Le rôle central du facteur de croissance transformant (TGF-) dans le développement de la fibrose rénale
Mar 26, 2022
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PARTIE Ⅰ : Rôle du fibroblaste rénal primaire humain dans les dispositifs médiés par le TGF- 1-imitant la fibrose
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Introduction
Fibrose rénale, la dernière voie commune d'innombrables maladies rénales progressives, se caractérise par une augmentation de la production de protéines de la matrice extracellulaire (ECM), une diminution de la dégradation de la matrice, un dysfonctionnement de l'interaction cellule-matrice, la transformation des cellules résidentes et une infiltration cellulaire inflammatoire.Transformer le facteur de croissance-(TGF-) est un peptide dimère multifonctionnel qui régule les processus biologiques tels que la prolifération cellulaire, la différenciation et les réponses immunologiques [1]. Parmi les nombreux facteurs fibrogènes, le TGF- (Transformer le facteur de croissance-) joue un rôle central et a un effet anti-inflammatoire. TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)-les souris déficientes meurent d'une inflammation massive. Souris transgéniques surexprimant le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)sont pratiquement protégés contre le développement d'une pathologie fibrotique rénale, principalement grâce à son activité anti-inflammatoire [2]. Les propriétés profibrotiques et anti-inflammatoires du TGF-(Transformer le facteur de croissance-)sont des épées à double tranchant concernant l'application thérapeutique du TGF-(Transformer le facteur de croissance-)inhibition. Des efforts remarquables ont été faits pour entraver le TGF-(Transformer le facteur de croissance-)action pour freiner la progression derénalfibrose[3]. Bien que de nombreuses approches aient été utilisées pour combattrerénalfibrose, un modèle expérimental pour évaluer les médicaments actuellement disponibles n'est pas idéal.
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En général, les études animales jouent un rôle central dans les tests précliniques pour prédire la pharmacocinétique et l'efficacité des médicaments. Cependant, diverses différences existent entre les animaux et les humains, ce qui nous amène à remettre en question l'exactitude des tests d'efficacité et d'innocuité des médicaments sur les animaux. Le fonctionnement rénal des animaux est plus du double de celui des reins humains. Par conséquent, les médicaments sont métabolisés plus rapidement chez les animaux que chez les humains, ce qui rend difficile l'élucidation des résultats des tests de toxicité des médicaments à l'aide d'études animales. De plus, les résultats des expérimentations animales ne peuvent pas être utilisés pour prédire les réponses aux médicaments chez l'homme, car les animaux ont des fonctions physiologiques différentes. D'origine animalefibrose rénaleles modèles ont du mal à se reproduirefibrose rénale; par conséquent, des recherches sont en cours pour surmonter les obstacles actuels et optimiser les plateformes de découverte de médicaments [5].
La technologie Organ-on-a-chip (OoC) est apparue comme un nouveau concept pour résoudre ces problèmes. Cette plate-forme a été conçue en tenant compte des lacunes actuelles et s'est révélée très prometteuse dans le domaine de la néphrologie [6]. De plus, les modèles OoC ont un grand potentiel en remplacement des modèles animaux expérimentaux, fournissent une solution aux différences inter-espèces et peuvent aider à mettre fin à la cruauté envers les animaux et aux débats éthiques [7]. Il existe peu de modèles in vitro qui utilisent simultanément des fibroblastes rénaux primaires avec des cellules endothéliales et épithéliales, qui sont des cellules importantes dansun reinfibrose. Le rôle de chaque cellule dansfibroseest étudié séparément; cependant, les connaissances concernant l'interaction des cellules sont limitées.
Dans la présente étude, nous avons développéfibrose-des dispositifs imitant l'utilisation de fibroblastes primaires humains. Nous avons confirmé que TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)le traitement a divers effets surfibrose rénalemaquette. Notamment, les fibroblastes jouent un rôle central en tant que cellules effectrices, favorisent la formation d'un microenvironnement pro-fibrotique et sécrètent des facteurs de croissance et des cytokines. Par conséquent, sur la base de cette nouvelle méthode, les fibroblastes peuvent fournir un système de modèle cellulaire idéal pour étudier les maladies rénales. Nous avons évalué si les fibroblastes dérivés de la maladie rénale fibrotique affectent l'intégrité des cellules cultivées en trois dimensions (3D). Enfin, nous présentons une étude de preuve de principe qui démontre le potentiel defibrose rénale-les dispositifs imitant comme modèle pour prédire la réponse à l'humainfibrose rénale.
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2. Résultats
2.1.Identification de l'actine musculaire lisse alpha (a-SMA) et de la kératine -8 (KRT -8) par TGF - 1(Transformer le facteur de croissance-)dans les cellules HK-2
Dans la phase précoce, nous avons examiné les marqueurs connus defibroseet le cytosquelette dans des cultures bidimensionnelles (2D). Des tests de coloration immunofluorescente ont été effectués pour estimer l'expression -SMA de la fibrose et du marqueur de transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) tubulaire et des niveaux de KRT8 en tant que marqueur du cytosquelette. La coloration par immunofluorescence a montré que l'expression de -SMA était à l'origine faible et que les niveaux de KRT8 étaient élevés dans les cellules épithéliales monocouches HK-2. Il n'y a pas eu d'altération significative de l'intensité de fluorescence par le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)(5 ng/mL) ou le traitement inhibiteur spécifique des cellules épithéliales HK-2 pendant 24 h (Figure 1).
Figure 1. L'immunofluorescence montre que l'expression de l'alpha-SMA et de la kératine-8(KRT8) a été maintenue par le traitement du TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)ou l'inhibiteur dans les cellules HK-2.(A)L'expression d'alpha-SMA et (B)CCK-8 n'a eu aucun effet sur les cellules HK-2par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)(5ng/mL) ou l'inhibiteur. Les cellules ont été initialement plaquées à une densité de 1 × 10 degrés par puits (ac) contrôle non traité et (df) stimulées avec 5 ng/mL de TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-) ou (gi) inhibiteur de 10 μM (SB431542) pendant 24 h et fixé avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les cellules ont ensuite été colorées avec de l'anti- -SMA et de l'anti-cytokératine-8 pendant 20 min. Une co-coloration avec le colorant Hoechst H33342 pour identifier les noyaux cellulaires a été réalisée. Les barres d'échelle des micrographies indiquent 200 um.
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2.2. Expression KRT8 diminuée par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)sur une puce
Ensuite, nous avons évalué les niveaux d'expression de -SMA et KRT8 dans HK cultivé en 3D -2 et la longueur totale des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine GFP (HUVEC) traitées avec TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)et un inhibiteur spécifique. Pour ce faire, nous avons d'abord établi un modèle de puce tissulaire comprenant deux types de cellules, les cellules épithéliales HK -2 et les GFP-HUVEC. Après confirmation de la construction, nous avons exposé la puce de tissu avec TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)(5 ng/mL) ou un inhibiteur spécifique (10 um SB431542) pendant 24 h.
Comme le montre la figure 2A-C, l'expression de -SMA n'a pas été spécifiquement modifiée par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)ou le traitement inhibiteur spécifique. Cependant, l'expression de KRT8 a été réduite dans la puce co-cultivée de type à deux cellules. De plus, l'ajout d'un inhibiteur de TGF-ß1 a augmenté l'expression de KRT8.
Nous avons examiné la formation d'un réseau de type capillaire tubulaire 3D par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement dans les HUVEC, car les cellules endothéliales peuvent former spontanément un réseau de type capillaire tubulaire 3D. Conformément à nos conditions de culture, la formation de lignes épaisses a été significativement diminuée. Cependant, les lignes fines de type capillaire ont été augmentées dans le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)GFP-HUVEC traités. Dans le cas du TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement inhibiteur sur la puce cultivée en 3D, la longueur totale des lignes épaisses et épaisses a montré une tendance inverse au TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement. Une augmentation de la longueur de la ligne épaisse a été observée par rapport au groupe témoin non traité. Un schéma similaire a été observé dans le diamètre de la ligne épaisse dans GFP-HUVEC après TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement et traitement inhibiteur. Le diamètre du GFP-HUVEC a été supprimé par le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement mais augmenté quelle que soit l'épaisseur de la ligne par l'inhibiteur par rapport aux témoins et au TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-). La longueur totale et le diamètre de la ligne épaisse ont été considérablement augmentés par le traitement par inhibiteur du TGF- 1 par rapport au contrôle non traité et au traitement par le TGF- 1. Notamment, les résultats obtenus ont indiqué une densité accrue de minuscules vaisseaux dans le TGF-(Transformer le facteur de croissance-)-groupe traité par rapport à leurs homologues non traités. En revanche, la densité des vaisseaux épais dans le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)groupe de traitement était inférieur à celui du groupe témoin non traité (Figure 2D, E).
Figure 2. Expression de KRT8 dans HK-2 et longueur totale et diamètre des HUVEC.(A) L'immunofluorescence montre que l'expression de -SMA a été maintenue et que l'expression de KRT8 a été considérablement diminuée par le traitement du TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)à Hong Kong-2. Les cellules ont été plaquées et stimulées avec 5 ng/mL de TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)ou inhibiteur de 10 μm (SB 431542) pendant 24 h et fixé avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les cellules ont été colorées avec de l'anti- -SMA et de l'anti-cytokératine-8 pendant 20 min. Une co-coloration avec le colorant Hoechst H33342 pour identifier les noyaux cellulaires a été réalisée. L'expression de -SMA(ac) n'a subi aucune altération, mais KRT8(df) dans les cellules HK-2 et l'expression de GFP dans HUVEC (gi) ont été significativement modifiées par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)(5 ng/mL) et l'inhibiteur (B, C). Dans la longueur totale des HUVEC, le vaisseau mince a été augmenté mais le vaisseau épais a été diminué par le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-). Le diamètre a été augmenté dans les vaisseaux minces et épais. Ces résultats ont été renversés par l'inhibiteur SB431542 (D, E). Les barres d'échelle dans les micrographies indiquent 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
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2.3. TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)Affecte trois types de cellules de la puce avec une structure à plusieurs compartiments
Pour étudier le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)réponses de la puce 3D proposée, nous avons effectué une immunocoloration sur chaque compartiment séparément (Figure 3). Des fibroblastes rénaux humains primaires ont été utilisés dans cette analyse. Les échantillons ont été analysés à l'aide de FACS et confirmés positifs pour l'anticorps marqueur des fibroblastes. Après incubation des trois types de cellules avec TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)pendant 24 h, une immunocoloration a été réalisée pour évaluer l'expression de -SMA et de KRT8. L'expression de l'a-SMA a été régulée positivement par le traitement au TGF-1, et des résultats opposés ont été observés avec le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement inhibiteur. À l'inverse, l'expression de KRT8 a été régulée à la baisse par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)et a montré une réponse opposée au TGF-(Transformer le facteur de croissance-)inhibiteur (Figure 4A-C).
Figure 3. Exemple d'image avec démonstration schématique de l'appareil de la fabrication et du calendrier expérimental.(A) Les deux images du haut montrent la mise en page. L'image de gauche montre une photo globale de haut en bas de l'appareil. Les images du bas montrent la coupe transversale. Vue schématique détaillant les dimensions des guides de liquide. (B)Cette figure décrit les programmes expérimentaux pourfibrose- appareils imitant. Le processus de chargement en quatre étapes pour chaque puits. Emplacement de chaque zone de modelage d'hydrogel, ainsi que le placement des médias en coupe transversale descendante et isométrique. (1) Un total de 1,5 uL d'hydrogel 1 est spontanément guidé dans le canal central. (2) Le canal central est rempli de 5 uL d'hydrogel. (3) Un total de 10 uL d'hydrogel 3 sont modelés sur le fond du réservoir. （4）Un total de 200 μl de milieu est distribué. Barre d'échelle rouge=9 mm.
Comme le montre la figure 4D-G, la longueur de la ligne mince de type capillaire a été considérablement augmentée par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement dans les GFP-HUVEC. Cependant, l'épaisseur de la ligne épaisse a été réduite dans le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)HUVEC traités. Le diamètre était réduit en moyenne pour les vaisseaux fins et épais dans les HUVEC. Dans le cas du TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement inhibiteur sur la puce cultivée en 3D, la longueur totale des lignes épaisses et épaisses a montré une tendance opposée au traitement TGF- 1. De plus, la longueur de la ligne épaisse a été augmentée par rapport au groupe témoin non traité.
Figure 4. Altération de HK -2 cultivé en 3D et des HUVEC avec des fibroblastes rénaux primaires.Les cellules totales ont été plaquées à une densité de 5 × 10 degrés par puce 3D et stimulées avec 5 ng/mL de TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)ou inhibiteur de 10 μm (SB 431542) pendant 24 h et fixé avec du paraformaldéhyde à 4 %. (A) Les cellules de la puce 3D ont été colorées avec de l'anti-o-SMA et de l'anti-cytokératine -8. L'expression de -SMA (ac) a été augmentée et l'expression de KRT8(df) a été diminuée de manière significative par le TGF- 1(5 ng/mL). La longueur totale des HUVEC ; les vaisseaux minces ont été considérablement augmentés et les vaisseaux épais ont été diminués par le TGF-ß1(Transformer le facteur de croissance-)(D, E). Le diamètre était diminué pour les vaisseaux fins et épais (F, G). Ces résultats ont été renversés par l'inhibiteur SB431542. Les barres d'échelle des micrographies indiquent 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 module le médiateur inflammatoire et les facteurs de croissance
Ensuite, nous avons étudié les cytokines inflammatoires et les facteurs de croissance dans le surnageant ; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Transformer le facteur de croissance-), et TGF- 3(Transformer le facteur de croissance-)la sécrétion de protéines était considérablement plus élevée dans les puces cultivées en 3D que dans les fibroblastes 2D bien cultivés, même s'ils avaient le même nombre total de cellules. Cependant, TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-) les niveaux étaient similaires, car les modèles de culture 2D ou 3D ont été traités avec des concentrations similaires de TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)(Figure 5A-E). En particulier, la libération de FGF-2 à partir de fibroblastes rénaux primaires humains était de 20.9 ± 0.4 pg/jour/5× 10 degrés de cellules de la culture monocouche 2D et 3 094,8 ± 0,2 pg/jour/5 cellules de 10 degrés, y compris les cellules HUVEC et HK-2 de la puce cultivée en 3D dans le témoin non traité. La sécrétion de FGF-2 par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)la stimulation était de 31,0±0.2pg/jour/5×10 cellules de degré pour la culture 2D et de 3683,9± 0,8 pg/jour/5×10 cellules de degré pour la culture 3D -puce cultivée. Cette augmentation de la production de protéines FGF-2 dans la culture monocouche 2D s'est accompagnée d'une augmentation du modèle de puce cultivé en 3D par TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement (figure 5B).
Figure 5. Comparaison des modèles de culture 2D et 3D en tant que plates-formes imitant la fibrose rénale.Les cellules ont été plaquées à une densité de 5 x 10 degrés par puits 2D ou puce 3D et stimulées avec 5 ng/mL de TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)ou 10 um d'inhibiteur (SB 431542) pendant 24 h. Des fibroblastes rénaux humains primaires ont été utilisés dans le modèle de culture 2D et dans le modèle de culture 3D. Les fibroblastes ont été utilisés à une densité de 8 × 10 * cultivés avec des HUVEC et HK-2. Le rapport primaire fibroblaste rénal humain/HUVEC, ou rapport F:H, était de 1:5 pour l'évaluationfibroseDes cellules .HK-2 ont été utilisées à une densité de 2×104. La détection de(A)IL-1,(B)basic fibroblast growth factor (FGF-2) et(CE)TGF-beta 1, 2 et 3 dans le surnageant a été réalisée par analyse multiplex de cytokines et dosage immunologique par billes multiplex. Chaque barre représente la moyenne ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformer le facteur de croissance-).
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De plus, nous avons estimé l'expression de l'ARNm de cytokines pro-inflammatoires telles que IL-1, IL-6, IL-8 et TNF-. Les résultats ont été significativement régulés à la baisse par le TGF humain recombinant - 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement dans la puce cultivée en 3D en tant que propriété anti-inflammatoire du TGF-(Transformer le facteur de croissance-). Nous avons constaté que l'expression de l'ARNm était régulée positivement par le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)inhibiteur (SB431542). En outre, l'expression médiée par les inhibiteurs de IL -6, IL -8 et TNF- a été spécifiquement régulée à la baisse par rapport au témoin non traité (figure 6A-D). Le niveau d'ARNm du VEGF, un facteur fibrotique, a été significativement augmenté par le TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)traitement. Le niveau d'ARNm du VEGF a été diminué par l'inhibiteur du TGF- 1 (Figure 6E), alors que l'expression de l'ARNm de l'IL-10 avec effet anti-fibrotique a été diminuée dans les conditions fibrotiques induites par le TGF- 1 . En revanche, l'expression de l'ARNm I -10 a été augmentée par le traitement par l'inhibiteur du TGF - 1 (figure 6F).
Figure 6. La PCR en temps réel montre l'expression globale de l'ARNm de la puce 3D.Les cellules ont été plaquées à une densité de 5 × 10 degrés par puce 3D et stimulées avec 5 ng/mL de TGF- 1(Transformer le facteur de croissance-)ou 10 um inhibiteur (SB431542) pendant 24h. ARN total extrait de la puce cultivée en 3D. L'expression de l'ARNm de(A)IL-1 ,(B)TNF- ,(C)IL-6 et (D)IL-8 représente l'effet anti-inflammatoire du TGF{ {dix}}(Transformer le facteur de croissance-)traitement. L'expression de (E)VEGF en tant que facteur angiogénique a été augmentée. L'expression de (F)IL-10 en tant que facteur anti-fibrotique a été significativement diminuée par le TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformer le facteur de croissance-).