La cause de la polykystose rénale

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La surexpression de PKD1 provoque la polykystose rénale

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Côté et Marie Trude

Les mécanismes pathogéniques sous-jacentsautosomique dominantpolykystose rénale(PKRAD) restent à élucider. Bien qu'il existe des preuves que Pkd1(polykystose rénale 1)l'haploinsuffisance génique et la perte d'hétérozygotie peuvent provoquer la formation de kystes chez la souris, paradoxalement des niveaux élevés de Pkd1(polykystose rénale 1) expression ont été détectées dans les reins de la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale) les patients. Pour déterminer si Pkd1(polykystose rénale 1)le gain de fonction peut être un processus pathogénique, un chromosome artificiel bactérien Pkd1 (Pkd1-BAC) a été modifié par recombinaison homologue pour cibler uniquement une expression soutenue de Pkd1 préférentiellement au rein adulte, Plusieurs lignées transgéniques ont été générées qui surexpriment spécifiquement le Le transgène Pkdl dans les reins 2- pour 15- se replier sur les niveaux endogènes de Pkd1. Toutes les souris transgéniques ont développé de manière reproductible des coûts tubulaires et glomérulaires et une insuffisance rénale et sont mortes d'insuffisance rénale. Ce modèle démontre que la surexpression de Pkd1 de type sauvage est suffisante pour déclencher une cystogenèse ressemblant à l'ADPKD humaine (autosomique dominantpolykystose rénale). Nos résultats ont également révélé une augmentation frappante de l'expression rénale de c-myc chez les souris de toutes les lignées transgéniques, indiquant que c-myc est un effecteur critique in vivo en aval de Pkd1.(polykystose rénale 1)Dathwavs moléculaires, Cette étude a non seulement produit un précieux et premier PKD(polykystose rénale)modèle pour évaluer la pathogenèse moléculaire et les thérapies, mais fournit également des preuves que le gain de fonction pourrait être un mécanisme pathogénique dans la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale).

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Autosomique dominantpolykystose rénale(ADPKD) est l'une des maladies génétiques les plus fréquentes chez l'homme. Elle se caractérise par le développement progressif de multiples kystes rénaux affectant tous les segments du néphron. D'autres manifestations comprennent la formation de kystes dans le foie et le pancréas ainsi que des anévrismes intracrâniens et des malformations cardiovasculaires. ADPKD (autosomique dominantpolykystose rénale)conduit généralement à une insuffisance rénale avec progression vers une insuffisance rénale terminale à la fin de l'âge mûr.

Environ 85 % de la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)les cas sont associés à des mutations dans le PKD1(polykystose rénale 1)gène. Ce PKD1(polykystose rénale 1)Le gène est grand, s'étend sur 54 kb et se compose de 46 exons. Il génère un transcrit de 14.2-kb et code pour une 4., une 302-protéine d'acides aminés appelée polycystine-1(4, 9-11). L'expression humaine de la PKD1 et de la polycystine-1 a été analysée dans la PKD normale et la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)reins. Au cours du développement rénal, la polycystine -1 est facilement détectée dans les cellules épithéliales glomérulaires et tubulaires (examinées dans la référence 37 et les références qui y sont contenues). Chez les adultes normaux, nous et d'autres avons montré que PKD1(polykystose rénale 1)L'ARN et les protéines sont exprimés à des niveaux modérés à faibles dans les tubules collecteurs et distaux, alors que les niveaux ont augmenté (~2- fois) dans la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)reins (22, 39). Fait intéressant, l'expression persistante ou accrue de la polycystine -1 est détectée dans la majorité des kystes épithéliaux rénaux, bien que la coloration soit absente dans une minorité significative de kystes (29). En plus des reins, PKD1(polykystose rénale 1)l'expression est normalement répandue dans d'autres tissus adultes, y compris les types de cellules épithéliales et non épithéliales (6, 14, 18, 29, 30, 39).

Plus de 200 PKD1 différents(polykystose rénale 1)Des mutations ont été décrites, dont la plupart sont des mutations par délétion-insertion, décalage de cadre ou non-sens. Celles-ci devraient entraîner des formes tronquées de la protéine, compatibles avec l'inactivation d'un allèle.

Cependant, une proportion importante est constituée de mutations faux-sens ou dans le cadre qui se retrouvent dans tout le gène et sont souvent uniques à une famille particulière (33, 34). Comme son nom l'indique, ADPKD (autosomique dominantpolykystose rénale)est dominant et le PKD1 muté transmis(polykystose rénale 1)l'allèle est suffisant pour produire la maladie. Cependant, la nature focale des kystes rénaux dans la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)suggère que le mécanisme mutationnel de PKD1(polykystose rénale 1)pourrait être un double coup ou une perte d'hétérozygotie. La prise en charge de ce mécanisme a été obtenue par la détection de PKD1(polykystose rénale 1)mutations somatiques clonales dans les cellules d'une proportion importante de kystes(3, 21, 32). Un mécanisme de perte d'hétérozygotie pourrait expliquer le phénotype très variable couramment observé dans les familles individuelles.

Etudes sur la souris Pkd1(polykystose rénale 1)peut fournir des informations précieuses sur la ou les fonctions de PKD1 en raison de l'étroite similitude entre le gène humain et murin et le produit génique. Dans le développement normal, la Pkd1 murine est exprimée à des niveaux élevés dès le stade morula et est détectée dans tous les dérivés des cellules de la crête neurale. y compris le cerveau adulte, l'arc aortique, le cartilage et la condensation mésenchymateuse (16, 17). Il a été rapporté que des souris mutantes homozygotes ciblées pour la suppression de Pkd1 meurent in utero et développent des kystes rénaux et pancréatiques(2,19,24-26, 40). Ces tentatives précédentes pour générer des modèles de souris n'ont malheureusement pas fourni d'animaux viables après la naissance. Néanmoins, la survenue de kystes rénaux chez ces souris mutantes Pkd1 homozygotes serait cohérente avec l'hypothèse d'un mécanisme mutationnel à deux coups chez l'homme impliquant une mutation germinale et une inactivation somatique de l'allèle normal. Cependant, les souris hétérozygotes pour la délétion ciblée de Pkd1 présentaient également une PKD avec des kystes hépatiques et pancréatiques occasionnels malgré une apparition tardive à l'âge adulte, soutenant un mécanisme d'haploinsuffisance ou de réduction de la dose de gène. De plus, la perte d'hétérozygotie ou d'haploinsuffisance peut ne pas être le seul mécanisme de la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)pathogénèse. En effet, ces mécanismes sont en contradiction avec l'expression persistante ou renforcée de PKD1(polykystose rénale 1)observé dans la majorité des kystes rénaux humains à moins que des protéines non fonctionnelles ne soient produites. Cette découverte d'une expression soutenue ou accrue de PKD1 soulève la question de savoir si un gain de fonction ou une surexpression peut être opérant. Pour étudier le mécanisme pathogénique de gain de fonction de Pkd1, nous avons isolé et caractérisé un chromosome artificiel bactérien Pkd1 murin (Pkd1-BAC) qui a ensuite été modifié par recombinaison homologue chez Escherichia coli pour cibler l'expression de Pkd1(polykystose rénale 1)spécifiquement aux reins. Nous rapportons la production de trois lignées transgéniques qui expriment le transgène Pkd1 à différents niveaux. Toutes les souris présentaient de manière reproductible un certain nombre de similitudes avec la PKRAD humaine et développaient systématiquement un début précoce avec une progression rapide des altérations morphologiques et fonctionnelles rénales et mouraient d'insuffisance rénale à l'âge moyen. En outre, la présente étude décrit un mécanisme in vivo par lequel Pkd1 peut médier ce phénotype PKD. Ces souris représentent le premier modèle de PKD produit par la seule surexpression rénale de la PKD1 orthologue(polykystose rénale 1)gène.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Isolement des clones BAC contenant le Pkd1(polykystose rénale 1)lieu. Des clones Pkd1-BAC de la souche bactérienne hôte E. coli DH10B (RecA ; RecBC) ont été isolés à partir d'une bibliothèque pBelo11BAC de souris 129Sv (Research Genetics). Le criblage des super pools de BAC a été effectué par PCR avec les amorces suivantes : 5 régions, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (exon Pkd1 avant 1) et 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (inverse Pkd1 exon 1); et 3 régions, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (exon Pkd1 avant 39) et 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (exon Pkd1 inverse 40). Un clone positif pour les deux amplifications a été identifié et analysé sur gel standard et électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE) suivie d'un transfert de Southern. Pour l'analyse par Southern blot, sept sondes Pkd1 de souris ont été conçues : exon génomique 1 (516 pb ; nucléotides [nt] 1 à 516 ; numéro d'accès NCBI U70209), exon génomique 2-3 (220 pb), exon génomique {{ 31}} (8 479 pb), exon d'ADNc 15-20 (1 724 pb ; nt 6455 à 8179), exon d'ADNc 25-34 (1 315 pb ; nt 9415 à 10730), exon d'ADNc 36-45 ( 1 655 bp ; nt 10963 à 12618) et l'exon génomique 45-46 (1 640 bp) (16). Plusieurs régions, y compris les extrémités de l'insert BAC de ce Pkd 1- BAC murin, ont également été séquencées et ont été confirmées comme étant orthologues au gène PKD1 humain et aux régions contiguës.

RÉSULTATS

Production de SBPkdl(polykystose rénale 1) rAc-BAC par recombinaison homologue. Pour déterminer si le gain de fonction Pkd1 seul est suffisant pour produire l'ADPKD (autosomique dominantpolykystose rénale)phénotype, nous avons d'abord isolé un clone génomique contenant l'intégralité du gène Pkdl dans une banque de vecteurs BAC 129/Sv. Cette bibliothèque a été criblée par PCR avec deux ensembles d'amorces pour le gène Pkd1 qui couvraient l'exon 1 à l'extrémité 5' et les exons 39 à 40 vers l'extrémité 3' (Fig.1). Un clone BAC positif pour le gène Pkd1 a été identifié qui comprenait tout le corps du gène Tsc2 adjacent. L'insert Pkd1 a été caractérisé en détail pour s'assurer que la structure génomique correspondait à celle de la Pkd1 endogène(polykystose rénale 1)gène de la souche de souris 129/Sv dont est issu l'insert et de la souche consanguine C57BL/6J. Les cartes génomiques du locus Pkd1 dans le BAC et dans ces souches consanguines par analyse Southern blot, avec quatre digestions par enzymes de restriction et sept sondes couvrant l'ensemble du gène Pkdl, semblaient identiques sans aucun signe de réarrangement (Fig. 1). Ce BAC contenait un insert de ~121- ko comprenant-37 ko d'amont et-39 ko d'une séquence en aval du Pkd1(polykystose rénale 1)gène tel que déterminé par électrophorèse et séquençage.

Ce clone Pkd1-BAC a été modifié par deux événements successifs de recombinaison homologue chez E. coli. Le Pkd1(polykystose rénale 1)Le gène a été marqué dans l'exon 10 en substituant un nucléotide (G à A) pour créer un nouveau site EcoRI à la position 2355 sur la carte d'ADNc. Cette mutation ponctuelle silencieuse a été produite pour distinguer le Pkd1(polykystose rénale 1)gène et transcrit du BAC de celui d'origine endogène. De plus, nous avons remplacé les éléments régulateurs en 5' du gène Pkd1-BAC en tirant parti des éléments spécifiques de l'épithélium rénal "SB" précédemment identifiés à partir du SBM (lié à c-Myc) ou du SBF lié à c- fos)construct-trans-gene pour restreindre l'expression dans les reins (36, 38) (Fig. 2a).

Ce nouveau SBPkd1TAc-BAC a été digéré avec Notl, un site unique situé immédiatement en amont des éléments SB, et Clal dans le corps du gène Tsc2, tronquant les éléments régulateurs Tsc2 et la moitié 5' du corps du gène pour garantir l'absence d'expression exogène de Tsc2 dans tous les tissus et pour éliminer les séquences procaryotes BACvector (Fig.1 et 2). Ce fragment linéarisé Notl-Clal de 70-kb a été isolé, purifié et quantifié pour la microinjection d'ovocytes (36).

Production et analyse de souris transgéniques SBPkd1rAc. Quatre fondateurs transgéniques porteurs de plusieurs copies du transgène SBPkd1rAc ont constamment développé la PKD(polykystose rénale). À partir des quatre souris fondatrices SBPkdlrAc déterminées par analyse Southern, trois lignées transgéniques SBPkd1rAG ont été établies avec deux à neuf copies du transgène (Fig. 2b). La caractérisation de l'intégrité du transgène dans ces lignées a été surveillée avec des sondes 5 ', internes et 3', comme le montrent les exemples représentatifs de la figure 2b. Les lignées transgéniques ont révélé avec la sonde 5'"SB" une bande à 10,9 kb compatible avec l'intégration du transgène SBPkd1rAc dans une orientation tête-bêche et ont révélé avec la sonde 3' une bande de 7,1-kb (Fig. 2b). De plus, la sonde interne a détecté la bande Pkd1 endogène de 9.4-kb ainsi que les bandes de 6.9-kb et 2.5-kb du transgène en raison du site d'insertion EcoRI dans l'exon 10 (Fig. 2b). Ces souris contenaient des copies complètes du transgène sur la base de l'analyse de la structure de chevauchement génomique.

Pkd1(polykystose rénale 1)gain de fonction chez des souris transgéniques SBPkdlrAc adultes. L'expression du transgène SBPkdlrAG et du gène Pkd1 a été étudiée dans divers organes. La quantification des niveaux de transcrit du transgène et/ou du gène endogène a été réalisée par analyse Northern blot (Fig.3a). Comme prévu, les transcrits du transgène et du gène endogène étaient de longueur similaire (14,2 kb). Sur la base de l'expression de contrôle de GAPDH, les reins de toutes les lignées de souris SBPkd1TAG présentaient une expression de transcrit systématiquement accrue par rapport aux niveaux normaux de Pkdl dans les reins adultes (n=3) d'âge similaire. Le transgène rénal et l'expression endogène pour les différentes lignées transgéniques affichaient une plage de 2- à 15- fois au-dessus des niveaux de contrôle de Pkd1 endogène rénal (Fig.3a). En particulier, la lignée transgénique 39 (n {{11} }) a montré un Pkd1 plus élevé(polykystose rénale 1)niveaux que les lignes 3(n=3) et 41 (n =4). De plus, les niveaux d'expression de Pkd1 mesurés par analyse Northern blot étaient corrélés à ceux obtenus par PCR en temps réel en utilisant des amorces dans les exons 1 et 2 (Fig. 3b).

La quantification des niveaux d'expression des transgènes spécifiquement a été réalisée par PCR en temps réel et RT-PCR semi-quantitative dans les trois lignées transgéniques à l'âge adulte en utilisant des amorces dans la région 5' non traduite (promoteur B, -globine) et dans l'exon 2 de Pkd1(polykystose rénale 1)(Fig.3b). L'expression de SBPkdlrAc chez les souris transgéniques a été comparée au produit du gène de la protéine ribosomale S16 comme étalon interne. Les conditions utilisées pour l'amplification semi-quantitative par RT-PCR étaient dans la plage linéaire. L'expression du transgène par PCR en temps réel et RT-PCR semi-quantitative a montré de manière cohérente et spécifique l'expression la plus élevée dans le rein de toutes les lignées transgéniques par rapport aux autres organes (Fig. 3b et c). Les niveaux d'expression rénale pour un échantillon individuel étaient reproductibles avec n'importe laquelle des techniques de détection utilisées. Les plus hauts niveaux de Pkd1(polykystose rénale 1)l'expression rénale du transgène a été mesurée pour les lignées 39 et 41. Pour surveiller si l'augmentation de Pkd1(polykystose rénale 1)résultant du transgène ou du gène endogène, le même groupe de souris des trois lignées transgéniques a été comparé pour l'expression rénale du transgène Pkd1 et pour l'expression rénale totale de Pkd1 (transgène et endogène) par PCR en temps réel. De manière intéressante, les lignes 39 et 41 par rapport à la ligne 3 ont montré que l'expression rénale accrue du transgène Pkdl était similaire ou supérieure à celle de l'expression rénale totale de Pkd1, indiquant que le transgène était spécifiquement responsable de cette expression induite. Dans divers organes (y compris le cœur, les poumons, le cerveau, le foie, le pancréas et la rate), le transgène SBPkd1rAg a montré une expression très faible occasionnellement détectée dans la rate et les poumons, avec une expression faible à indétectable dans d'autres organes (Fig. 3b). La quantification par PCR en temps réel a démontré un niveau 10- à 1,000- fois inférieur de l'expression du transgène dans les tissus extrarénaux par rapport à l'expression rénale (Fig. 3c). Les éléments régulateurs « SB » du transgène SBPkdlrA conféraient une expression rénale préférentielle ; cette distribution organique particulière a également été déterminée lorsqu'elle était utilisée dans des transgènes liés à c-myc (SBM) et c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, un effecteur en aval de Pkd1(polykystose rénale 1)voies de signalisation chez les souris SBPkdlrAc. Pour mieux comprendre le mécanisme pathogénique intracellulaire des souris transgéniques SBPkdlrAg, nous avons ensuite cherché à surveiller le niveau d'expression rénale de c-myc sur la base de notre observation précédente de la dérégulation de c-myc dans la PKRAD humaine. (autosomique dominantpolykystose rénale)reins(22). L'analyse des reins a été réalisée à partir des trois lignées transgéniques 3(n =4),39(n =7) et 41 (n=4)ainsi que des témoins (n=4). Comme le montre la Fig.3d, il existe une expression substantielle de c-myc endogène induite chez les souris SBPkd1TAG par rapport aux souris témoins d'âge similaire. Fait intéressant, le niveau d'expression de c-myc dans certains reins SBPkd1-c. en particulier la lignée 39, a atteint des niveaux comparables à ceux observés dans le modèle de souris transgénique PKD SBM produit par l'expression rénale de c-myc.

Anomalies rénales chez les souris SBPkd1raG similaires à la PKD(polykystose rénale). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 pour chaque ligne) ont développé plusieurs kystes tubulaires (T) et glomérulaires (G) (Fig.4d, f et g). Des kystes ont été observés dans les tubules des régions corticales et médullaires ainsi que dans les tubules collecteurs de la papille (Fig. 4d et e). Les souris transgéniques présentaient une hyperplasie épithéliale tubulaire (tête de flèche) impliquant à la fois des tubules kystiques et non kystiques et une hypertrophie fréquente (Fig. 4g et h), mais la gravité variait d'une souris à l'autre. Une fibrose interstitielle (F), des infiltrats lymphoïdes périvasculaires et des cylindres protéiques (P) ont été fréquemment observés (Fig. 4d et e).

Pour définir plus précisément le site de localisation de Pkd1 augmenté(polykystose rénale 1)expression dans les reins, nous avons réalisé une hybridation in situ en utilisant la sonde exon 36-45 précédemment utilisée(16). Le signal d'hybridation a été localisé spécifiquement aux cellules épithéliales tapissant le kyste et les tubules hyperplasiques ainsi que les kystes glomérulaires. De plus, un signal a été observé sur l'épithélium de tubules non kystiques ou légèrement dilatés, identifiant probablement des tubules prédestinés à subir de futurs changements kystiques (Fig. 4i et j).

Une analyse histologique rénale a également été réalisée sur des souris transgéniques à la naissance (n =8), au 10e jour postnatal (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}), et P45(n=3) en comparaison avec les compagnons de portée négatifs du même groupe d'âge (n 2 à 4). Fait intéressant, toutes les souris transgéniques nouveau-nées présentaient une dilatation tubulaire et glomérulaire par rapport aux compagnons de portée négatifs témoins (Fig. 4k et l), indiquant que des anomalies rénales ont été initiées in utero, comme observé chez les souris SBM et dans la PKRAD. (autosomique dominantpolykystose rénale)les patients. La dilatation tubulaire et glomérulaire augmente en taille et en nombre avec l'âge. À P35, les souris transgéniques présentaient une hyperplasie plus grave et des signes de glomérulosclérose. Fonctions physiologiques rénales altérées chez les souris SBPkd1TAG. Les fonctions physiologiques rénales de toutes les souris transgéniques présentaient des caractéristiques similaires à celles de la PKD(polykystose rénale), tandis que les compagnons de portée non transgéniques n'ont jamais développé la maladie. Quelques mois après la naissance, les animaux atteints ont développé une insuffisance rénale chronique. Ces animaux ont été surveillés pour les paramètres fonctionnels rénaux en mesurant les taux sériques et urinaires, l'azote uréique sanguin (BUN) et la créatinine, l'osmolalité urinaire, les protéines urinaires et l'excrétion d'ions (tableau 1). Toutes les souris des trois lignées comparées aux témoins présentaient des défauts de concentration, une constatation courante dans la PKRAD, et par conséquent présentaient une diminution des concentrations urinaires d'azote uréique, de créatinine, de protéines et de fer. Les fondateurs et descendants transgéniques SBPkd1TAG (n 6) de chaque lignée ont été surveillés qualitativement pour la protéinurie sur des échantillons d'urine par SDS-PAGE (Fig. 5). Les souris âgées de plus de 2 mois présentaient une protéinurie non sélective qui progressait avec l'âge. De plus, les taux de BUN sérique et de créatinine sérique ont été augmentés, révélant une insuffisance rénale (tableau 2). Étant donné que l'insuffisance rénale chronique entraîne généralement des altérations des paramètres hématologiques, ceux-ci ont été examinés chez des souris transgéniques SBPkd1TAG âgées de 3 à 14 mois (tableau 2). Ces souris transgéniques étaient anémiques, comme en témoigne la diminution significative du nombre de globules rouges, l'hémoglobine et l'hématocrite atteignant la moitié des niveaux normaux. D'autres paramètres des globules rouges, comme le pourcentage de réticulocytes, n'ont pas été affectés, comme prévu lorsqu'ils sont induits par une anomalie rénale. Ces animaux sont systématiquement morts d'insuffisance rénale à 5,9  2.8 mois (n 42) pour la lignée transgénique 39 et à des âges plus avancés, 14,6 3.1 mois (n 20) et 11 .7 6.5 mois (n 7), pour les lignes 3 et 41, respectivement.

FIGUE. 1. Représentation schématique et analyse détaillée de la carte de restriction d'un Pkd 1- BAC murin.

Schémas de digestion de l'ADN génomique du Pkd1(polykystose rénale 1)-BAC ont été comparés à celui du Pkd1(polykystose rénale 1)locus dans les souches de souris consanguines 129Sv et C57Bl/6J. Sept sondes englobant la majeure partie du gène Pkd1 murin ont été produites :

(a) exon 1, (b) exon 2-3, (c) exon 7-15, (d) exon 15-20, (e) exon 25-34, (f ) exon 36-45, et (g) exon 45-46, marqué de a à g sur le génomique Pkd1(polykystose rénale 1)représentation et sur des transferts individuels.

Analyse par transfert de Southern après digestion par restriction (BamHI, EcoRI, HindIII et KpnI) de l'ADN génomique du Pkd1-BAC et du Pkd1 murin(polykystose rénale 1)locus ont montré des modèles identiques avec les sept sondes. M, marqueur HindIII; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISCUSSION

Ici, nous rapportons l'isolement et la caractérisation d'un murin Pkd1-BAC. Ce Pkd1(polykystose rénale 1)Le gène a été marqué et les éléments régulateurs ont été remplacés pour cibler l'expression spécifiquement vers les reins par deux événements successifs de recombinaison homologue. Les souris transgéniques produites avec ce nouveau gène SBPkd1TAG ont montré une augmentation de 2- à 15- fois de l'expression de Pkd1 et ont développé de manière reproductible des altérations morphologiques rénales précoces typiques de la PKD. L'insuffisance rénale est apparente à l'âge moyen et les souris meurent prématurément d'insuffisance rénale. Nos résultats indiquent également que le mécanisme de surexpression de Pkd1 responsable de ce phénotype est médié par la signalisation de l'activation de c-myc in vivo. Cette étude démontre que le gain de fonction Pkd1 murin dans les reins est suffisant pour produire un phénotype rénal PKD. Comme le gène Pkd1 murin n'est pas dupliqué comme chez l'homme (27), nous avons directement identifié et isolé un clone BAC qui contenait le gène Pkd1 entier. La caractérisation complète du 129/Sv murin Pkd1-BAC, comparaison indirecte avec deux autres souches de souris consanguines, a confirmé l'intégrité du locus Pkd1. L'insert Pkd1-BAC contenait 37 à 39 kb de séquences en amont et en aval du gène Pkd1. Notre analyse a démontré que le gène Pkd1 dans ce BAC était un véritable locus de type sauvage murin qui pourrait servir à d'autres études. Bien qu'il existe des preuves solides que la formation de kystes dans la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)peut résulter de la perte d'hétérozygotie suite à l'inactivation somatique de la PKD1 normale(polykystose rénale 1)allèle (3, 21, 32), il existe également des preuves évocatrices d'une expression soutenue ou même accrue de la polycystine-1 dans l'épithélium tubulaire kystique (22, 29). Cette dernière observation soulève la question de savoir si la surexpression de Pkd1 en soi est une cause immédiate suffisante de la cystogenèse. Chez des souris transgéniques porteuses de la PKD1 humaine(polykystose rénale 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 et SLC9A3R2, seule une minorité de souris a développé des kystes et aucune n'avait d'expression transgénique détectable à l'âge adulte malgré 30 copies du transgène (31). Chez ces souris transgéniques, il était difficile d'établir un rôle clair pour la surexpression de Pkd1 dans la cystogenèse. Notre modèle diffère, car deux à neuf copies de type sauvage de Pkd1 seules, sans gènes contigus, ont été intégrées dans des souris transgéniques. Étant donné que le gène Pkd1 a des fonctions essentielles dans divers organes ou tissus, comme décrit pour de nombreuses souris avec ablation du gène Pkd1, la surexpression systémique de Pkd1 pourrait entraîner des effets de confusion supplémentaires. Par conséquent, nous avons abordé le rôle du gain de fonction de Pkd1 en utilisant une approche qui cible spécifiquement Pkd1 sur les reins. Par recombinaison homologue, nous avons d'abord remplacé la région régulatrice en amont de Pkd1 par les éléments régulateurs restreints rénaux "SB", empêchant ainsi la diminution de l'expression génique normalement observée pour Pkd1 à l'âge adulte ainsi que la régulation potentielle de la boucle de rétroaction secondaire (36, 38). Deuxièmement, nous avons marqué le transgène Pkd1 murin (Pkd1TAG) avec une mutation ponctuelle silencieuse dans l'exon 10, mais nous n'avons pas inséré d'étiquette d'épitope pour nous assurer qu'une protéine "de type sauvage" entièrement fonctionnelle avec une structure et une intégrité conservées serait produite. A partir de ce BAC modifié, un fragment SBPkd1TAG a été purifié du gène Tsc2 et du vecteur BAC pour éviter l'interférence du gène Tsc2, qui peut également induire un phénotype kystique (8, 20, 28), ainsi que pour éviter l'effet inhibiteur de séquences procaryotes (5).

Quatre souris fondatrices transgéniques SBPkd1TAG différentes et trois lignées indépendantes ont été produites avec une Pkd1 rénale spécifique(polykystose rénale 1)-expression améliorée. La pénétrance complète du phénotype chez ces souris transgéniques est particulièrement frappante. Le fondateur de SBPkd1TAG et les lignées de souris partageaient plusieurs caractéristiques physiopathologiques en commun avec la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale). Ceux-ci incluent le développement de kystes dans le cortex, la moelle et les glomérules ainsi que l'hyperplasie épithéliale, la fibrose interstitielle et l'inflammation interstitielle focale.

Parce que le PKD(polykystose rénale)Le phénotype a été systématiquement observé chez toutes les différentes souris fondatrices transgéniques et l'intégration du transgène dans le génome de la souris est un phénomène aléatoire, le phénotype ne peut pas résulter d'un effet de position chromosomique mais uniquement d'une expression accrue de Pkd1. En effet, l'expression du transgène Pkd1 dans toutes les lignées s'est avérée restreinte au niveau rénal, comme observé précédemment pour d'autres transgènes régulés par les éléments « SB » (36, 38). De plus, cette expression accrue de Pkd1 a été causée par le transgène et non par une activation endogène indirecte de Pkd1. Par conséquent, nos résultats fournissent des preuves claires que le gain de fonction d'un Pkd1 fonctionnel de type sauvage peut produire plusieurs kystes rénaux. Fait important, ces souris SBPkd1TAG constituent le premier modèle murin généré par la seule surexpression de l'orthologue murin du gène PKD1 humain.

Les souris SBPkd1TAG démontrent que Pkd1(polykystose rénale 1)la surexpression est un mécanisme pathogénique primaire de la cystogenèse rénale. Il est important de noter que les niveaux d'expression transgénique les plus élevés dans les reins semblaient corrélés à la progression et à la gravité du phénotype. Nous avons également constaté que la surexpression de Pkd1 dans le développement du phénotype SBPkd1TAG est susceptible de signaler l'activation de c-myc in vivo. En théorie, cette activation pourrait même être directe via la queue C-terminale de la polycystine -1 subissant un clivage protéolytique et une translocation nucléaire (7). Puisqu'il a été démontré que l'expression rénale accrue de c-myc chez les souris adultes induisait la PKD, il serait très cohérent de soutenir c-myc en tant qu'effecteur majeur en aval des voies de signalisation Pkd1. Ce résultat était également corrélé avec nos découvertes précédentes d'expression accrue de c-myc dans les reins de tous les ADPKD humains (autosomique dominantpolykystose rénale)analysé (22). Au total, ces résultats indiquent que c-myc est un médiateur principal de Pkd1(polykystose rénale 1)cystogenèse. Nos résultats du modèle de gain de fonction de Pkd1, ainsi que l'haploinsuffisance et la perte de fonction de Pkd1 murin, indiquent que toute dérégulation de Pkd1 pourrait entraîner une cystogenèse (2, 19, 23-26, 31, 40).

Pkd1 sévère(polykystose rénale 1)déséquilibre chez la souris induit par Pkd1(polykystose rénale 1)l'ablation ou la surexpression transgénique a provoqué l'apparition précoce et la progression rapide des kystes rénaux et a affecté une proportion élevée de tubules. En revanche, un déséquilibre plus léger de Pkd1 tel que l'haploinsuffisance a conduit à une progression plus lente de la PKD avec plus de kystes focaux. Le développement paradoxal apparent d'un phénotype similaire au moyen d'une dérégulation opposée de la polycystine -1 pourrait s'expliquer par le résultat commun, à savoir un déséquilibre relatif de la concentration en protéines qui pourrait altérer la formation ou la fonction d'un complexe multiprotéique actif de polycystine. Pris ensemble, nos résultats et ceux d'autres chercheurs soutiennent que le mécanisme de formation de kystes dans la PKRAD (autosomique dominantpolykystose rénale)est susceptible de provenir de trois mécanismes pathogéniques : gain de fonction, perte de fonction et effets de dosage des gènes. Les nouvelles souris SBPkd1TAG constituent un puissant modèle de cystogenèse rénale qui peut fournir des informations majeures sur la physiopathologie de la PKD(polykystose rénale), Pkd1(polykystose rénale 1)les voies de transduction du signal et les partenaires d'interaction. L'étude de ce modèle pourrait également conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour rétablir un équilibre protéique normal au sein du complexe multimérique Pkd1.

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