L'état actuel de la neuroprotection dans les cardiopathies congénitales, partie 3

3.2. Évaluation semi-quantitative de l'ADN mitochondrial ectopique

Les images de coloration Hsp60 (la matrice mitochondriale) et de coloration d'histone-H2B (le marqueur nucléaire) ont été soustraites des images de coloration d'ADNdb. Ensuite, grâce à la fonction « AdjustThreshold » du logiciel lmage] (National Institutes of Health), les images ont été binarisées.

Les mitochondries sont les usines d'énergie des cellules, chargées de synthétiser l'ATP pour fournir l'énergie nécessaire aux cellules. La matrice mitochondriale est le liquide interne des mitochondries, qui contient une variété d’enzymes et d’ions et constitue un site clé pour diverses réactions biochimiques des mitochondries. La mémoire est l’une des capacités cognitives les plus importantes de l’être humain. Bien que les deux puissent sembler sans rapport, ils sont étroitement liés.

La recherche montre une interaction entre la matrice mitochondriale et la mémoire. Les enzymes et les ions de la matrice mitochondriale peuvent affecter directement l'excitabilité des neurones en régulant le métabolisme énergétique et l'état des canaux ioniques dans les cellules neuronales, affectant ainsi la mémoire. De plus, il existe une variété de molécules de signalisation dans la matrice mitochondriale, qui peuvent être transmises aux neurones en aval via les axones et les synapses des neurones, affectant l'efficacité de transduction du signal des neurones, affectant ainsi la formation et la consolidation de la mémoire.

Dans le même temps, l’activité de la mémoire affecte également directement l’état de la matrice mitochondriale. Les activités de mémoire augmenteront la consommation d'énergie des neurones et favoriseront la réaction redox dans la matrice mitochondriale, affectant ainsi le niveau métabolique des mitochondries et l'équilibre ionique intracellulaire, affectant ainsi l'excitabilité et l'efficacité de transduction du signal des neurones.

Par conséquent, le maintien d’une bonne santé mitochondriale est crucial pour maintenir une bonne fonction de mémoire. En maintenant de bonnes habitudes de vie, comme une alimentation régulière, une activité physique modérée, un sommeil suffisant, etc., vous pouvez contribuer à maintenir la santé de la matrice mitochondriale. En outre, la fonction de mémoire peut également être améliorée grâce à une intervention pharmaceutique appropriée pour favoriser les réactions biochimiques et la signalisation au sein de la matrice mitochondriale.

Dans la vie quotidienne, nous pouvons exercer la mémoire de plusieurs manières, comme la lecture, l'étude, la réflexion, les jeux, etc. Dans le même temps, nous devons également prêter attention au maintien d'une bonne santé afin de mieux maintenir la santé de la matrice mitochondriale. Je crois que grâce à ces efforts, nous aurons sûrement une meilleure mémoire et nous ferons mieux face aux divers défis de la vie et du travail. On voit que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire, car Cistanche deserticola peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance. Ces substances sont très importantes pour la mémoire et l’apprentissage. En outre, Cistanche deserticola peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutriments et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau.

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Nous avons sélectionné des points d'ADNdb dont la taille varie de 2 à 20 um' (circularité 0.1-1.0) à l'aide de la fonction "Analyser-Analyser les particules". si nécessaire, les images originales ont été examinées pour le décompte final. Si le signal de l'histone H2B était faible. puis les images soustraites montraient des structures en forme de beignet.

Ceux-ci représentent des ADNdb cytosoliques d'origine nucléaire et doivent être éliminés de la quantité d'ADNdb cytosolique d'origine mitochondriale. La gamme de taille peut être modifiée en fonction du type cellulaire ou de l'origine des échantillons histologiques. La figure lE montre un exemple de comptage d'ADN mitochondrial ectopique

points en utilisant 1B D.

Alternativement, les images de coloration Hsp60 ont été soustraites des images de coloration ADNdb. Ensuite, le nombre d'ADNdb poncta a été compté à l'aide des fonctions « Ajuster le seuil « Analyser-Analyser les particules ». Par la suite, les ADNdb poncta sans le signal d'histone-H2B ont été comptés par observation directe. Cette dernière méthode convient lorsque les images d'histone-H2B présentent un faible rapport signal/bruit.

Dans l’ensemble, cette méthode peut clairement montrer l’ADN mitochondrial ectopique s’infiltrant dans le cytoplasme et permet une évaluation objective et statistique de cet ADN mitochondrial ectopique dans les cellules.

4. Discussion

Dans notre étude, nous avons développé une méthode permettant le comptage de l’ADN mitochondrial cytoplasmique. La détection de l'ADN mitochondrial cytoplasmique a été rapportée à l'aide de techniques d'immunofluorescence, mais les méthodes n'étaient pas quantitatives pour l'évaluation de l'ADN mitochondrial cytoplasmique dans la plupart des cas (15, 25). Dans une autre étude, une PCR par gouttelettes a été réalisée pour quantifier l'ADN mitochondrial en circulation (9).

récemment, Sato et al. [26,27] ont publié un excellent protocole pour évaluer l'ADN cytoplasmique par microscopie par immunofluorescence en utilisant les anticorps Lamin B1 (LMNB1) comme marqueur de structure nucléaire et la sous-unité 4 de la cytochrome c oxydase (COX4) comme marqueur de structure mitochondriale. Ce protocole semble très utile pour quantifier l’ADNdb cytoplasmique d’origine nucléaire.

Cependant, lorsque nous avons essayé COX4 ou d’autres marqueurs membranaires mitochondriaux, incluant des marqueurs internes et externes, il était très difficile de distinguer avec précision le cytoplasme des mitochondries.

Par exemple, si nous observions des signaux circulaires à l'aide d'un marqueur de membrane mitochondriale et observions des signaux d'ADNdb à l'intérieur, alors cet ADNdb pourrait représenter soit l'ADN mitochondrial à l'intérieur des mitochondries circulaires (normales), soit l'ADN mitochondrial cytoplasmique à l'extérieur des mitochondries en forme de beignet (ectopique). Nous avons donc utilisé Hsp60 comme marqueur marquant la matrice mitochondriale pour évaluer l'ADN mitochondrial ectopique dans le cytoplasme.

Comme décrit dans une revue récente [23], il existe de nombreux types différents d’ADN cytoplasmique d’origine nucléaire, et la plupart d’entre eux sont positifs pour les marqueurs histones. En raison de la limitation de la combinaison d'anticorps utilisée pour la triple coloration, nous avons utilisé l'histone H2Bas, un marqueur d'histone.

Cependant, si cette limitation est résolue, H2AX pourrait être un meilleur marqueur pour l’ADN double brin cytoplasmique d’origine nucléaire. L'ADNdb cytoplasmique négatif pour l'histone-H2B a été rarement observé dans les cellules HeLa témoins utilisées dans cette étude, mais un tel ADNdb d'origine nucléaire peut être présent si d'autres lignées ou conditions cellulaires sont utilisées.

L'hybridation in situ de l'ADN mitochondrial utilisée dans notre récent article convient à une évaluation qualitative, mais il pourrait être difficile d'utiliser l'hybridation in situ pour une évaluation quantitative [8].

L'hybridation in situ expose l'échantillon à des températures élevées, ce qui peut entraîner une déformation ou du bruit dans certaines parties de l'échantillon. D'autre part, la méthode immunocytochimique présentée dans cet article peut obtenir des signaux avec un faible bruit de fond. Dans notre article récent, dans les cellules humaines et le poisson zèbre utilisés comme modèles de la maladie de Parkinson, nous avons montré que l'ADN mitochondrial s'échappait dans le cytoplasme, ce qui est toxique pour le cellules. Nous avons également observé que la quantité d'ADN mitochondrial cytosolique était augmentée dans les tissus cérébraux post-mortem de patients atteints de la maladie de Parkinson [8].

Ces éléments de preuve suggèrent qu'une quantité accrue d'ADN mitochondrial ectopique s'échappant des mitochondries peut induire une inflammation aiguë et chronique entraînant diverses maladies, notamment la maladie de Parkinson et l'insuffisance cardiaque ; ainsi, la régulation positive de la dégradation de l'ADN cytosolique ou l'inhibition de ses capteurs pourraient être une cible thérapeutique potentielle pour ces maladies (8, 28).

La méthode présentée dans cet article pour l'évaluation quantitative de l'ADN mitochondrial ectopique constitue un outil important pour la poursuite des recherches dans ce domaine.

Contributions des auteurs : HM et MTH ont formulé les hypothèses, conçu la majorité des expériences, réalisé les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. NM a réalisé les expériences liées aux cellules en culture. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement : Ce travail a été soutenu par des subventions de l'AMED (numéros de subvention JP21gm6110028 et JP19dm0107154 (HM)), de la Takeda Science Foundation (HM), de JSPS KAKENHI (numéros de subvention JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) et JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D ; numéro de subvention JPMJMS2024 (HM)) et subventions d'aide du TBRF (numéro de subvention TBRF-RF 21-135 (HM)).

Déclaration de disponibilité des données : Les données et les outils décrits dans ce manuscrit sont disponibles sur demande.

Remerciements : Nous remercions Shinano Kobayashi pour sa participation à des discussions utiles et son soutien continu. Nous remercions la Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) pour avoir fourni une bourse postdoctorale TBRF aux chercheurs étrangers à MH (TBRF-RF 21-135).

Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Les références

1. Li, XD ; Wu, J. ; Gao, D. ; Wang, H. ; Soleil, L. ; Chen, ZJ Rôles essentiels de la signalisation cGAS-cGAMP dans la défense antivirale et les effets immunoadjuvants. Sciences 2013, 341, 1390-1394. [Référence croisée] [PubMed]

2. Ansari, MA ; Dutta, S. ; Veettil, MV; Dutta, D. ; Iqbal, J. ; Kumar, B. ; Roy, A. ; Chikoti, L. ; Singh, VV ; Chandran, B. L'acétylation induite par la reconnaissance du génome de l'herpèsvirus de l'IFI16 nucléaire est essentielle pour sa translocation cytoplasmique, son inflammasome et ses réponses à l'IFN. Pathog PLoS. 2015, 11, e1005019. [Référence croisée] [PubMed]

3. Orzalli, MH ; Broekema, Nouveau-Mexique ; Dîner, BA ; Hancks, DC ; Elde, Caroline du Nord ; Cristée, IM ; Knipe, la stabilisation de IFI16 médiée par DM cGAS favorise la signalisation innée lors de l'infection par le virus de l'herpès simplex. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT ; Portnoy, DA c-di-AMP sécrété par Listeria monocytogenes intracellulaire active une réponse de type Iinterféron de l'hôte. Sciences 2010, 328, 1703-1705. [Référence croisée] [PubMed]

5. Dou, Z. ; Ghosh, K. ; Vizioli, MG; Zhu, J. ; Sen, P. ; Wangensteen, KJ; Simithy, J. ; Lan, Y. ; Lin, Y. ; Zhou, Z. ; et coll. La chromatine cytoplasmique déclenche l'inflammation lors de la sénescence et du cancer. Nature 2017, 550, 402-406. [Référence croisée]

6. Takahashi, A. ; Butin.; Okada, R. ; Kamachi, F. ; Watanabe, Y. ; Wakita, M. ; Watanabe, S. ; Kawamoto, S. ; Miyata, K. ; Barbier, GN ; et al. La régulation négative des DNases cytoplasmiques est impliquée dans l'accumulation d'ADN cytoplasmique et la SASP dans les cellules sénescentes. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [Réf. croisée]

7. McArthur, K. ; Whitehead, LW; Huddleston, JM; P'tit.; Padman, BS ; Oorschot, V. ; Geoghegan, ND; Chappaz, S. ; Davidson, S. ; Chin, HS ; et coll. Les macropores BAK/BAX facilitent la hernie mitochondriale et l'efflux d'ADNmt pendant l'apoptose. Sciences 2018 359, eaao6047. [Référence croisée]

8. Matsui, H. ; Ito, J. ; Matsui, N. ; Uechi, T. ; Onodera, O. ; Kakita, A. L'ADNdb cytosolique d'origine mitochondriale induit une cytotoxicité et une neurodégénérescence dans des modèles cellulaires et de poisson zèbre de la maladie de Parkinson. Nat. Commun. 2021, 12, 3101. [Réf. croisée]

9. Sliter, DA ; Martinez, J. ; Hao, L. ; Chen, X. ; Soleil, N. ; Tara, D. ; Fischer, TD; Birmanie, JL; Li, Y. ; Zhang, Z. ; et coll. Parkin et PINK1 atténuent l'inflammation induite par STING. Nature 2018, 561, 258-262. [Référence croisée]

10. Hou, Y. ; Wei, Y. ; Lautrup, S. ; Yang, B. ; Wang, Y. ; Cordonnier, S. ; Mattson, député ; Croteau, DL; Bohr, VA La supplémentation en NAD(+) réduit la neuroinflammation et la sénescence cellulaire dans un modèle murin transgénique de la maladie d'Alzheimer via cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. États-Unis 2021, 118, e2011226118.

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