La protéine sécrétoire conservée riche en cystéine MaCFEM85 interagit avec MsWAK16 pour activer les défenses des plantes
Oct 26, 2023
Abstrait: Metarhizium anisopliaeest un champignon entomopathogène qui peut améliorer la croissance et la résistance des plantes lorsqu'il agit comme endophyte chez les plantes hôtes. Cependant, on sait peu de choses sur les interactions protéiques ou leurs mécanismes d’activation. Les protéines de la membrane extracellulaire fongique (CFEM) ont été identifiées comme des régulateurs immunitaires des plantes qui suppriment ou activent les réponses de résistance des plantes. Ici, nous avons identifié une protéine contenant un domaine CFEM, MaCFEM85, qui était principalement localisée dans la membrane plasmique. Les tests de levure à deux hybrides (Y2H), de glutathion-S-transférase (GST) et de complémentation par fluorescence bimoléculaire ont démontré que MaCFEM85 interagissait avec le domaine extracellulaire d'unMédicago sativa(luzerne), protéine membranaire, MsWAK16. Les analyses de l'expression génique ont montré que MaCFEM85 et MsWAK16 étaient significativement régulés positivement dansM. anisopliaeetM. sativa, respectivement, de 12 à 60 h après la co-inoculation. Des tests supplémentaires sur deux hybrides de levure et des mutations spécifiques à un site d'acide aminé ont indiqué que le domaine CFEM et la 52e cystéine étaient spécifiquement requis pour l'interaction de MaCFEM85 avec MsWAK16. Les tests de fonction de défense ont montré que JA était régulée positivement, mais la taille des lésions de Botrytis cinerea et la reproduction de Myzus persicae étaient supprimées par l'expression transitoire de MaCFEM85 et de MsWAK16 dans la plante hôte modèle Nicotiana benthamiana. Collectivement, ces résultats fournissent de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions de M. anisopliae avec les plantes hôtes.
avantages du supplément cistanche - augmenter l'immunité
Mots clés : kinase associée à la paroi ; CFEM ; Metahizium anisopliae; immunité des plantes; Médicago sativa
1. Introduction
Les interactions entre plantes et microbes sont répandues et sont le résultat d’une coévolution passée et actuelle. Ces interactions peuvent avoir des résultats bénéfiques, neutres ou défavorables pour chaque participant [1–3]. Le microbiote rhizosphérique bénéfique peut favoriser la croissance des plantes et améliorer la santé globale en les protégeant contre les maladies transmises par le sol ou en améliorant l’absorption des nutriments [4,5]. Un large éventail de microbes bénéfiques peuvent améliorer les capacités des plantes telles que l’absorption des nutriments, la croissance et les défenses contre les agents pathogènes et les insectes [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın est un genre important de champignons entomopathogènes ayant la capacité de coloniser les plantes [8], mais il existe également des preuves suggérant que les membres du genre peuvent améliorer la résistance aux agents pathogènes des plantes. Par exemple, une étude en laboratoire a révélé une inhibition de 60 % de Fusarium solani (Mart.) Sacc. en présence de Metarhizium robertsii (anciennement connu sous le nom de M. anisopliae) par rapport aux témoins sans M. robertsii [9]. Certaines souches de Metarhizium ont le potentiel d’améliorer la résistance des plantes aux insectes nuisibles et aux maladies en modifiant l’expression des gènes de défense des plantes. La colonisation endophytique avec M. Roberts active l'expression des voies de défense de l'acide jasmonique (JA) et de l'acide salicylique (SA) dans les feuilles de maïs ; de plus, une telle colonisation est associée à la promotion de la croissance des plantes et à la suppression du développement larvaire d'Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense a activé la -1,3-glucanase et la chitinase dans la peau du fruit de Lansium parasiticum, entraînant l'inhibition de la croissance de Botrytis sp. et Fusarium sp. sur le fruit d'Aglaia dookkoo Griff [11]. De plus, lorsque M. anisopliae a été appliqué à des plants d'arachide, divers facteurs de transcription, notamment les WRKY, les MYC, les TGA et les facteurs de transcription sensibles à l'éthylène, ont été activés, tandis que les transporteurs de nitrate et les protéines liant les éléments sensibles à la déshydratation ont également été exprimés de manière différentielle. . Cela suggère que M. anisopliae régule les gènes de défense des plantes lorsqu'il colonise la plante. Cependant, on sait relativement peu de choses sur les mécanismes qui sous-tendent les réponses de défense des plantes suite à une infection par Metarhizium. Les effecteurs sont un moyen courant par lequel les micro-organismes régulent la résistance des plantes [13]. L'activation de la résistance des plantes est généralement caractérisée par une poussée oxydative et l'induction d'hormones, de métabolites et d'autres signaux [13]. Les hormones végétales SA et JA jouent un rôle important dans l’induction de la résistance des plantes, en assurant la médiation de deux voies de signalisation de défense distinctes (14). La voie de signalisation SA fonctionne principalement dans la réponse allergique des plantes et dans la résistance systémique acquise aux agents pathogènes, mais elle peut également être impliquée dans les réponses de défense indirectes des plantes induites par l'alimentation des insectes piqueurs (15). L'accumulation de SA est associée à une expression accrue de gènes codant pour les protéines de transfert lipidique (LTP) et la phénylalanine ammoniaque-lyase (PAL) (16), qui interviennent dans la synthèse et l'accumulation de métabolites spécialisés en aval tels que les flavonoïdes et la lignine (17). La voie de signalisation JA fonctionne en réponses directes et indirectes aux dommages mécaniques, aux agents pathogènes fongiques et aux insectes nuisibles. Des études ont montré que la signalisation JA a un effet régulateur sur la synthèse de métabolites spécialisés tels que les terpénoïdes, les phénylpropanoïdes et les alcaloïdes, qui ont un large éventail de fonctions biologiques (18). Il a été démontré que certains métabolites spécialisés s'accumulent dans les cellules végétales après un traitement au méthylJA (MeJA), notamment le paclitaxel dans les espèces de Taxus [19,20], les terpénoïdes dans Centella Asiatica (L.) Urban [21] et les saponines dans le ginseng [22]. . L'application de SA et de chitosane (CHT) comme éliciteurs a induit une accumulation de lignine et des réactions enzymatiques de défense chez les tomates, ce qui a réduit l'incidence de l'infection à Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi (23). De plus, les niveaux de JA et de SA dans le blé ont été accumulés de manière significative par l'application de l'éliciteur PeaT, renforçant la réponse de défense contre le puceron de l'avoine Sitobion avenae (Fabricius) (24). Cela indique que l’immunité des plantes pourrait être régulée par ces effecteurs via des hormones et des métabolites végétaux.
cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire
Les protéines de la membrane extracellulaire fongique (CFEM) sont présentes dans un large éventail de champignons. Ils codent pour des domaines qui mesurent généralement 60 acides aminés (aa) et contiennent huit cystéines espacées de manière caractéristique [25]. Les domaines CFEM sont similaires aux domaines de type facteur de croissance épidermique (EGF), qui fonctionnent comme des récepteurs extracellulaires, des transducteurs de signal ou des molécules d'adhésion dans les interactions hôte-pathogène (26). Les protéines contenant des domaines CFEM peuvent manipuler la réponse de résistance des plantes en agissant comme effecteurs. Chez le champignon de la rouille des feuilles du blé Puccinia triticina Erikas, le candidat effecteur CFEM PTTG_08198 a accéléré la progression de la mort cellulaire et favorisé l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) (27). Le champignon de l'anthracnose Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils contient cinq effecteurs (CgCFEM6, 7, 8, 9 et 15) qui suppriment la mort cellulaire programmée induite par BAX chez Nicotiana benthamiana Domin (28). Il a été rapporté que le champignon mycorhizien phytosymbiotique Laccaria bicolor (Maire) PDOrton sécrète plusieurs protéines CFEM, telles que Lac310796, Lac296573 et Lac296572, dans les tissus symbiotiques (29). Bien que les fonctions complexes de ces protéines n'aient pas été étudiées plus en profondeur dans la symbiose mycorhizienne, des résultats antérieurs suggèrent que les protéines CFEM pourraient jouer un rôle dans la signalisation entre les champignons et les plantes. M. anisopliae peut fonctionner comme un champignon entomopathogène ou endophyte dans une plante hôte (30). Cependant, les rôles des protéines CFEM n’ont pas encore été rapportés. Nous avons précédemment identifié une protéine contenant un domaine CFEM chez M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID : MZ682609) [31]. Nous rapportons ici la relation entre MaCFEM85 et la kinase associée à la paroi de Medicago sativa, MsWAK16. Nous avons analysé la séquence MaCFEM85 et mené des expériences pour déterminer quels résidus sont critiques pour l'interaction avec MsWAK16. Enfin, en utilisant N. benthamiana comme plante modèle, nous avons évalué les réponses de défense des plantes contre Botrytis cinerea et le puceron Myzus persicae avec et sans expression transitoire de MaCFEM85 et MsWAK16.
Avantages de la cistanche tubulosa-renforcer le système immunitaire
Cliquez ici pour voir les produits Cistanche Enhance Immunity
【Demandez plus】 E-mail :cindy.xue@wecistanche.com / Whats App : 0086 18599088692 / Wechat : 18599088692
2. Résultats
2.1. MaCFEM85 était le plus étroitement lié aux CFEM fongiques non pathogènes et localisé dans la membrane plasmique
Un arbre phylogénétique a été construit pour analyser les relations entre MaCFEM85 et d'autres protéines CFEM provenant de champignons modèles pathogènes et non pathogènes. Ceux-ci comprenaient Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge et Beauveria bassiana (Bals.) (voir section 4). MaCFEM85 était le plus étroitement lié aux protéines CFEM chez B. bassiana et, par conséquent, plus proche, sur le plan évolutif, des champignons non pathogènes que des champignons pathogènes (Figure 1a).
Figure 1a
2.2. MaCFEM85 a été régulé positivement lors des interactions avec M. sativa
Les kinases de type récepteur associées à la paroi (WAK) représentent un sous-groupe au sein de la superfamille des protéines kinases de type récepteur (RLK) et comprennent un domaine extracellulaire, une hélice transmembranaire et un domaine de kinase intracellulaire. Ils jouent un rôle important dans la régulation de la croissance, du développement, de la réponse au stress et des voies de signalisation de la résistance aux agents pathogènes (32). L'ARN a été extrait des hyphes de M. anisopliae et des racines de M. sativa après co-incubation pour étudier les modèles d'expression de MaCFEM85 et de MsWAK16. MaCFEM85 et MsWAK16 ont été exprimés à des niveaux significativement plus élevés pendant la co-incubation de 12 à 60 h (Figure 1c, d). De 0 à 36 h, l'expression de MaCFEM85 a progressivement augmenté, atteignant un pic à 36 h. Son expression était 593 fois plus élevée dans la combinaison de M. anisopliae et de M. sativa que dans celle de M. anisopliae cultivée seule. Bien que l'expression de MaCFEM85 ait été légèrement diminuée au cours de la période de 48 à 60 heures, elle était toujours exprimée à des niveaux significativement plus élevés que chez M. anisopliae cultivé seul. MsWAK16 était également significativement régulé positivement, avec une expression culminant à 36 h. Chez M. sativa infecté par M. anisopliae, MsWAK16 était 89,06 fois plus exprimé que chez M. sativa sans M. anisopliae. De 36 à 60 h, les niveaux de MsWAK16 ont légèrement diminué, mais son expression était toujours significativement plus élevée que chez les plantes non inoculées.
2.3. MaCFEM85 interagit avec MsWAK16 in vitro et in vivo
Pour étudier le mécanisme fonctionnel potentiel de MaCFEM85 en réponse au traitement par M. anisopliae, un criblage à deux hybrides de levure (Y2H) a été réalisé pour identifier de manière préliminaire les protéines hôtes qui interagissent avec MaCFEM85. L'interaction entre le domaine extracellulaire de MsWAK16 (MsWAK16-ED) et MaCFEM85 a été examinée avec un test bi-hybride de levure un à un utilisant MaCFEM85 dans pGBKT7 comme vecteur BD et MsWAK16 dans pGADT7 comme vecteur AD. Toutes les levures transformées ont bien poussé sur un milieu déficient en SD-T/L, et le groupe témoin positif et le groupe expérimental ont poussé avec succès sur un milieu déficient en SD-T/L/H/A + X- -gal. Cela indique que MaCFEM85 pourrait interagir avec MsWAK16-ED (Figure 2a).
Figure 2. Validation de l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16.
Pour la validation in vitro, du MsWAK16-ED marqué à la glutathion-S-transférase (GST) (codant pour un produit de 60 kDa) a été inséré dans pGEX6-P2 et du MaCFEM85 marqué à la polyhistidine (His) ( codant pour un produit de 17 kDa) a été inséré dans pET-21b. L'immunotransfert avec les anticorps His et GST a montré que la protéine recombinante MaCFEM85-His interagissait avec la proie GST-MsWAK16-ED mais pas avec la GST seule et que GST-MsWAK16- ED interagissait avec His. -MaCFEM85 (Figure 2b). Pour confirmer davantage l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16, nous avons effectué un test de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec les constructions MaCFEM85-YFPN et MsWAK16-YFPC. La co-expression de MaCFEM85-YFPN et MsWAK16-YFPC dans les feuilles de tabac a généré un signal de fluorescence jaune, indiquant que MaCFEM85 a interagi avec MsWAK16 (Figure 2c).
2.4. Sites clés pour les interactions MaCFEM85 et MsWAK16
Pour définir la région de MaCFEM85 requise pour l'interaction avec MsWAK16-ED, les domaines protéiques ont été prédits avec le logiciel en ligne SMART (Figure 3a). MaCFEM85 contenait un domaine CFEM dans la région 19-86 aa. La structure tertiaire a également été prédite (Figure 3b). Les huit cystéines de ce domaine ont abouti à quatre liaisons disulfure (CYS26 et CYS69, CYS30 et CYS64, CYS43 et CYS50, et CYS52 et CYS85), maintenant la stabilité de la protéine (Figure 3b). Pour valider le ou les sites d'interaction putatifs dans MaCFEM85, sept versions mutées de la protéine ont été générées et insérées dans pGBKT7 en tant que protéines appâts. Chaque vecteur recombinant a été co-transfecté avec AD-MsWAK16-ED dans la souche Y2H Gold. La souche avec CYS52 muté ne s'est pas développée sur un milieu sélectif (Figure 3c, entourée en rouge), ce qui indique que CYS52 est requis pour l'interaction de MaCFEM85 avec MsWAK16-ED.
2.5. L'interaction de MaCFEM85 avec MsWAK16 active la réponse immunitaire des plantes
2.5.1. Évaluation du rôle de MaCFEM85 et MsWAK16 dans la résistance aux maladies contre B. cinerea
Pour explorer l'implication possible de MaCFEM85 et MsWAK16 dans les réponses de défense des agents pathogènes, nous avons examiné si la surexpression de MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85 et MsWAK16 pourrait conférer une résistance accrue à B. cinerea. Nous avons exprimé de manière transitoire ces vecteurs dans les feuilles de N. benthamiana. Un test Western blot a montré que MaCFEM85 et MsWAK16 étaient exprimés à des niveaux comparables lorsqu'ils étaient exprimés seuls ou ensemble, ce qui montre que MaCFEM85 et MsWAK16 ont été exprimés avec succès dans le tabac (Figure 4a). Des tests de maladie ont également été effectués en utilisant N. benthamiana infiltré avec MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 ou le contrôle GFP. Les lésions étaient significativement plus petites (d'environ 30 % 2 jours après l'inoculation) sur les feuilles infiltrées avec MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 par rapport aux plantes témoins (Figure 4b). Ces données démontrent que l'expression transitoire de MaCFEM85 chez N. benthamiana confère une résistance accrue à B. cinerea et que MaCFEM85 et MsWAK16 régulent positivement la réponse de défense contre B. cinerea.
Figure 3. Identification du site d'interaction entre MaCFEM5 et MsWAK16.
Figure 4. Induction de la résistance des plantes par expression transitoire de MaCFEM85 et MsWAK16.
2.5.2. Évaluation du rôle de MaCFEM85 et MsWAK16 dans la défense contre les pucerons chez N. benthamiana
Pour étudier plus en détail le rôle de MaCFEM85 et de MsWAK16, des plantes de N. benthamiana exprimant de manière transitoire MaCFEM85 et MsWAK16 ont été infestées par M. persicae et les populations ont été évaluées. Pour cette expérience, une grande surface de chaque feuille de N. benthamiana a été agro-infiltrée avec le vecteur binaire recombinant pYBA1132 contenant MaCFEM85 et MsWAK16. GFP a été utilisé comme contrôle. 12 h après l'infiltration, 2 0 adultes de M. persicae ont été mis en cage sur chaque feuille, exposant la zone infiltrée aux pucerons. Dans les trois jours suivants, la mortalité des pucerons adultes et le nombre de nymphes ont été enregistrés ; les nymphes ont ensuite été enlevées. Il n'y avait pas de différence significative dans le risque de mortalité parmi les populations de M. persicae se nourrissant de plantes exprimant MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3,65827, DF=3, p < 0,30081. ) (Figure 4c). Cependant, à 24, 48 et 72 h, le nombre moyen de descendants produits par chaque puceron adulte était significativement plus élevé sur N. benthamiana exprimant le contrôle GFP par rapport à ceux exprimant MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 (Figure 4d).
2.5.3. Évaluation du rôle de MaCFEM85 et de MsWAK16 dans l'accumulation d'hormones et l'expression génique liée aux hormones
Pour analyser les différences entre les réponses de défense des plantes de N. benthamiana exprimant eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 et MaCFEM85+MsWAK16, nous avons mesuré les niveaux de JA, SA et de flavonoïdes totaux, ainsi que l'expression des gènes associés. Les résultats ont montré que les niveaux de JA et de SA différaient entre les plantes exprimant eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 et MaCFEM85+MsWAK16 (Figure 5a). Par rapport à celles exprimant l'eGFP, les niveaux de JA étaient significativement inférieurs chez les plantes exprimant MaCFEM85 ; Les niveaux de SA ont légèrement augmenté, mais les différences n'étaient pas significatives. En revanche, les plantes exprimant MsWAK16 ne présentaient aucune différence significative dans les niveaux de JA par rapport au contrôle eGFP, alors que les niveaux de SA étaient significativement inférieurs à ceux du contrôle (Figure 5a). Les niveaux de JA et de SA étaient significativement augmentés et diminués, respectivement, dans les plantes exprimant MaCFEM85+MsWAK16 par rapport à l'eGFP.
Figure 5. Niveaux hormonaux et expression des gènes de réponse hormonale
La teneur totale en flavonoïdes était significativement plus élevée dans les plantes exprimant MaCFEM85+MsWAK16 par rapport à tous les autres groupes de traitement (Figure 5a). Les niveaux d'expression des gènes biosynthétiques étaient similaires chez les plantes exprimant MsWAK16 et MaCFEM85+MsWAK16. Par exemple, les gènes liés à la réponse JA, à savoir COI1, MYC2 et PDF1.2, étaient significativement régulés positivement par rapport aux plantes exprimant la GFP (Figure 5b). De même, les gènes NPR1, WRKY70 et PR1 liés à la SA étaient exprimés de manière significativement différentielle dans les plantes exprimant MsWAK16 et MaCFEM85+MsWAK16 ; NPR1 était régulé positivement, alors que WRKY70 et PR1 étaient régulés négativement par rapport au contrôle (Figure 5b). Nous avons également examiné l'expression de gènes clés dans les voies de synthèse de l'acide shikimique et des phénylpropanoïdes, toutes deux liées à la synthèse des flavonoïdes. En général, l’expression de MaCFEM85 seule n’a pas induit une expression significativement plus élevée de ces gènes dans le tabac. Cependant, ces gènes étaient régulés positivement dans le tabac exprimant MsWAK16 ou MsWAK16+MaCFEM85 par rapport au contrôle GFP (Figure 5c).
cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire
3. Discussion
3.1. Le motif protéique CFEM conservé remplit de multiples fonctions chez les espèces fongiques
Le domaine CFEM est unique aux champignons et est couramment présent dans les protéines membranaires extracellulaires fongiques. Le domaine trouve son origine dans l'ancêtre commun le plus récent d'Ascomycota et de Basidiomycota (33). Des recherches récentes ont montré que les protéines CFEM présentes dans les agents pathogènes fongiques peuvent agir comme régulateurs immunitaires des plantes, provoquant une suppression ou une activation immunitaire de la plante hôte en fonction du type d'infection (28,34,35). Il y a eu peu de rapports sur des protéines contenant le domaine CFEM chez M. anisopliae, uniquement dans le contexte d'une comparaison évolutive avec d'autres champignons (36). Dans cette étude, nous avons comparé les protéines CFEM de M. anisopliae avec d'autres protéines CFEM connues chez des champignons pathogènes et non pathogènes. Nous avons confirmé que l'homologue le plus proche de MaCFEM85 est Cfem5 trouvé chez Beauveria bassiana, l'une des 12 protéines CFEM de cette espèce (Figure supplémentaire S1). BbCfem5 est essentiel à l’acquisition du fer [37]. De plus, sur la base de la structure tertiaire prédite, le domaine CFEM dans MaCFEM85 est très similaire à la protéine antigène de surface 2 (CSA2) trouvée chez Candida albicans (CPRobin) Berkhout, dans laquelle 65 résidus (96 % de la séquence) ont été modélisés avec 99,8 % de confiance [31]. Candida albicans est un pathogène animal ; CSA2 joue un rôle important dans la croissance et la pathogénicité en extrayant l'hème de l'hémoglobine et en transportant l'hème de la paroi cellulaire vers le plasma (38-40). Nous émettons l'hypothèse que MaCFEM85 pourrait être impliqué dans la virulence de M. anisopliae chez les insectes hôtes. Ces fonctions combinées de MaCFEM85 dans l’infection pathogène animale et l’activation de l’immunité végétale font de cette protéine un futur axe de recherche passionnant.
3.2. Les liaisons disulfure sont des structures importantes pour la fonction des protéines
L'intégrité conformationnelle d'une structure protéique est directement liée à sa capacité à fonctionner. Les liaisons disulfure formées par les paires de cystéine favorisent le repliement des protéines et la stabilité conformationnelle et sont considérées comme formant des sites clés pour la reconnaissance et la liaison de récepteurs ou de ligands spécifiques (41). Par exemple, la rupture de l’une des trois liaisons disulfure conservées dans la protéine effectrice AVR4 du pathogène végétal Cladosporium fulvum entraîne une sensibilité à la protéase et une capacité réduite de liaison à la chitine (42). Dans trois autres protéines de C. fulvum (ECP1, ECP2 et ECP5), des substitutions uniques d'alanines aux cystéines atténuent la réponse hypersensible de la tomate, indiquant que les cystéines sont essentielles au maintien de la stabilité et de l'activité induisant une réponse hypersensible (43). De plus, dans la protéine mature MC69 de Magnaporthe oryzae, la mutagenèse de deux résidus cystéine conservés (Cys36 et Cys46) peut altérer la fonction du MC69 sans affecter la sécrétion, suggérant l'importance de la liaison disulfure spécifiquement dans la pathogénicité du MC69 (44). Le domaine CFEM semble être similaire en taille et dans la configuration des résidus cystéine aux domaines de type EGF, qui contiennent trois ou quatre paires de liaisons disulfure. Les protéines EGF peuvent fonctionner comme des récepteurs de surface cellulaire, des transducteurs de signaux ou des molécules d'adhésion dans les interactions hôte-pathogène (45). Dans cette étude, nous avons non seulement constaté que le domaine CFEM de MaCFEM85 contenait huit cystéines conservées formant quatre paires de liaisons disulfure (Figure 3b), mais nous avons également validé que CFEM était le domaine critique pour l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16. De plus, grâce à une mutation dirigée vers le site des résidus de cystéine en alanine, nous avons constaté que le résidu de cystéine en position 52 était le site central requis pour l'interaction (Figure 3c). Ces résultats constituent une base pour des études plus approfondies sur les fonctions physiologiques de l'interaction CFEM85 – WAK16.
3.3. L'interaction de MaCFEM85 avec les défenses végétales activées par MsWAK16
Dans les interactions microbiennes-plantes, les réponses de défense des plantes sont généralement activées par des protéines effectrices microbiennes. La défense induite devient un outil important dans la lutte biologique contre les ravageurs pour promouvoir la résistance. Les protéines CFEM ont été identifiées comme effecteurs impliqués dans la régulation de l'activation ou de l'inhibition immunitaire des plantes (28, 46). Cependant, peu de recherches publiées relient la régulation de ces facteurs immunitaires à leurs rôles spécifiques dans les maladies des plantes et la résistance des insectes. Dans cette étude, nous avons utilisé un champignon entomopathogène et endophyte, M. anisopliae, pour identifier une interaction entre MaCFEM85 et une kinase associée à la paroi cellulaire, MsWAK16, chez M. sativa. Les résultats ont montré que cette interaction réduisait le taux de lésions après inoculation avec B. cinerea (Figure 4b) et diminuait le taux de croissance de la population de M. persicae (Figure 4d), indiquant que l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16 augmentait la résistance de M. sativa aux pucerons. Les changements dans les niveaux de JA, SA et d'éthylène (ET) peuvent être utilisés comme marqueurs pour évaluer l'induction de la résistance des plantes (47, 48). Ici, nous avons démontré que MaCFEM85 interagissait avec MsWAK16 pour influencer la résistance des plantes via la régulation hormonale et pour inhiber le taux de reproduction de M. persicae (Figure 4d). Des études similaires ont été rapportées précédemment. Par exemple, il a été démontré que la protéine effectrice PeBL1 de Brevibacillus laterosporus induisait une accumulation de JA et de SA dans les tomates et diminuait le taux de croissance des populations de deuxième et troisième générations de M. persicae qui se nourrissaient de ces plantes. De plus, les plants de tomates pulvérisés avec des effecteurs ont un effet répulsif sur M. persicae [49]. L'application de la protéine élicitrice PeBC1 au haricot commun (Phaseolus vulgaris L.) entraîne des effets sublétaux prononcés et significatifs sur les pucerons verts du pêcher. Les plantes traitées avec PeBC1 présentent une régulation positive significative des gènes liés à JA et SA (50). L'éliciteur PeBb1 de Beauveria bassiana réduit la fécondité de M. persicae sur le tabac et induit l'expression de gènes liés à JA et ET (51). Dans la présente étude, l'expression transitoire de MaCFEM85 et de MsWAK16 dans le tabac a significativement régulé positivement les gènes COI1, MYC2 et PDF1.2 liés à la réponse à l'AJ (Figure 5b) et a augmenté la teneur en JA et en flavonoïdes totaux (Figure 5a), ce qui était comparable aux résultats. dans la littérature comme décrit ci-dessus. Cependant, nous n'avons pas détecté de niveaux élevés de SA dans le tabac 12 h après l'infiltration, et les plantes exprimant de manière transitoire MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 ont montré des niveaux de SA significativement réduits et une régulation négative des gènes impliqués dans la réponse SA (Figure 5a, b). . Cela a démontré que la stimulation de différentes hormones végétales peut conduire non seulement à des activités synergiques, mais également à des interférences et à des rétroactions, permettant aux plantes de répondre de manière appropriée à différents stimuli. Des niveaux accrus de JA mais de faibles niveaux de SA ont déjà été signalés dans les plantes. Par exemple, chez A. thaliana déficient pour l'accumulation de SA, les niveaux de JA étaient 25- fois plus élevés que chez A. thaliana de type sauvage, et les gènes sensibles à JA ont été activés (52). Il a également été rapporté que certaines bactéries peuvent augmenter les niveaux de JA dans les plantes pour inhiber l'accumulation de SA, évitant ainsi les dommages causés par la SA. Par exemple, Pseudomonas syringae cible le récepteur COI1 via une toxine, la coronatine, qui régule négativement la voie JA (53). Cela favorise la régulation positive induite par MYC2- des facteurs de transcription ANAC019, ANAC055 et ANAC072 [54], inhibant la transcription d'ICS1 (un gène clé pour la synthèse de SA) et régulant ainsi à la baisse la production de SA et la transduction du signal. Dans la présente étude, l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16 a conduit à une accumulation accrue de JA et à une régulation positive des gènes sensibles à la JA, mais à une inhibition de l'accumulation de SA et de la transcription des gènes liés à la SA. Cela indique que l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16 induisait l'JA, améliorant ainsi la résistance des plantes aux pucerons.
Chez N. benthamiana exprimant de manière transitoire MaCFEM85 et MsWAK16, les taux de JA ont augmenté et la taille des lésions de B. cinerea a diminué (Figure 4b), conformément aux études précédentes. JA est impliqué dans la résistance des plantes aux insectes et aux pathogènes nécrotrophes [52,55]. En tant qu'agent pathogène nécrotrophe, B. cinerea était inhibé par l'accumulation de JA et d'ET (56). Chez le mutant ein2-1 déficient en ET d'A. thaliana et le mutant coi1-1 à réponse JA, les niveaux du gène de défense en aval, PDF1.2, ont été significativement réduits et la sensibilité à B. cinerea a été améliorée. 57]. Nous avons constaté ici que l'accumulation de JA et la transcription des gènes liés à la JA étaient significativement augmentées chez N. benthamiana exprimant de manière transitoire MaCFEM85 et MsWAK16, alors que l'accumulation de SA et la transcription des gènes liés à la SA étaient inhibées. L'expression de MaCFEM85 et MsWAK16 a également montré un effet inhibiteur sur B. cinerea. Cela indique que JA était activé par MaCFEM85 et MsWAK16 et jouait un rôle de premier plan dans la résistance des plantes à B. cinerea.
4. Matériels et méthodes
4.1. Souches fongiques, matériel végétal et méthodes de culture
Les souches d'isolat de Metarhizium anisopliae Ma 9 ont été cultivées sur un milieu pomme de terre-sucre-gélose (PSA) (200 g d'extrait de pomme de terre pelée bouilli dans l'eau, 20 g de saccharose et 15 g de gélose/L). De la poudre de sporange fraîche a été collectée après 10 jours. Les plantes de Nicotiana benthamiana ont été cultivées dans une chambre climatique artificielle avec un cycle lumière/obscurité de 14/10 h (27/25 ◦C). Pour l'expression génique transitoire via une transformation médiée par Agrobacterium, la souche GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens a été cultivée dans un milieu Luria Broth (LB) (10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCl/L). La souche de levure Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine) a été cultivée sur un milieu d'extrait de levure peptone dextrose (YPDA) (10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 20 g de glucose et 0,03 g d'hémisulfate d'adénine/L). Pour chaque vecteur et souche, des antibiotiques appropriés ont été utilisés, à savoir la rifampicine, la kanamycine ou l'ampicilline (25, 50 ou 50 µg/mL, respectivement). Les souches et plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S1. Les graines de Medicago sativa ont été stérilisées en surface avec 75 % d'éthanol pendant 1 min, suivi de 50 % de NaClO (5,5 %) pendant 15 min. Les graines ont été soigneusement mélangées puis lavées dans de l’eau stérile trois fois pendant 5 minutes chacune. Les graines ont été incubées à 4 °C dans l’obscurité pendant plus de 24 h, puis ont germé sur des plaques de gélose à 1 % d’eau à température ambiante pendant la nuit. Trois jours après la germination, les plants en développement ont été transférés sur du papier filtre dans des boîtes de Pétri stériles de 9- cm, avec 20 plants par boîte. Les traitements et le contrôle ont été répartis respectivement sur 15 plats chacun. Les plants ont ensuite été irrigués avec 10 ml de suspension de spores de M. anisopliae contenant 107/mL, et le contrôle a été irrigué avec 10 ml d'eau stérile. À 0, 12, 24, 48 et 60 h, une sélection aléatoire de plants a été prélevée dans trois boîtes de Pétri pour chaque intervalle de temps. Les échantillons ont été congelés dans de l'azote liquide et conservés à -80 ◦C.
4.2. qRT-PCR et construction de plasmides
L'ARN total a été extrait de M. anisopliae (hyphes) et de M. sativa (racines) avec le réactif TRIzol (Invitrogen, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. La qualité et l'abondance de l'ARN résultant ont été mesurées avec un NanoPhotometer® (Implen, Münich, Allemagne). La synthèse de l'ADNc du premier brin (jusqu'à 2 µg d'ARN) a été réalisée à l'aide de 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canada) en suivant les instructions du fabricant. La qRT-PCR a été réalisée en utilisant 2 × SYBR Green qPCR Master Mix de US EVER BRIGHT ® INC. et le système ABI QuantStudio 5 en suivant les instructions du fabricant. Les amorces utilisées pour chaque gène sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S2. Maury [58], Msactin [59] et Nbactin [60] ont été utilisés comme gènes de référence internes pour la normalisation des données d'expression. La réaction a été réalisée dans les conditions suivantes : 5 min à 95 ◦C, suivies de 40 cycles à 95 ◦C pendant 15 s et à 60 ◦C pendant 40 s. Il y avait trois répétitions techniques pour chaque échantillon. L'expression relative a été calculée à l'aide de la méthode 2−∆∆Ct [61]. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) et du test à plages multiples de Duncan dans SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Expression transitoire de protéines chez N. benthamiana
La séquence codante (CDS) de MaCFEM85 a été amplifiée avec l'ADN polymérase ultra-fidélité en utilisant l'ADNc comme matrice. Pour les tests de localisation subcellulaire, les produits de PCR contenant le CDS pour MaCFEM85 ont été clonés dans pYBA1132-eGFP (digéré avec EcoRI et SalI) et pcambia1300-cherry (EcoRI et SacI), respectivement. Toutes les constructions ont été validées par séquençage (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Pékin, Chine). Les amorces utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S2. Pour l'expression transitoire de MaCFEM85-eGFP et MaCFEM85-mCherry dans N. benthamiana, la souche GV3101 de A. tumefaciens a été transformée avec chaque plasmide et vérifiée par PCR. L'Agrobacterium a été cultivée pendant une nuit à 28 °C sous agitation. Les cellules ont été collectées par centrifugation de 5 min à 5 000 tr/min à température ambiante, lavées trois fois avec de l'eau bidistillée stérile et remises en suspension dans un tampon MgCl2 10 mM (contenant 10 mM de MES et 10 mM d'acétosyringone, pH 5,7). La suspension cellulaire a été ajustée à une DO600 de 0,5, puis infiltrée dans la face inférieure de feuilles de N. benthamiana âgées de 4- à 5- semaines avec une seringue de 1- mL. Chaque feuille a été infiltrée avec 50 µL d’A. tumefaciens ; trois feuilles ont été traitées par plante et trois plantes se trouvaient dans chaque groupe de traitement. Les feuilles traitées ont été collectées après 30 h et visualisées avec un microscope confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Allemagne) pour déterminer la localisation sous-cellulaire.
les bienfaits du cistanche pour les hommes renforcent le système immunitaire
4.4. Analyse phylogénétique
Un arbre phylogénétique a été construit à l'aide de la méthode de jonction de voisins dans MEGA X. 1 000 répétitions bootstrap utilisaient le modèle de distance P. Les séquences d'acides aminés utilisées pour générer l'arbre ont été obtenues grâce à des recherches BLASTP dans la base de données NCBI de champignons apparentés (par exemple, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum). , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana et Paecilomyces lilacinus) en utilisant MaCFEM85 comme requête.
4.5. Dosages de levure à deux hybrides
Le système à deux hybrides Matchmaker Gold Yeast (Clontech Laboratories, Inc.; maintenant Takara Bio USA, Inc.) a été utilisé pour vérifier l'interaction entre MaCFEM85 et MsWAK16. MaCFEM85 sans le peptide signal a été introduit dans pGBKT7 comme appât et le domaine extracellulaire de MsWAK16 (MsWAK16-ED) a été inséré dans pGADT7 comme proie. La préparation et les transformations de cellules compétentes pour la levure ont été réalisées à l'aide d'un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. Les plasmides appâts et proies ont été co-transformés dans la souche de levure Gold. Les interactions protéine-protéine ont été analysées sur la base de la croissance sur des plaques de milieu SD à double abandon (DDO, SD/-Trp-Leu) et SD à quadruple abandon (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. Test BiFC
Pour générer les constructions BiFC, les vecteurs pUC-SPYNE et pUC-SPYCE ont été linéarisés par digestion avec BamHI. Les CDS complets de MaCFEM85 et MsWAK16 ont chacun été clonés et insérés dans les plasmides linéarisés à l'aide d'une enzyme recombinante pour obtenir les constructions MaCFEM85-YFPN et MsWAK16-YFPC. Les plasmides contenant MaCFEM85 et MsWAK16 ont été co-transformés avec des vecteurs vides comme contrôles négatifs (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE et pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Tous les vecteurs ont été introduits dans N. benthamiana via une transformation médiée par Agrobacterium comme décrit ci-dessus. Des signaux de fluorescence ont été observés dans les cellules épidermiques des feuilles à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Allemagne). Les amorces utilisées pour la construction de vecteurs sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S2.
4.7. Test déroulant GST
Pour les tests déroulants GST, MsWAK16-ED a été inséré dans le vecteur pGEX-6P-2 et MaCFEM85 a été inséré dans pET-21b. Les protéines de fusion purifiées (GST- MsWAK16- ED) et la protéine à vide pGEX-6P-2 sans charge (GST) ont été utilisées comme protéine d'appât et pET purifié-21 La protéine de fusion b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) a été utilisée comme proie. Les tests pulldown GST ont été effectués avec le système de purification de protéines Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Shanghai, Chine) en suivant les instructions du fabricant. En bref, les Mag-Beads ont été lavées cinq fois avec une solution saline tamponnée au phosphate 1 × (PBS, pH 7,4) pour libérer le protecteur d'alcool et 10 ml de GST ou GST-MsWAK16-ED ont ensuite été ajoutés. Les billes ont été mélangées par inversion à température ambiante pendant 30 min. Après avoir éliminé le surnageant, les Mag-Beads ont été lavées cinq fois avec du PBS 1 ×. His-MaCFEM85 a été ajouté à des Mag-Beads déjà liés à la GST et le mélange a été incubé toute la nuit à 4 ◦C avec rotation. Les billes ont ensuite été lavées cinq fois avec du PBS 1 × pour éliminer les protéines non liées. Ensuite, les protéines immobilisées sur les billes ont été séparées par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de nitrocellulose (100 V, 1 h) et analysées par Western blot. Les membranes ont été lavées trois fois pendant 10 minutes chacune avec du PBS + Tween (PBST). Les membranes ont été bloquées pendant 2 h à température ambiante avec 5 % de lait écrémé, puis incubées avec l'anticorps monoclonal de souris ProteinFind anti-His (TransGen Biotech, Pékin, Chine) (dilué au 1 : 3000) ou l'anticorps monoclonal de souris ProteinFind anti-GST pendant 2 heures. h à 4 ◦C. Les membranes ont ensuite été immergées dans l'anticorps IgG (H + L) (HRP) anti-lapin de chèvre ProteinFind (TransGen Biotech, Pékin, Chine) (dilué au 1: 5000) pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été visualisées avec le kit EasySee® Western Blot (TransGen Biotech, Pékin, Chine) en suivant les instructions du fabricant.
4.8. Identification du site clé dans MaCFEM85
Pour déterminer la taille requise pour l'interaction de MaCFEM85 avec MsWAK16, une amplification PCR a été réalisée pour générer plusieurs formes tronquées de MaCFEM85. Le domaine CFEM (MaCFEM85-CFEM ; résidus aa 19–86) et le terminal C sans le domaine CFEM (MaCFEM85-C, résidus aa 87–170) ont été insérés dans le vecteur pGBKT7 comme protéine d'appât (tableau supplémentaire S1). Cinq autres variantes ont été construites en utilisant la synthèse polypeptidique pour muter la cystéine en alanine aux positions 26, 30, 43, 52 et 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552 et ∆CFEM858, respectivement). Ces variantes ont été utilisées pour réaliser des expériences Y2H avec MsWAK16-ED. La croissance des cellules de levure transformées a été testée sur des plaques synthétiques SD/-Trp-Leu et des plaques SD/-Trp-Leu-His-Ade contenant de la X- -Galactosidase (X- -Gal).
4.9. Tests de résistance des plantes
Myzus persicae ont été obtenus auprès de Henan Quanying Biological Co., Ltd. Une semaine avant le début des essais biologiques, 150 pucerons adultes ont été placés sur trois plantes de N. benthamiana (50 pucerons par plante). Après 72 h, tous les adultes ont été retirés avec un pinceau doux et les nymphes ont été autorisées à se nourrir pendant quatre jours supplémentaires avant d'être transférées à N. benthamiana pour les tests de performance des pucerons.
4.10. Tests de performance des pucerons
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales : Solanaceae) a été utilisée pour évaluer les performances de M. persicae, la résistance des plantes aux maladies contre B. cinerea et l'expression de gènes liés aux hormones. Les agrobactéries portant soit pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 ou pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 ont été cultivées dans du LB supplémenté avec des antibiotiques appropriés pendant 36 h à 28 °C. Les cellules ont été lavées trois fois, puis remises en suspension dans un tampon d'infiltration (MgCl2 10 mM, MES 10 mM et acétosyringone 100 µM, pH 5,6) jusqu'à une DO600 de 0,6. Pour la co-infection, les bactéries portant MaCFEM85 et MsWAK16 ont été ajustées à une DO600 de 1,2, puis mélangées en volumes égaux. Les feuilles entièrement développées ont été infiltrées de bactéries à l'aide de seringues sans aiguille de 1- ml. Trois feuilles ont été infiltrées sur chaque plante et chaque traitement a été appliqué à trois plantes pour un total de 12 plantes par expérience.
Pour les tests de performance des pucerons, 20 pucerons adultes ont été appliqués sur la zone infiltrée de chaque feuille 12 h après l'application d'Agrobacterium. Les pucerons ont été confinés à l'aide de cages à clips de 5 mm de diamètre. Chaque traitement a été répété cinq fois. La mortalité des pucerons adultes et le nombre de nymphes nouvellement pondues ont été enregistrés quotidiennement pendant trois jours. B. cinerea a été cultivé pendant cinq jours le PDAY. 12 heures après l'infiltration d'Agrobacterium, le B. cinerea nouvellement cultivé a été enfoncé dans un gâteau de champignon de 5- mm et la surface de croissance du mycélium a été attachée à la zone d'infiltration à la surface de la feuille. Pour faciliter le développement de la maladie, les plantes ont été maintenues humides en les recouvrant d'un film plastique dans des plateaux à 22 ◦C pour faciliter la progression de la maladie. Après 48 h, la progression de la maladie a été estimée dans les feuilles inoculées en mesurant la taille des lésions. Pour quantifier l'expression relative des gènes pertinents, les trois feuilles infiltrées ont été collectées sur chaque plante 12 h après l'infiltration, puis congelées dans de l'azote liquide et stockées à -80 degrés. L'extraction de l'ARN total, la synthèse de l'ADNc et la qRT-PCR ont été réalisées comme décrit dans la section 3.2. Les niveaux d'acide salicylique (SA), d'acide jasmonique (JA) et de flavonoïdes ont été mesurés dans 15 feuilles de N. benthamiana infiltrées par traitement. Les feuilles ont été récoltées, congelées dans de l'azote liquide, puis conservées à −80 degrés. Les hormones végétales ont été quantifiées à l'aide des kits ELISA d'acide salicyclique végétal et d'acide jasmonique végétal (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), et les flavonoïdes ont été quantifiés à l'aide du kit de dosage des flavonoïdes micro-plantes (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) suivant les instructions du fabricant.
4.11. Analyses statistiques
Les données ont été analysées dans SPSS v20.0. Des différences significatives dans les niveaux d'expression de MaCFEM85 et de MsWAK16 ont été déterminées à l'aide du test t de Student. Des différences significatives dans les niveaux de SA, JA et flavonoïdes ont été déterminées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle et du test à plages multiples de Duncan avec un seuil de p < 0,05.
5. Conclusions
Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle protéine sécrétée, MaCFEM85, chez M. anisopliae. Il s’est avéré qu’il s’agissait d’un effecteur conservé capable d’interagir avec MsWAK16 et d’activer la réponse de défense de N. benthamiana. Nous avons montré que le domaine CFEM et le résidu cystéine en position 52 dans MaCFEM85 étaient critiques pour l'interaction. Cette interaction peut activer des réponses immunitaires liées à l’AJ et des mécanismes de résistance aux maladies et aux insectes chez la plante.
Les références
1. Paulucci, Nouvelle-Écosse; Anta, GG; Gallarato, Louisiane ; Vicario, JC; Cesari, Alberta; Reguera, YB; Kilmurray, C. ; Bueno, MA; García, MB ; Dardanelli, MS Partenariats plantes-microbes : implications pour la croissance et la santé des plantes. Dans Symbiose des microbes végétaux : principes fondamentaux et avancées ; Springer : Berlin/Heidelberg, Allemagne, 2013 ; pp. 105-117. [Référence croisée]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Démêler les interactions plantes-microbes : la transcriptomique multi-espèces peut-elle aider ? Tendances Biotechnologie. 2012, 30, 177-184. [Référence croisée]
3. Sassé, J. ; Martinoia, E. ; Northen, T. Nourrissez vos amis : les exsudats végétaux façonnent-ils le microbiome des racines ? Tendances Plant Sci. 2018, 23, 25-41. [Référence croisée]
4. Lugtenberg, B. ; Kamilova, F. Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes. Ann. Révérend Microbiol. 2009, 63, 541-556. [Référence croisée]
5. Shoresh, M. ; Harman, GE; Mastouri, F. Résistance systémique induite et réponses des plantes aux agents de biocontrôle fongiques. Ann. Révérend Phytopathol. 2010, 48, 21-43. [Référence croisée]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E. ; Pineda, A. ; Guillod, L. ; Bouwmeester, KJ; van Loon, J. ; Dicke, M. ; Raaijmakers, JM Modifications métaboliques et transcriptomiques induites chez Arabidopsis par la rhizobactérie Pseudomonas fluorescens SS101. Physiol végétal. 2012, 160, 2173-2188. [Référence croisée]
7. Lareen, A. ; Burton, F. ; Schafer, P. Communication racine-microbe des plantes dans la formation des microbiomes racinaires. Plante Mol. Biol. 2016, 90, 575-587. [Référence croisée]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Le champignon pathogène des insectes Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) est également un endophyte qui stimule le développement des racines des plantes. Suis. J. Bot. 2012, 99, 101-107. [Référence croisée]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonisme du champignon pathogène des insectes endophytes Metarhizium robertsii contre le pathogène des plantes du haricot Fusarium solanif. sp. phaseoli. Peut. J. Pathologie végétale. 2013, 35, 288-293. [Référence croisée]
10. Ahmad, moi ; Jiménez-Gasco, MdM ; Luthé, DS ; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii favorise la croissance du maïs, supprime la croissance des insectes et modifie l'expression des gènes de défense des plantes. Biol. Contrôle 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T. ; Petcharat, V. Induction de réponses de défense chez les fruits de Hong Kong (Aglaia dookkoo Griff.) contre les champignons de la pourriture des fruits par Metarhizium guizhouense. Biol. Contrôle 2017, 111, 40-44. [Référence croisée]
12. Hao, K. ; Wang, F. ; Nong, X. ; McNeill, M. ; Liu, S. ; Wang, G. ; Cao, G. ; Zhang, Z. Réponse des racines d'arachide Arachis hypogaea à la présence de champignons bénéfiques et pathogènes par analyse du transcriptome. Sci. Rep.2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, ZM ; Mahapatra, R. ; Jampala, SSM Chapitre 11 — Rôle des éliciteurs fongiques dans le mécanisme de défense des plantes. Dans Aspects moléculaires des microbes bénéfiques pour les plantes en agriculture ; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., éd. ; Presse académique : Cambridge, MA, États-Unis, 2020 ; 143-158. [Référence croisée]
14. Dong, X. ; Sa, JA Éthylène et résistance aux maladies des plantes. Curr. Avis. Biol végétal. 1998, 1, 316-323. [Référence croisée] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K. ; Penninckx, IA ; Mauch-Mani, B. ; Vogelsang, R. ; Cammué, BP ; Broekaert, WF Des voies de défense-réponse distinctes, dépendantes du jasmonate et du salicylate, chez Arabidopsis sont essentielles pour la résistance à des agents pathogènes microbiens distincts. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 1998, 95, 15107-15111. [Référence croisée] [PubMed]
16. Pantalon, SR ; Irigoyen, S. ; Liu, J. ; Bèdre, R. ; Christensen, SA ; Schmelz, EA; Sedbrook, JC ; Scholthof, K.-BG ; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine ammoniac lyase (PAL) Favorise les défenses antivirales contre le virus de la mosaïque Panicum et ses satellites. mBio 2021, 12, e03518-20. [Référence croisée]
17. Liu, R. ; Xu, S. ; Li, J. ; Hu, Y. ; Lin, Z. Profil d'expression d'un gène PAL d'Astragalus membranaceus var. Mongholicus et son rôle crucial dans le flux de la biosynthèse des flavonoïdes. Représentant des cellules végétales. 2006, 25, 705-710. [Référence croisée]
18. De Geyter, N. ; Gholami, A. ; Goormachtig, S. ; Goossens, A. Machineries transcriptionnelles dans le métabolisme secondaire des plantes provoqué par le jasmonate. Tendances Plant Sci. 2012, 17, 349-359. [Référence croisée]
19. Mirjalili, N. ; Linden, JC Effets de la composition en phase gazeuse sur les cultures en suspension de Taxus cuspidata. Biotechnologie. Bioeng. 1995, 48, 123-132. [Référence croisée]
20. Li, ST; Zhang, P. ; Zhang, M. ; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS ; Guo, AY; Yu, LJ Profil transcriptionnel des cellules de taxus chinensis en réponse au jasmonate de méthyle. Génome BMC. 2012, 13, 295. [Réf. croisée]
21. Tugizimana, F. ; Ncube, EN; Steenkamp, Pennsylvanie ; Dubery, IA Metabolomics a dérivé des informations sur la manipulation de la synthèse des terpénoïdes dans les cellules de Centella asiatica par le jasmonate de méthyle. Biotechnologie végétale. Rapport 2015, 9, 125-136. [Référence croisée]
22. Lu, M. ; Wong, H. ; Teng, W. Effets de l'élicitation sur la production de saponine dans la culture cellulaire de Panax ginseng. Rep. de cellules végétales. 2001, 20, 674-677. [Référence croisée]
23. Mandal, S. ; Kar, moi.; Mukherjee, AK ; Acharya, P. Réponses de défense induites par l'éliciteur chez Solanum lycopersicum contre Ralstonia solanacearum. Sci. Monde J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L. ; Wang, S. ; Yang, X. ; François, F. ; Qiu, D. L'éliciteur de protéine PeaT1 a amélioré la résistance contre les pucerons (Sitobion avenae) dans le blé. Gestion antiparasitaire. Sci. 2020, 76, 236-243. [Référence croisée] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Extension du rôle physiologique de l'hélicase hexamérique DnaB. Tendances Biochimie. Sci. 2003, 28, 116-118. [Référence croisée]
26. Vaknine, Y. ; Shadkchan, Y. ; Levdansky, E. ; Morozov, M. ; Romano, J. ; Osherov, N. Les trois protéines ancrées GPI dans le domaine CFEM d'Aspergillus fumigatus (CfmA-C) affectent la stabilité de la paroi cellulaire mais ne jouent pas de rôle dans la virulence fongique. Fongique. Genet. Biol. 2014, 63, 55-64. [Référence croisée]
27. Zhao, S. ; Shang, X. ; Bi, W. ; Yu, X. ; Liu, D. ; Kang, Z. ; Wang, X. ; Wang, X. Identification à l'échelle du génome de candidats effecteurs avec des motifs conservés du champignon de la rouille des feuilles du blé Puccinia triticina. Devant. Microbiol. 2020, 11, 1188. [Réf. croisée]
28. Gong, A. ; Jing, Z. ; Zhang, K. ; Tan, Q. ; Wang, G. ; Liu, W. Analyse bioinformatique et caractérisation fonctionnelle des protéines CFEM chez le champignon anthracnose du maïs Colletotrichum graminicola. J. Intégré. Agricole. 2020, 19, 541-550. [Référence croisée]
29. Martin, F. ; Aerts, A. ; Ahren, D. ; Brun, A. ; Danchin, par exemple ; Duchaussoy, F. ; Gibon, J. ; Kohler, A. ; Lindquist, E. ; Pereda, V. ; et coll. Le génome de Laccaria bicolor donne un aperçu de la symbiose mycorhizienne. Nature 2008, 452, 88-92. [Référence croisée]
30. Stefan, V. ; Lara, RJ Champignons entomopathogènes comme endophytes : interactions plante-endophyte-herbivore et perspectives d'utilisation en lutte biologique. Curr. Sci. 2015, 109, 46-54.
31. Cai, N. ; Liu, R. ; Yan, D. ; Zhang, N. ; Zhu, K. ; Zhang, D. ; Nong, X. ; Tu, X. ; Zhang, Z. ; Wang, G. Analyse bioinformatique et caractérisation fonctionnelle des protéines CFEM de Metarhizium anisopliae. J. Champignons. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C. ; Hammond-Kosack, KE ; et Kanyuka, K. WAKsing, immunité des plantes et diminution des maladies. J. Exp. Bot 2022, 73, 22-37. [Référence croisée]
33. Zhang, ZN; Wu, QY ; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z. ; Zou, CG Des analyses systématiques révèlent le caractère unique et l'origine du domaine CFEM chez les champignons. Sci. Rep.2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Croc, A. ; Gao, H. ; Zhang, N. ; Zheng, X. ; Qiu, S. ; Li, Y. ; Zhou, S. ; Cui, F. ; Sun, W. Un nouveau gène effecteur SCRE2 contribue à la pleine virulence d'Ustilaginoidea virens sur le riz. Devant. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W. ; Wei, W. ; Wu, Y. ; Zhou, Y. ; Peng, F. ; Zhang, S. ; Chen, P. ; Xu, X. BcCFEM1, une protéine contenant un domaine CFEM avec un site putatif ancré au GPI, est impliquée dans la pathogénicité, la production de conidies et la tolérance au stress chez Botrytis cinerea. Devant. Microbiol. 2017, 8, 1807. [Réf. croisée]
36. Xu, X. ; Li, G. ; P'tit.; Su, Z. ; Chen, C. Analyse comparative à l'échelle du génome des récepteurs putatifs couplés aux protéines G liés à Pth11- chez les champignons appartenant à Pezizomycotina. Microbiol BMC. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J. ; Zhang, H. ; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL ; Feng, MG ; Ying, SH Les contributions systématiques du domaine CFEM contenant des protéines à l'acquisition du fer sont essentielles pour l'interaction interspécifique du champignon pathogène filamenteux Beauveria bassiana. Environ. Microbiol. 2022, 24, 3693-3704. [Référence croisée] [PubMed]
38. Roy, U. ; Kornitzer, D. Acquisition de fer hémique chez les champignons. Curr. Avis. Microbiol. 2019, 52, 77-83. [Référence croisée] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K. ; Kikuchi, Y. ; Kokubu, E. ; Sato, Y. ; Ishihara, K. Csa2, membre de la famille des protéines Rbt5, est impliqué dans l'utilisation du fer provenant de l'hémoglobine humaine lors de la croissance des hyphes de Candida albicans. FEMS Levure Rés. 2014, 14, 674-677. [Référence croisée]
40. Pérez, A. ; Pedros, B. ; Murgui, A. ; Casanova, M. ; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Formation de biofilm par des mutants de Candida albicans pour des gènes codant pour des protéines fongiques présentant le domaine CFEM contenant huit cystéines. FEMS Levure Rés. 2006, 6, 1074-1084. [Référence croisée]
41. Hogg, PJ Les liaisons disulfure comme commutateurs pour la fonction des protéines. Tendances Biochimie. Sci. 2003, 28, 210-214. [Référence croisée]
42. van den Burg, HA; Westerink, N. ; François, KJ; Roth, R. ; Woestenenk, E. ; Boeren, S. ; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Les mutants naturels perturbés par liaison disulfure d'AVR4 du pathogène de la tomate Cladosporium fulvum sont sensibles à la protéolyse, contournent la résistance médiée par Cf-4-, mais conservent leur capacité de liaison à la chitine. J. Biol. Chimique. 2003, 278, 27340-27346. [CrossRef] 43. Hu, K. ; Cao, J. ; Zhang, J. ; Xia, F. ; Clé.; Zhang, H. ; Xie, W. ; Liu, H. ; Cui, Y. ; Cao, Y. ; et coll. Amélioration de multiples caractères agronomiques par un gène de résistance aux maladies via le renforcement de la paroi cellulaire. Nat. Plantes 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H. ; Fujisawa, S. ; Mitsuoka, C. ; Ito, A. ; Hirabuchi, A. ; Ikeda, K. ; Irieda, H. ; Yoshino, K. ; Yoshida, K. ; Matsumura, H. ; et coll. Une perturbation génétique à grande échelle chez Magnaporthe oryzae identifie MC69, une protéine sécrétée nécessaire à l'infection par des agents pathogènes fongiques monocotylédones et dicotylédones. Pathog PLoS. 2012, 8, e1002711. [Référence croisée] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Un domaine CFEM contenant huit cystéines unique à un groupe de protéines membranaires fongiques. Tendances Biochimie. Sci. 2013, 28, 118-121. [Référence croisée] [PubMed]
46. Peng, J. ; Wu, L. ; Zhang, W. ; Zhang, Q. ; Xing, Q. ; Wang, X. ; Li, X. ; Yan, J. Identification systémique et caractérisation fonctionnelle des protéines membranaires extracellulaires fongiques communes chez Lasiodiplodia theobromae. Devant. Scie végétale. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R. ; Jones, JD Rôle des hormones végétales dans les réponses de défense des plantes. Plante Mol. Biol. 2009, 69, 473-488. [Référence croisée]
48. Verma, V. ; Ravindran, P. ; Kumar, PP Régulation des réponses au stress par les hormones végétales. Biol végétal BMC. 2016, 16, 86. [Référence croisée]
49. Javed, K. ; Qiu, D. L'éliciteur de protéine PeBL1 de Brevibacillus laterosporus améliore la résistance contre Myzus persicae chez la tomate. Pathogènes 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A. ; Hanan, A. ; Nazir, T. ; Majeed, MZ; Qiu, D. Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de l'éliciteur PeBC1 extrait de Botrytis cinerea impliqué dans l'induction de la résistance contre le puceron vert du pêcher (Myzus persicae) chez les haricots communs (Phaseolus vulgaris L.). Insectes 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Nazir, T. ; Hanan, A. ; Basit, A. ; Majeed, MZ; Anwar, T. ; Nawaz, moi; Qiu, D. Rôle putatif d'un éliciteur de protéine encore non caractérisé PeBb1 Dérivé de Beauveria bassiana ARSEF 2860 Souche contre Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) chez Brassica rapa ssp. pékinensis. Pathogènes 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A. ; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ ; Buchala, AJ; Métraux, JP; Brun, R. ; Kazan, K. ; et coll. NPR1 module les échanges croisés entre les voies de défense dépendantes du salicylate et du jasmonate grâce à une nouvelle fonction dans le cytosol. Cellule végétale 2003, 15, 760-770. [Référence croisée]
53. Xin, XF ; Lui, SY Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 : un agent pathogène modèle pour sonder la sensibilité aux maladies et la signalisation hormonale des plantes. Ann. Révérend Phytopathol. 2013, 51, 473-498. [Référence croisée] [PubMed]
54. Zhang, X. ; Wang, C. ; Zhang, Y. ; Soleil, Y. ; Mou, Z. La sous-unité complexe médiatrice d'Arabidopsis16 régule positivement la résistance systémique acquise médiée par le salicylate et les voies de défense induites par le jasmonate/éthylène. Cellule végétale 2012, 24, 4294-4309. [Référence croisée] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J. ; Conconi, A. ; Ryan, CA L'acide salicylique inhibe la synthèse des inhibiteurs de protéinase dans les feuilles de tomate induite par la systémique et l'acide jasmonique. Physiol végétal. 1995, 108, 1741-1746. [Référence croisée] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Léon-Reyes, A. ; Van der Ent, S. ; Van Wees, SC Mise en réseau des hormones à petites molécules dans l'immunité des plantes. Nat. Chimique. Biol. 2009, 5, 308-316. [Référence croisée]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A. ; Métraux, JP; Broekaert, WF L'activation concomitante des voies de réponse au jasmonate et à l'éthylène est nécessaire pour l'induction d'un gène de défensine végétale chez Arabidopsis. Cellule végétale 1998, 10, 2103-2113. [Référence croisée]
58. Croc, W. ; Bidochka, MJ Expression de gènes impliqués dans la germination, la conidiogenèse et la pathogenèse chez Metarhizium anisopliae par RT-PCR quantitative en temps réel. Mycol. Rés. 2006, 110, 1165-1171. [Référence croisée]
59. Guerriero, G. ; Legay, S. ; Hausman, JF Expression du gène de la luzerne cellulose synthase sous stress abiotique : guide de l'auto-stoppeur sur la normalisation de la RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [Référence croisée]
60. Yang, Y. ; Zhang, Y. ; Li, B. ; Yang, X. ; Dong, Y. ; Qiu, D. Une pectate lyase de Verticillium dahliae induit des réponses immunitaires des plantes et contribue à la virulence. Devant. Scie végétale. 2018, 9, 1271. [Réf. croisée]
61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Analyse des données d'expression relative des gènes à l'aide de la PCR quantitative en temps réel et de la méthode 2(-Delta Delta C(T)). Méthodes 2001, 25, 402-408. [Référence croisée]
