cellulaire MC38, et les résultats ont montré que les niveaux d'expression des gènes et des protéines de H2-k1 étaient augmentés après avoir fait taire CTSB (figure 5A, B). De même, après l'inactivation et la surexpression de CTSB dans la lignée cellulaire HCT -116 humaine, les niveaux d'expression d'ARNm ou de protéines de HLA-A ont augmenté (figure 5C, D) et diminué (figure 5E, F), respectivement. Dans le même temps, nous avons constaté que les cellules tumorales à forte expression de CTSB exprimaient des niveaux inférieurs de HLA-A, tandis que les cellules après l'inactivation de CTSB augmentaient l'expression de HLA-A (figure 5G). Ces résultats indiquent que le CTSB exerce un effet régulateur négatif sur l'expression du CMH-I. Ensuite, nous avons traité la lignée cellulaire MC38 avec CAG et avons constaté que CAG favorisait l'expression de MHC-I et n'avait aucun effet sur CTSB (figure 5H, I), ce qui était cohérent avec les résultats précédents d'études sur les tissus tumoraux. De plus, nous avons constaté qu'après le traitement au CAG, H 2- Kd s'est rassemblé de la cellule à sa membrane (figure 5J), ce qui a confirmé notre conjecture selon laquelle le CAG peut inhiber la dégradation de la molécule MHC-I et la faire se rassembler au membrane cellulaire, qui est plus facile à capturer par les cellules immunitaires. Pour valider davantage notre hypothèse, nous avons utilisé une expérience Co-IP pour déterminer si le CTSB se lie au CMH-I et conduit à sa dégradation. Nous avons constaté que le CAG pouvait inhiber la liaison du CTSB et du MHC dans les cellules MC38 de souris (figure 5K), et que l'expression du MHC-I augmentait également de manière significative. Nous avons également observé le même phénomène dans les cellules humaines HCT116 (figure 5L). Ensuite, pour confirmer davantage si CAG favorise l'expression du CMH-I et l'agrégation de la membrane cellulaire via CTSB, nous avons transfecté le plasmide mutant CTSB dans des cellules HCT -116 humaines. Les résultats ont montré qu'après la transfection des plasmides mutants Y75A, A77V et G198V, la fonction de CAG consistant à améliorer l'expression des gènes CD74 et HLA-A a été détruite (figure 5M) et les molécules MHC-I se sont agrégées de la membrane cellulaire aux lysosomes (figure 5N). Ce résultat a montré que le CAG inhibait la dégradation du MHC-I dans les lysosomes médiée par le CTSB et favorisait la réagrégation du MHC-I à la membrane cellulaire.

La combinaison des anticorps CAG et PD-1 améliore efficacement la capacité de destruction des tumeurs des cellules CD8 plus T

L'évasion immunitaire tumorale est principalement causée par la perte de la fonction de présentation de l'antigène des cellules tumorales et l'inhibition des points de contrôle immunitaires. Selon nos résultats, nous avons spéculé si le CAG pouvait être utilisé en combinaison avec l'anticorps PD-1 pour tuer les tumeurs, à la fois pour remédier aux lacunes de la présentation de l'antigène tumoral et pour résoudre l'épuisement des cellules CD8 plus T causé par le PD{ {2}}/ Voie PD-L1. Ainsi, nous avons transplanté des cellules cancéreuses MC38 dans des souris C57BL/6 et formé un groupe combiné d'anticorps PD-1 et de CAG. Les résultats ont montré que le groupe combiné d'anticorps CAG et PD-1 présentait de meilleurs effets antitumoraux que les groupes CAG et PD-1 (figure 6A–D). De plus, nous avons observé une augmentation significative du nombre de cellules H 2- Kd plus infiltrées, de cellules CD45 plus et de cellules CD8 plus dans les tissus tumoraux (figure 6E – G) et de l'expression des gènes liés à la présentation de l'antigène. H2-K1, Psmb8 et B2m ont également été améliorés (figure 6H–J). Pendant ce temps, l'expression des gènes Ifng et Tnf a également été considérablement améliorée (figure 6K, L), et la coloration immunohistochimique a montré que l'expression de H2-Kd augmentait de manière significative (figure 6M).

Par conséquent, cette étude a principalement clarifié le mécanisme antitumoral du CAG, principalement en inhibant la dégradation du CMH-I médiée par le CTSB, en favorisant l'agrégation des molécules du CMH-I à la membrane cellulaire, puis en améliorant la capacité de présentation de l'antigène des cellules cancéreuses. De plus, combiné à l'anticorps PD-1, il pourrait tuer très efficacement les cellules cancéreuses (figure 6N).

Le CAG favorise l'expression du CMH-I dans les organoïdes du cancer colorectal et améliore la capacité de destruction des cellules T CD8

Pour étudier plus avant si l'effet pharmacologique du CAG peut être appliqué cliniquement, des organoïdes du cancer colorectal humain ont été utilisés. Nous avons constaté que les organoïdes incubés avec CAG augmentaient l'expression du CMH-I (figure 7A) et que l'expression des gènes apparentés présentant l'antigène ANXA1, B2M et HLA-A augmentait également (figure 7B). Dans les expériences précédentes, nous avons constaté que le CAG augmentait l'effet destructeur des lymphocytes T CD8 en favorisant l'expression de la présentation antigénique des cellules tumorales, et que l'effet était supérieur lorsqu'il était combiné avec l'anticorps PD-1. Pour vérifier davantage ces résultats, nous avons prélevé le sang périphérique de personnes en bonne santé et isolé les lymphocytes T CD8, puis les avons incubés avec des organoïdes stimulés par CAG pendant 24 heures (figure 7C). Les résultats ont montré que par rapport au groupe DMSO, les lymphocytes T CD8 dans les organoïdes tumoraux traités au CAG ne s'éloignaient plus mais étaient plus concentrés à la surface des organoïdes ; dans le même temps, il y avait moins de cellules T CD8 dérivées dans les groupes CAG et PD -1 (figure 7D). Nous avons constaté que l'IFN-G sécrété par les lymphocytes T CD8 activés était augmenté en conséquence (figure 7E – H).

Jusqu'à présent, nous avons constaté que le CAG favorisait l'expression des tumeurs présentant l'antigène pour renforcer l'effet antitumoral des lymphocytes T CD8, et que la combinaison de l'anticorps CAG et PD-1 avait un effet antitumoral supérieur. De plus, nous avons analysé les données sur le cancer du côlon dans la base de données Cancer Genome Atlas (TCGA) et avons constaté que les gènes liés à la présentation de l'antigène HLA-A, HLA-B, HLA-C, CD74 et B2M présentaient de faibles niveaux d'expression dans les tumeurs, et le taux de survie de ces gènes à faible expression était très faible (figure 7I, J, figure 7A–H).

Par conséquent, nous avons constaté que l'expression régulée à la hausse de HLA-A, CD74 et d'autres gènes par CAG était bénéfique pour les patients atteints de tumeur. De plus, nous avons constaté que les patients présentant une expression élevée de HLA-A, ainsi que d'IFNG, avaient un taux de survie plus élevé (figure 7K) ; les patients avec une forte expression de HLA-A et une faible expression de PDCD1 avaient également un meilleur taux de survie (figure 7L). L'ensemble de ces résultats suggère que le CAG serait un candidat-médicament pour le traitement du cancer colorectal.

DISCUSSION

L'échappement immunitaire est une raison essentielle de l'échec du système immunitaire à contrôler la croissance tumorale, mais la façon dont les variants d'échappement émergent au cours de l'immunothérapie reste mal comprise.34 Des études ont montré que la perte de la fonction de présentation de l'antigène tumoral, les changements épigénétiques, l'expression de les protéines et les récepteurs immunosuppresseurs sont étroitement liés à l'évasion immunitaire tumorale. 6 7 35–37 Ces dernières années, bien que l'immunothérapie représentée par l'anticorps PD-1 ait fait de grandes percées, les phénomènes de résistance aux médicaments et de traitement non réactif du cancer colorectal ont suscité une grande insatisfaction.38 39 Par conséquent, trouver des produits chimiques qui peuvent favoriser la présentation de l'antigène tumoral et entrer en synergie avec l'anticorps PD -1 peut mieux empêcher l'évasion immunitaire de la tumeur.

Des études récentes ont montré que les molécules actives de la médecine traditionnelle chinoise jouent un rôle efficace dans le traitement de maladies, telles que le célastrol dans le traitement du syndrome métabolique,32 l'andrographolide dans la colite et le cancer,40 la baicaline dans les hypolipémiants et la trifolirhizine dans le contrôle des tumeurs. 41 42 Le CAG est une molécule active dans A. membranaceus et a les fonctions de maladies cardiovasculaires, de protection du foie, d'antibactérien et de traitement de l'anévrisme de l'aorte abdominale.18 43–45 Cependant, il existe peu de recherches à ce sujet dans le domaine du cancer colorectal. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si et comment le CAG inhibe la croissance du cancer du côlon murin.

Le développement des technologies scRNA-seq et scATAC-seq a considérablement fait progresser la recherche sur les maladies.46–48 Par conséquent, nous avons utilisé la technologie multi-omique unicellulaire pour analyser le mécanisme antitumoral spécifique du CAG. Il a été constaté que le CAG favorisait la fonction de présentation d'antigène des cellules cancéreuses et que les fonctions des cellules CD8 plus T, des cellules CD4 plus T et des cellules NK dans les lymphocytes étaient améliorées à des degrés divers. D'autre part, les cellules Spp1 plus TAM dans les cellules myéloïdes étaient plus enclines à la transformation de la réponse inflammatoire, et le signal d'hypoxie était significativement inhibé après le traitement CAG. Ces résultats sont cohérents avec les résultats rapportés dans des études précédentes, l'inhibition du signal d'hypoxie Spp1 plus TAM et l'amélioration de la réponse inflammatoire peuvent inhiber la croissance des tumeurs. les cellules T CD8 plus et les macrophages correspondants peuvent reconnaître et tuer efficacement les cellules cancéreuses. Nous avons en outre vérifié notre conjecture avec des expériences in vitro. L'analyse par cytométrie en flux a également montré que le CAG augmente l'infiltration des cellules immunitaires CD45, y compris les cellules CD8 plus T et les cellules NK. De plus, la capacité de l'IFN- et du GZMB sécrétés par les lymphocytes T CD8 plus est également considérablement améliorée par le CAG. Pour déterminer si les lymphocytes T CD8 ou les macrophages jouent un rôle majeur dans l'expérience antitumorale de CAG, nous avons testé notre conjecture avec des tumeurs transplantées chez des souris nude. En raison du trouble du développement des lymphocytes T provoqué par l'immunisation du thymus chez la souris nude alors que la fonction des macrophages existe toujours. Cependant, les résultats ont montré que le CAG ne pouvait pas tuer efficacement les tumeurs transplantées chez les souris nude. Ces résultats suggèrent que le CAG peut renforcer l'effet destructeur des lymphocytes T CD8 plus sur les tumeurs en favorisant la présentation antigénique des cellules cancéreuses.

Ensuite, nous avons exploré comment le CAG favorise la présentation antigénique des cellules cancéreuses par la technologie TRAP pour trouver la protéine cible du CAG pour expliquer le phénomène. La CTSB est une cystéine hydrolase, qui peut interagir avec d'autres protéines et se dégrader dans les lysosomes.50 Nous avons émis l'hypothèse qu'elle pourrait interagir avec les protéines liées à la présentation de l'antigène pour provoquer sa dégradation. Et il a été rapporté que la molécule MHC-I est dégradée dans les lysosomes, entraînant la perte de la fonction de présentation de l'antigène des cellules tumorales.13 Par conséquent, nous avons suspecté que le CTSB pourrait se lier à la molécule MHC-I et provoquer sa dégradation dans les lysosomes. Nous avons vérifié cette hypothèse selon laquelle le CAG pourrait empêcher la dégradation du MHC-I en inhibant l'interaction du CTSB et du MHC-I. Les organoïdes sont un modèle efficace pour étudier la progression des maladies tumorales et ont une grande importance pour promouvoir le traitement des patients atteints de tumeurs cliniques en étudiant l'effet des médicaments sur la croissance des organoïdes tumoraux et le mécanisme spécifique.51 52 Grâce à nos expériences, nous avons constaté que, combinés aux anticorps CAG et PD-1, ils ont une bonne capacité à inhiber la croissance tumorale, que ce soit dans des modèles de tumeurs transplantées chez la souris ou dans des organoïdes humains du cancer du côlon. La pénurie de cette étude est le nombre limité d'échantillons de xénogreffe et d'organoïdes de patients. Bien qu'il existe des conclusions similaires entre les modèles murins et les organoïdes humains, une enquête plus approfondie est nécessaire.

Ici, nous décrivons le mécanisme spécifique par lequel CAG inhibe la croissance du cancer du côlon, principalement en inhibant la dégradation du CMH-I médiée par CTSB, pour renforcer l'immunité antitumorale des lymphocytes T CD8 plus. D'une part, il favorise la présentation antigénique des cellules cancéreuses et, d'autre part, il soulage l'état de déplétion des cellules CD8 plus T. Les résultats expérimentaux ont également confirmé que la combinaison d'anticorps CAG et PD-1 avait un effet antitumoral supérieur.

En conclusion, à notre connaissance, ces résultats mettent en évidence que la régulation négative du CTSB confère une immunité antitumorale. Notre recherche a également expliqué le mécanisme spécifique du CAG dans l'inhibition de la croissance du cancer colorectal. Il convient de mentionner que CAG a un grand potentiel en tant que produit de santé sur les marchés européens et américains. Les résultats de nos recherches fournissent un candidat-médicament anticancéreux potentiel.

Affiliations d'auteurs

1 State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Chemistry and Biomedicine Innovation Center (ChemBIC), Department of Biotechnology and Pharmaceutical Sciences, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing, Jiangsu, Chine

2 Bioinformatique Département de médecine prédictive, Institut d'informatique biomédicale, Laboratoire de transduction des signaux cellulaires, École des sciences médicales fondamentales, Université du Henan, Kaifeng, Henan, République populaire de Chine

3 Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine in Prevention and Treatment of Tumor, The First Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, Jiangsu, Chine

4 Département de chirurgie générale, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai, République populaire de Chine

5 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing, Jiangsu, Chine

6 Genergy Bio-technology (Shanghai) Co. Ltd, Shanghai, Chine

7 Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical University, Xuzhou, Jiangsu, Chine

ContributeursYS, HC et DS ont conçu ce projet et conçu l'étude. GD, BW et XS ont réalisé les expériences et analysé les données. LZ et HC ont analysé les données scRNA-seq et scATAC-seq. DS et HC ont apporté un soutien méthodologique et des conseils conceptuels. YS et GD ont rédigé le manuscrit. YS, en tant que garant, assume l'entière responsabilité des travaux et/ou de la conduite de l'étude et dispose d'un droit d'accès aux données et de contrôle de la décision de diffusion.

FinancementCe travail a été soutenu par National Key Research and Development Project (2017YFC1700602), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81930117, 81872877, 82074318), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions and Mountain-Climbing Talents Project of Nanjing University (N/A), Natural Science Foundation Project of Shanghai, Scientific and Technological Innovation Action Plan (No. 22ZR1447400).

Intérêts concurrentsAucun déclaré.

Consentement du patient à la publicationN'est pas applicable.

Approbation éthiqueL'étude sur les organoïdes du cancer du côlon humain a été approuvée par le comité de recherche et d'éthique de l'hôpital affilié de l'université de médecine chinoise de Nanjing et s'est conformée à toutes les réglementations éthiques pertinentes (2020-NL-094- 02). Les participants ont donné leur consentement éclairé pour participer à l'étude avant de prendre part

Provenance et examen par les pairsNon commandé ; examiné par des pairs en externe.

Déclaration de disponibilité des donnéesToutes les données pertinentes pour l'étude sont incluses dans l'article ou téléchargées en tant qu'informations supplémentaires en ligne.

Matériel supplémentaireCe contenu a été fourni par le(s) auteur(s). Il n'a pas été approuvé par BMJ Publishing Group Limited (BMJ) et peut ne pas avoir été revu par des pairs. Toutes les opinions ou recommandations discutées sont uniquement celles des auteurs et ne sont pas approuvées par BMJ. BMJ décline toute responsabilité découlant de toute confiance accordée au contenu. Lorsque le contenu comprend du matériel traduit, BMJ ne garantit pas l'exactitude et la fiabilité des traductions (y compris, mais sans s'y limiter, les réglementations locales, les directives cliniques, la terminologie, les noms de médicaments et les dosages de médicaments), et n'est pas responsable de toute erreur et/ou ou omissions résultant de la traduction et de l'adaptation ou autrement.

Libre accèsIl s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution Non-Commercial (CC BY-NC 4.0), qui permet à d'autres de distribuer, remixer, adapter, s'appuyer sur ce travail à des fins non commerciales et concéder sous licence leurs œuvres dérivées à des conditions différentes, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée, que le crédit approprié soit donné, que toute modification apportée soit indiquée et que l'utilisation ne soit pas commerciale.

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