Le ciblage de la lactate déshydrogénase A avec la catéchine resensibilise les cellules cancéreuses gastriques SNU620/5FU au 5-fluorouracile Partie 2

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2.5. Le cotraitement CA et 5Fu induit une apoptose mitochondriale dépendante des ROS

Étant donné que l'inhibition de la LDHA augmente directement les ROS mitochondriaux et la perte de son potentiel membranaire, induisant par la suite l'apoptose [16, 29], les facteurs liés à l'apoptose médiée par les ROS mitochondriaux ont été examinés. Le traitement unique CA ou 5FU a légèrement augmenté le niveau de ROS mitochondrial dans les cellules SNU620 / 5FU lorsqu'il est mesuré par cytométrie en flux à l'aide de MitoSOX. Cependant, le cotraitement avec CA et 5FU a considérablement amélioré la production de ROS mitochondriales. Cette production accrue de ROS a été inversée par Mito-TEMPO, un antioxydant ciblé sur les mitochondries (Figure 5A-C). L'inhibition de la croissance après traitement avec CA et 5FU a également été récupérée lors du traitement Mito-TEMPO dans les cellules SNU620/5FU (Figure 5D). En outre, l'apoptose a été évaluée via la coloration à l'annexine V-FITC/PI dans des cellules SNU620/5FU. Le cotraitement avec CA et 5FU a augmenté le nombre de cellules apoptotiques parmi les cellules SNU620/5FU (Figure 6A, B). La fragmentation morphologique nucléaire apparaît au cours de l'apoptose et peut être observée par coloration au 4',6-diamidino-2-phénylindole(DAPI) [30,31]. La fragmentation de l'ADN s'est avérée avoir augmenté de manière significative dans le groupe de cotraitement, par rapport à celle du groupe témoin (figure 6C). Enfin, les biomarqueurs de l'apoptose, notamment Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 et PARP, ont été examinés. La cascade pro-apoptotique a augmenté après cotraitement avec CA et 5FU dans les cellules SNU620/5FU (figure 6D). Ces résultats suggèrent que le cotraitement avec CA et 5FU induit l'apoptose dans les cellules SNU620/5FU.

Figure 5. Le cotraitement avec la catéchine (CA) et le 5- fluorouracile (5FU) augmente la production de ROS mitochondriales : les cellules (A) SNU620/5FU ont été traitées avec les concentrations indiquées de CA, 5FU (10 μM) et Mito -TEMPO（20 μM） pendant 48 h. Le ROS mitochondrial des cellules a été mesuré par analyse FACS à l'aide de MitoSOXTM Red ; (B) le graphique à barres montre le taux de cellules positives pour la coloration MitoSOX ; (C) images de microscopie à fluorescence (X100) de cellules SNU620/5FU colorées avec MitoSOX ont été présentés ; (D) les viabilités des cellules ont été mesurées via un test MTT. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figure 6. Augmentation de l'apoptose par la catéchine (CA) et le cotraitement 5-fluorouracile (5FU) ; Les cellules SNU620/5FU ont été traitées avec CA （10 uM） et/ou 5FU （10 μM） pendant 48 h∶（A） le nombre de cellules apoptotiques a été analysé par FACSanalysis en utilisant la coloration PI-Annexin V ; (B) le graphique à barres indique le pourcentage de cellules en phase apoptotique précoce et tardive. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

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3. Débat

Dans cette étude, pour caractériser et évaluer la chimiorésistance au 5FU, nous avons utilisé des cellules SNU620/5FU, qui ont été établies par une exposition à long terme au 5FU avec une augmentation en série de la concentration du médicament [32]. Il a été rapporté que les cellules parentales SNU620 hébergeaient un mutant p53 avec une délétion homozygote dans l'exon 5 [33]. Sur la base d'une puce à ADN, plusieurs gènes impliqués dans la chimiorésistance, notamment la thymidylate synthétase, la protéine de liaison à l'ADN spécifique aux dommages 2, la clustérine et la midkine, sont élevés dans les cellules SNU620/5FU [32]. Plusieurs études antérieures ont utilisé la lignée cellulaire SNU620/5FU comme modèle pour évaluer l'efficacité in vitro de médicaments contre la résistance au 5FU par l'anti-mitose, l'activation de l'AMPK et la signalisation des récepteurs cannabinoïdes [34-36]. Cependant, les caractéristiques métaboliques et les niveaux d'expression des gènes liés au métabolisme dans les cellules SNU620/5FU et leurs rôles dans la chimiorésistance n'ont pas été largement étudiés.

Ici, nous avons démontré que les cellules SNU620/5FU ont des phénotypes glycolytiques avancés, y compris une production élevée de lactate et l'expression d'enzymes liées à la conversion du pyruvate en lactate, comme le LDHA. La phosphorylation de PDHA1, représentant l'activité PDH réduite par PDK2 et PDK3 élevées, a également augmenté dans les cellules résistantes à SNU620/5FU, par rapport à celle des cellules mères SNU620. Cependant, l'OCR n'a pas été significativement diminué dans les cellules résistantes. Une explication possible de cet écart est la plasticité nutritive des cellules cancéreuses pour le cycle du TCA, c'est-à-dire que les acides aminés ou l'acétyl-CoA dérivé des acides gras, et pas seulement l'acétyl-CoA dérivé du glucose, pourraient fournir des substrats au cycle du TCA [37 ].En corrélation avec cela, les cellules cancéreuses gastriques résistantes au 5FU favorisent la souche via l'oxydation mitochondriale des acides gras [38]. De plus, la résistance au 5FU a été liée à une augmentation de la masse et de l'activité mitochondriales, y compris l'expression des enzymes de la chaîne de transport d'électrons (ETC) et la consommation d'oxygène [39,40]. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur la modulation de LDHA pour resensibiliser la résistance au 5FU. Sur la base de nos résultats, l'inhibition de l'activité LDHA avec l'oxamate ou le CA a réussi à supprimer la croissance des cellules SNU620/5FU résistantes et à les resensibiliser au traitement 5FU. Ces résultats ont montré une bonne corrélation avec ceux d'études précédentes, qui ont rapporté que l'inhibition génétique ou pharmacologique du LDHA a réussi à réduire la résistance à la chimiothérapie, y compris le 5FU [19, 41, 42]. Ainsi, nous avons supposé que l'inhibition de LDHA pourrait être suffisante pour supprimer la résistance contre 5FU dans les cellules SNU620/5FU.

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Plusieurs molécules synthétiques, telles que l'oxamate, le FX11, le PSTMB et le GNE -140 ont été établies en tant qu'inhibiteurs de la LDHA à petites molécules [11,43]. Parmi ceux-ci, le FX11 a été rapporté comme sensibilisant à la chimiothérapie dans les cellules tumorales résistantes [44]. Cependant, bien que de nombreux inhibiteurs de LDHA soient sous examen pour être approuvés en tant que nouveaux médicaments anticancéreux, aucun d'entre eux n'a encore été approuvé. Ainsi, davantage de candidats médicamenteux sont nécessaires pour générer de nouveaux inhibiteurs de LDHA [45]. Les composés naturels ont été considérés comme des ressources potentielles pour les médicaments anticancéreux, en particulier pour surmonter la chimiorésistance en tant que thérapie combinée [46,47]. Par conséquent, cibler le métabolisme du cancer, en particulier le métabolisme du glucose avec des produits naturels dérivés de plantes, est une tendance de recherche émergente pour le développement de nouvelles thérapies contre le cancer [48].

De plus, plusieurs rapports ont suggéré que les produits naturels, tels que le gossypol, la galloflavine, la crocétine, la machine A et l'EGCG, sont de puissants inhibiteurs de LDHA [43, 49, 50]. Bien que parmi ceux-ci, le gossypol ait l'action inhibitrice la plus puissante sur le LDHA (IC50=9.8 uM), il inhibe également l'activité du LDHB, qui convertit le lactate en pyruvate [51]. Nos résultats ont démontré que l'EGCG, un inhibiteur établi de la LDHA et un sensibilisant à la chimiothérapie 5FU [22-25], exerce des effets inhibiteurs sur les activités de la LDHA et de la LDHB. Parmi les inhibiteurs de LDHA dérivés de produits naturels présentant des activités inhibitrices spécifiques de LDHA, tels que la machine A(IC50 =84 μM）, la crocétine （IC50 =54.9 μM） et CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA a montré le meilleur effet suppresseur sur l'activité LDHA par rapport à la valeur ICsn Bien que les structures chimiques de CA et EGCG soient très similaires à l'exception de la fraction supplémentaire d'acide gallique, leurs sélectivités inhibitrices étaient De plus, bien que l'AC soit le composé le plus simple, comparé à ses dérivés, il a montré la meilleure action inhibitrice à la fois sur la production de lactate et sur l'activité LDHA. Ainsi, une étude approfondie de la relation structure-activité devrait être menée pour démontrer que l'AC est un nouveau squelette potentiel pour le développement d'inhibiteurs spécifiques et puissants de la LDHA.

L'EGCG est connu comme un inhibiteur compétitif du NADPH. De plus, l'EGCG inhibe la translocation et la reproduction de la NADPH oxydase [52-54]. Cependant, selon les résultats de la modélisation moléculaire, CA et EGCG sont structurellement situés à des endroits différents (Figure 3A, B). De plus, ils n'ont pas montré la corrélation dans la spécificité de l'inhibition de l'activité LDHA et LDHB, qui utilisent le NADH et NAD plus comme cofacteur, respectivement. À partir de ces données, nous avons supposé que l'AC n'avait pas de corrélation directe avec l'EGCG dans le mécanisme de compétition avec le NAD(P)H. Soit dit en passant, l'inhibition de LDHA par plusieurs inhibiteurs, tels que FX11, GSK 2837808A, NCI-737 et NCI-006, a réduit la production de NADt et augmenté l'accumulation de NADH, diminuant ainsi le rapport NAD plus /NADH[16,17,55]. L'apoptose induite par la voie des dommages à l'ADN dépendant de p53/NAD est également augmentée par l'inhibition de la LDHA à l'aide d'ARNsi ou d'un inhibiteur chimique, NH-2 [56]. La voie de signalisation GCN2-ATF4 a également été rapportée comme un autre mécanisme responsable de la mort cellulaire apoptotique induite par l'inhibiteur de LDHA, GSK 2837808A [17]. Étant donné que le rapport NAD/NADH joue un rôle clé dans l'homéostasie redox et la prolifération cellulaire [5758], le CA en tant qu'inhibiteur de LDHA pourrait affecter les cellules cancéreuses résistantes au 5FU en modulant le rapport NAD plus/NADH.

L'AC a induit la mort cellulaire dans les cellules parentales SNU620 et SNU620/5FU résistantes au 5FU. Cependant, la mort cellulaire induite par l'AC était dépendante du LDHA par l'épuisement du shRNA dans les cellules SNU620/5FU. De plus, le cotraitement de CA et de 5FU a montré des effets anticancéreux supplémentaires sur les cellules résistantes au 5FU. Comme indiqué précédemment [16, 59], l'inhibition de LDHA augmente les ROS et par conséquent supprime la croissance des cellules cancéreuses. Lorsque le LDHA était inhibé, le métabolisme énergétique était converti de la glycolyse au cycle du TCA et à la phosphorylation oxydative mitochondriale [60]. Ainsi, les cellules cancéreuses produisent plus de ROS, entraînant des dommages à la membrane mitochondriale et à l'apoptose induite par les mitochondries [61, 62]. En bon accord avec les études précédentes, l'AC induit la mort cellulaire apoptotique via une voie mitochondriale dépendante des ROS. L'augmentation de la capacité de défense des ROS et la réduction des signaux apoptotiques sont des propriétés communes des cellules cancéreuses chimiorésistantes, en particulier dans les cellules résistantes au 5FU 3,63]. De plus, des altérations du métabolisme du cancer, en particulier du métabolisme du glucose, conduisent également à une résistance à la chimiothérapie par l'altération des activités cellulaires, telles que la réparation aberrante de l'ADN, l'autophagie améliorée, l'apoptose réduite, la défense contre les ROS et la sécrétion accrue d'exosomes [9,64,651 . Ainsi, le ciblage des enzymes glycolytiques, y compris le LDHA, avec l'AC pourrait être une stratégie alternative pour surmonter la chimiorésistance, en particulier dans le cancer gastrique résistant au 5FU. Généralement, les tumeurs malignes à division rapide sont très sensibles aux inhibiteurs de la synthèse de l'ADN, y compris le 5FU, par rapport aux tissus normaux. Cependant, certaines cellules cancéreuses peuvent développer une résistance au traitement par plusieurs mécanismes, comme décrit précédemment [34-36]. Le co-traitement de composés bioactifs et de chimiothérapie conventionnelle a un effet plus important, par rapport à un seul composé, sur le ralentissement du développement de la résistance |66. Par conséquent, les effets biologiques de composés phytochimiques spécifiques avec des effets cytotoxiques prouvés administrés avec une chimiothérapie conventionnelle pour cibler un plus large éventail de voies de signalisation dans les cellules cancéreuses, y compris le métabolisme du cancer et les fonctions mitochondriales, devraient être supérieurs aux composés uniques dans la gestion du cancer car ils peuvent retarder le développement de la résistance [67]. Dans cette étude, la combinaison de CA et de 5FU a montré une inhibition plus élevée sur la viabilité cellulaire, par rapport à celle d'un traitement unique. De plus, nous avons démontré que l'inhibition de l'activité LDHA et l'apoptose subséquente mitochondriale médiée par les ROS pourraient être le mécanisme sous-jacent à l'effet sensibilisant de l'AC sur les cellules résistantes au 5FU (Figure 7).

En plus de la puissance et de la spécificité de l'inhibition de la LDHA, l'AC est plus sûre que les inhibiteurs de la LDH dérivés de produits naturels précédemment établis. De plus, l'AC est un ingrédient chimique bien connu du thé vert, et sa sécurité et ses propriétés pharmacodynamiques ont été confirmées dans des études antérieures [68-70]. Cependant, une évaluation précise de la toxicité de la co-administration de CA et de 5FU n'a pas encore été réalisée. De plus, l'efficacité in vivo de l'AC dans les cellules cancéreuses résistantes au 5FU n'a pas été examinée dans cette étude. Cependant, des études antérieures rapportent l'efficacité anticancéreuse in vivo de l'AC et de ses dérivés pour surmonter la chimiorésistance, y compris la résistance au 5FU dans le cancer gastrique et du côlon humain [71-77]. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l'inhibition de la LDHA en tant que mécanisme moléculaire majeur de l'AC pour surmonter la résistance au 5FU. Par conséquent, pour développer l'AC en tant que nouvel adjuvant pour les cellules cancéreuses chimiorésistantes, l'efficacité et l'innocuité in vivo du cotraitement de l'AC et du 5FU doivent être évaluées au moyen d'études approfondies sur les animaux, y compris des modèles de xénogreffe et de bonnes évaluations de la toxicité en laboratoire.

4. Matériels et méthodes

4.1.Matériaux

Les anticorps dirigés contre la poly(ADP-ribose)polymérase, la caspase-3 et la caspase-9 ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, États-Unis). Les anticorps anti-LDHA, glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et PDHA1 ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis), et ceux contre le phosphore-PDHA1 et PDK3 ont été achetés auprès d'Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, États-Unis). De plus, les anticorps contre PDK2 et PDK4 ont été achetés chez Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), ceux contre PDK1 ont été obtenus chez Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), et ceux contre les cellules B Le lymphome -2(Bcl-2) et la protéine X associée à Bcl-2- ont été achetés auprès de Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, États-Unis). MitoSOX a été acheté chez Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Produits chimiques et réactifs, y compris 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT),4',{{22} }diamidino-2-phénylindole, oxamate, nicotinamide adénine dinucléotide, CA et dérivés de CA (EC GC, EGC et EGCG) ont été achetés chez Merck (Merck, Darmstadt, Allemagne). - Le nicotinamide adénine dinucléotide (forme oxydée) a été acheté auprès de Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japon).

4.2.Culture cellulaire

Cancer gastrique humain SNU620, SNU620/5FU et AGS, cancer du pancréas Panic-1 et MIA PaCa-2, et cancer du côlon Les cellules LS174T et RKO ont été obtenues auprès de la Korean Cell Line Bank (KCLB, Séoul, Corée ).Les cellules SNU620, SNU620/5FU, AGS et LS174T ont été cultivées dans le milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)(Welgene, Daegu, Corée), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS )(Gibco, New York, NY, USA) et 1 % de pénicilline/streptomycine (Invitrogen), et les cellules Panc-1, MIA PaCa-2 et RKO ont été cultivées dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (Welgene ) contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline/streptomycine. Toutes les cellules ont été cultivées dans un CO humidifié, un incubateur à 37 degrés et 5 % de CO2.

4.3. Test de viabilité cellulaire

Les niveaux de cytotoxicité de CA et de 5FU dans les cellules SNU620 et SNU620/5FU ont été mesurés à l'aide d'un test MTT. Les cellules ont été cultivées dans des plaques 24-puits (2 × 104 cellules/puits) avec les concentrations indiquées de CA et de 5FU pour le jour indiqué. Une solution de MTT (2,0 mg/mL) a ensuite été ajoutée à chaque puits, suivie de 3-4 h d'incubation à 37 degrés et 5 % de CO, dans un incubateur de culture cellulaire. Le milieu de culture a ensuite été retiré et l'absorbance des cristaux de formazan a été réalisée à partir de cellules vivantes. Du DMSO a été ajouté pour dissoudre les cristaux de formazan, et il a été mesuré à 540 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques Spectramax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.4. Taux d'acidification extracellulaire (ECAR) et taux de consommation d'oxygène (OCR)

ECAR et OCR, indiquant les taux cellulaires de glycolyse et de phosphorylation oxydative, respectivement, ont été surveillés avec l'analyseur Seahorse XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), comme décrit précédemment [78,79]. En bref, 60,000 cellules SNU620 ou SNU620/5FU par puits ont été ensemencées dans des plaques à six puits Seahorse XF dans un milieu RPMI additionné de 1 % de pénicilline/streptomycine. Après une incubation de 30 min, le milieu de chaque puits a été remplacé par 80 ul de milieu sans sérum préchauffé avec de l'oxamate 5 mM, un inhibiteur standard de la LDH [11]. Les cellules ont ensuite été incubées à 37°C pendant 24h. Après incubation, le milieu de chaque puits a été remplacé par 180 μL de milieu XFbase préchauffé (contenant du glucose 10 mM, de la glutamine 2 mM et du pyruvate de sodium 1 mM; pH 7, 4) pour mesurer ECAR et OCR. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5.Quantification Reverse transcription-polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

L'ARN total a été extrait à l'aide du kit d'extraction d'ARN total RiboEx (GeneAll Biotechnology, Séoul, Corée) et l'ADNc a été synthétisé à l'aide d'un kit de transcriptase inverse (Promega, Madison, WI, États-Unis). Dans la transcription inverse, 1 ug d'ARN total a été utilisé. , et la quantité totale d'ADNc synthétisée est de 20 μL. Chaque kit a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. La PCR quantitative a été réalisée à l'aide d'un système de PCR en temps réel StepOneTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), avec le Real HelixgPCR Kit (NanoHelix, Daejeon, Corée), pour 40 cycles consistant en 15 s à 95 degrés C et 1 min à 60 degrés Les niveaux relatifs d'ARNm ont été normalisés aux niveaux d'ARN ribosomal 18S, qui a servi de contrôle endogène Séquences des amorces utilisés pour qRT-PCR sont répertoriés dans le tableau 1.

4.6.Analyse par Western blot

Les cellules ont été lavées avec du PBS 1 × et les protéines totales ont été extraites des cellules à l'aide d'un tampon RIPA et d'un tampon de lyse à 1% NP -40 contenant des comprimés de cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche, Bâle, Suisse). Chaque concentration de protéines a été mesurée à l'aide du test de protéines Bio-Rad. Des quantités égales de protéines ont été fractionnées à partir de chaque échantillon par 8-15 % SDS-PAGE, puis les protéines ont été transférées sur des membranes de nitrocellulose (GE Healthcare, Munich, Allemagne) par électrophorèse. Les membranes ont été bloquées à température ambiante (20-25 degré) pendant 1 h avec du lait en poudre écrémé à 5 % et incubées avec des anticorps primaires à 4 degrés pendant la nuit. Ensuite, ces membranes ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au Tris 1X pendant 10 min. Des bandes spécifiques de protéines ont été mesurées avec un système d'imagerie par chimioluminescence (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). L'expression des protéines a été ajustée par GAPDH. 4.7.Test de production de lactate

La production de lactate a été mesurée dans les milieux de culture des cellules SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T et RKO. Ces cellules ont été incubées pendant 1 jour à 37 degrés, et les milieux de culture ont ensuite été remplacés par un milieu sans rouge de phénol, suivi d'une incubation pendant 1 h à 37 degrés. Le milieu de chaque cellule a ensuite été évalué à l'aide d'un kit commercial de dosage fluorométrique du lactate (BioVision, Milpitas, CA, USA).

4.8. Dosages d'activité LDHA et LDHB

Pour détecter l'activité LDHA, les concentrations indiquées de CA ont été incubées pendant 2 0 min dans un tampon contenant 2 mM de pyruvate, 20 μM de NADH et 20 mM de HEPES-K plus （pH7,2）. Pour l'activité LDHB, un tampon contenant du Tris-HCl 1 M (pH 8,0), du NAD plus 25 mM et du L-lactate de sodium 2 M a été utilisé. En bref, 10 nanogrammes de chacune des protéines LDHA et LDHB recombinantes purifiées ont été utilisés pour les tests d'activité LDHA et LDHB in vitro. Un microgramme de protéine totale provenant de lysats cellulaires a été utilisé pour les dosages intracellulaires de l'activité LDHA et LDHB comme source d'enzyme. La fluorescence du NADH à une longueur d'onde d'excitation de 340 nm et une longueur d'onde d'émission de 460 nm a été détectée à l'aide d'un spectrofluorimètre (Spectramax M2 ; Molecular Devices), comme décrit précédemment [80]. L'activité LDHA a été mesurée par la diminution de la quantité de NADH, tandis que l'activité LDHIB a été évaluée en mesurant la quantité de NADH convertie à partir de NAD plus.

4.9.Interaction protéine-petite molécule

L'interaction entre les protéines et les petites molécules a été prédite à l'aide du programme Pyrex. Les molécules LDHA (PDB ID:1l10) et les structures 2D de CA et EGCG obtenues à partir de la base de données de composés NCBI PubChem ont été utilisées dans Pyrex. L'ID de CA était de 9064 et celui de l'EGCG était de 65064. La distribution relative de la charge de surface a été montrée avec la région acide en rouge, la région basique en bleu et la région neutre en blanc. Les liaisons hydrogène dans les complexes LDHA avec CA ou EGCG, respectivement, ont été représentées par des lignes pointillées noires. Les séquences ont été obtenues auprès d'UniProt (https://www.uniprot.org, consulté le 9 novembre 2020) avec les numéros d'accession P00338 (LDHA).

4.10.Transfection d'ARN en épingle à cheveux courts (shRNA)

Le vecteur factice pLKO.1 et le vecteur LDHA ciblant le shRNA ont été utilisés, comme décrit précédemment [50]. Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à six puits (2 × 10 degrés cellules/puits) et incubées pendant une nuit. Les cellules SNU620 / 5FU ont été transfectées à l'aide de polyéthylèneimine (PED) (Polyplus-transfection, Ilkirch, France), le gène et le rapport PEI est de 1: 3. Ensuite, les cellules transfectées ont été traitées avec 1 ug/mL de puromycine pendant 1 semaine. La lignée cellulaire témoin a été générée après infection avec un plasmide brouillé.

4.11.Surexpression de LDHA

Le plasmide pDEST27-LDHA a été construit par sous-clonage de l'ADNc de LDHA (acheté auprès de Korea Human Gene Bank, Daejeon, Corée) dans des vecteurs pDEST27 (Invitrogen). Deux séries de sous-clonages pour LDHA ont été réalisées. Pour la reconstruction de la LDHA, les cellules SNU620/5FU-shLDHA ont été transfectées avec pDEST27-LDHA et le plasmide pDEST27 vide. En bref, les cellules ont été cultivées jusqu'à 70 % de confluence. Ensuite, les cellules ont été traitées avec un mélange comprenant 3 µg d'ADN et de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pendant 48 h. Après incubation, les cellules ont été sélectionnées avec 200 ug/mL de G418 pendant 1 semaine. Ensuite, pour confirmer l'efficacité de la transfection, nous avons effectué le test Western blot.

4.12.Analyse de l'apoptose

Les cellules apoptotiques ont été détectées à l'aide du kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à six puits (cellules à 2 × 10 degrés / puits) et traitées avec les concentrations indiquées de CA et de 5FU pendant 2 jours. Après 2 jours de traitements, la cellule a été lavée avec du PBS 1X. Les cellules ont été mises en suspension dans 500 μL de tampon de liaison et traitées avec 5 μL d'annexine V-FITC et 5 μL d'iodure de propidium （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）, suivi d'une incubation de 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Les intensités de fluorescence ont été examinées à l'aide d'un BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Essai de détection des espèces réactives de l'oxygène mitochondrial (ROS)

La production de ROS mitochondriale a été détectée à l'aide d'un indicateur de superoxyde mitochondrial rouge MitoSOX (Thermo Fisher Scientific). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à six puits （2 cellules de 10 degrés/puits） et Mito-TEMPO（20 μM ; Sigma-Aldrich） a été prétraité pendant 1 h avant le traitement médicamenteux. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate 1 × (PBS), après quoi 5 μM de MitoSOX ont été ajoutés. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 10 min à 37 degrés. L'intensité de la fluorescence a été analysée à l'aide d'un BD FACS CANTO II (BD Biosciences). L'image de fluorescence a été détectée au microscope à fluorescence (grossissement, 100 ×) (microscope Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne).

4.14.DAPI Coloration du noyau

SNU620/5FU a été ensemencé dans une plaque 24-puits (5 × 104 cellules/puits) et traité avec les concentrations indiquées de CA et de 5FU pendant 48 h. Après lavage avec du PBS 1 ×, les cellules ont été remises en suspension dans 1- ml de PBS 1 ×. Les cellules ont ensuite été colorées avec 4 ug/mL de DAPI pendant 30 min à température ambiante et examinées au microscope à fluorescence (grossissement, 200 ×) (Carl Zeiss).

4.15. Analyses statistiques

Les résultats de la viabilité cellulaire, de la production de lactate, d'ECAR, d'OCR, de qRT-PCR, de LDHA, d'activités LDHB, d'apoptose et de ROS mitochondrial ont été indiqués par rapport aux valeurs témoins et exprimés en moyenne ± erreur standard de la moyenne de trois expériences indépendantes. Les différences au-dessus de la valeur moyenne de chaque groupe ont été analysées par le test t de Student, tandis que les différences entre les groupes ont été analysées par une analyse de variance unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey à l'aide de GraphPad Prism (Version5.0, GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis).

5. Conclusions

Prises ensemble, les cellules résistantes du cancer gastrique SNU620/5FU ont des phénotypes glycolytiques, y compris une production élevée de lactate et une expression plus élevée de LDHA que celles des cellules parentales SNU620. La restriction de la glycolyse avec CA, en tant qu'inhibiteur spécifique de LDHA, sensibilise les cellules SNU620/5FU au 5FU. De plus, le cotraitement avec CA et 5FU a augmenté les ROS mitochondriaux et la mort cellulaire apoptotique dans les cellules résistantes au 5FU. Nos résultats suggèrent que l'AC pourrait être un candidat prometteur pour le développement d'un médicament adjuvant qui réduit la résistance à la chimiothérapie à base de 5FU en limitant l'activité LDHA.

Documents supplémentaires : Les éléments suivants sont disponibles en ligne à l'adresse https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22105406/s1, Figure S1 : Effet de 5FU sur la viabilité des clls SNU620/5FU, Figure S2 : La croissance de SNU620 et cellules SNU620/5FU mesurées par comptage cellulaire, Figure S3 : Niveaux de production de lactate des cellules SNU620 et SNU620/5FU, Figure S4 : Expressions des isotypes PDK dans les cellules SNU620 et SNU620/5FU, Figure S5 : Effet de l'oxamate sur la viabilité de SNU620 et Cellules SNU620/5FU, Figure S6 : Effets de l'EGCG sur les activités LDHA et LDHB, Figure S7 : Effets de la catéchine (CA) sur les niveaux d'expression des protéines p-PDHA1, PDHA1 et PDK, Figure S8 : Analyse calorimétrique par titrage isotherme (ITC) de la LDHA et de la CA, Figure S9 : Expression de la LDHA dans les cellules SNU620/5FU transfectées avec shLDHA, Figure S10 : Mesure des phénotypes glycolytiques et de la viabilité cellulaire dans diverses cellules cancéreuses, Figure S11 : Les données brutes du test Western blot.

Cet article est extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms