L'effet des substances humiques alimentaires sur l'immunité cellulaire et les caractéristiques sanguines des porcelets

Abstrait: L'objectif de cette étude était de déterminer l'impact des substances humiques alimentaires sur la réponse immunitaire et les profils sanguins des porcelets. Au total, 24 porcelets croisés (Slovakian White × Landrace ; âgés de 35 jours ; poids corporel moyen de 11,67 kg) ont été répartis en deux groupes alimentaires avec (expérimental ; 5 g·kg−1 ) ou sans (témoin ; 0 g·kg−1 ) supplémentation en substances humiques naturelles. Dans cette étude, nous avons observé une augmentation significative de la proportion de lymphocytes CD4+CD8- (p < {{10}}.001) dans le groupe expérimental. Les résultats ont également montré une tendance à l'augmentation de l'activité phagocytaire et de la capacité d'engloutissement des phagocytes ainsi que du nombre des autres sous-populations lymphocytaires surveillées (CD3+, CD21+, CD4-D 8+, CD4+CD8+, CD4+CD25+) chez les porcelets du groupe expérimental par rapport au groupe témoin. La supplémentation en substances humiques a augmenté la phosphatase alcaline sérique par rapport au groupe témoin (p < 0,05). Les autres paramètres sanguins surveillés n’ont pas été affectés de manière significative par le traitement diététique. Il a conclu que l’inclusion de substances humiques dans l’alimentation des porcelets pourrait avoir un effet stimulant sur l’immunité cellulaire, sans effet négatif sur les paramètres hématologiques et biochimiques.

Mots clés : substances humiques ; phagocytose; lymphocytaire; biochimie sanguine; hématologie; porcelets

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1. Introduction

Les substances humiques (HS) sont une classe de composés bioactifs organiques naturels non nutritifs formés dans les sols [1]. Ce sont des composants importants de l’humus dont la fonction principale est de transférer les nutriments du sol aux organismes vivants. HS inclut spécifiquement l’acide humique, l’acide fulvique et l’humine comme principaux constituants [2]. Ces composants sont essentiels à la croissance des plantes [3] et peuvent favoriser l'utilisation efficace des nutriments par la plante [4]. En raison de l'interdiction de l'utilisation d'antibiotiques comme stimulateurs de croissance dans l'Union européenne, l'intérêt pour les additifs alimentaires alternatifs pour la production animale a augmenté [5]. Au cours des deux dernières décennies, l’intérêt pour l’utilisation de l’HS en nutrition animale s’est accru [2,6]. De nombreux auteurs ont observé au cours de leurs études une amélioration des paramètres de production après l’ajout d’HS dans l’aliment. Ces dernières années, il a été démontré que l'HS ajouté à l'alimentation des animaux monogastriques tels que les porcs, les volailles et les lapins favorisait la croissance [7-10]. De plus, l’HS a été utilisée comme agent immunostimulateur, antidiarrhéique, analgésique et antimicrobien dans les pratiques vétérinaires (11-13). L'ajout de suppléments biologiquement actifs de nature humique à l'alimentation des animaux a stimulé les processus métaboliques et la digestibilité des nutriments et a également activé l'absorption de certains éléments minéraux [14]. D'autres études ont montré que l'HS contribue à réduire l'excrétion d'ammoniac du fumier et améliore le nombre relatif de lymphocytes sanguins. Les modifications mentionnées ci-dessus contribuent à l'immunité des animaux [2,8,15]. Cependant, en raison des différentes sources et types de préparations HS, ainsi que du fait qu'il n'existe pas de norme unique pour mesurer les véritables effets de HS, leur effet biologique dépend des spécifications. Sur la base de nos résultats précédents et de nos expériences d'études sur la volaille (poulets de chair et poules pondeuses) sur l'effet des substances humiques (à des concentrations de 0,8 % et 0,5 %, respectivement) sur l'état immunitaire et la réponse immunitaire, nous avons décidé de vérifier cet effet chez le porcelet. Nous avons observé une augmentation significative de l'activité phagocytaire et de la réponse des lymphocytes B, ainsi qu'une augmentation significative du ratio lymphocytes CD4+:CD8+ [16,17]. En général, la supplémentation en tant qu'additif alimentaire chez les porcs n'a pas été bien rapportée par rapport à la volaille, et les études scientifiques sur l'influence de la supplémentation en HS dans l'alimentation des porcs sur l'immunité et le métabolisme sont encore relativement limitées. Par conséquent, cette étude, en tant qu’essai pilote, a été réalisée pour évaluer l’effet d’une supplémentation en HS à 0,5 % sur les indicateurs immunitaires, ainsi que sur les variables biochimiques et hématologiques dans le sang des porcelets.

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2. Matériels et méthodes

2.1. Conception expérimentale

L'expérience a été réalisée conformément à la « Directive européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques » [18]. Les animaux ont été hébergés dans des écuries accréditées du Département de nutrition et d'élevage animaliers de l'Université de médecine vétérinaire de Košice, en Slovaquie, dans les conditions zoohygiéniques requises. Au cours de l'expérience, la température moyenne dans l'écurie était de 20,2 ± 1,5 ◦C et l'humidité relative était de 68,5 ± 4,8 %. L'essai a été approuvé par la commission d'éthique de l'Université de médecine vétérinaire et de pharmacie de Košice (protocole n° EKV/2022-11). Au total, 24 porcelets croisés (Slovakian White x Landrace) 35- d'un jour ont été divisés en deux groupes (n=12 ; 50 % de mâles et 50 % de femelles dans les deux groupes). Avant le début de l'expérience, un poids corporel (BW) moyen initial de l'animal de 11,68 ± 1,35 kg dans le groupe témoin et de 11,65 ± 1,34 kg dans le groupe expérimental a été enregistré. Les groupes expérimentaux suivants ont été inclus dans l'étude : le groupe témoin et le groupe expérimental, où le régime alimentaire du groupe expérimental a été complété par un supplément de 0,5 % d'HS. L'expérience a duré 4 semaines. Les mêmes régimes alimentaires pour les deux groupes ont été utilisés dans l'expérience (Tableau 1). L’introduction du supplément HS dans l’alimentation s’est faite au détriment de l’orge dans le groupe expérimental. Les porcs ont été nourris deux fois par jour avec des mélanges alimentaires complets. De l'eau potable était disponible pour les animaux à volonté pendant toute la période expérimentale. Les mélanges alimentaires complets de l'expérience ont été formulés selon les besoins nutritionnels de Šimeˇcek et al. [19]. Le complément alimentaire naturel HS (HUMAC® Natur AFM ; Humac, Ltd., Košice, Slovaquie) a été broyé et physiquement purifié avec de la Leonardite sans traitement chimique. Les mélanges alimentaires complets ont été analysés pour la matière sèche, les protéines brutes, les fibres brutes, les cendres totales, l'amidon et le phosphore total conformément au règlement de la Commission CE 152/2009 [20]. Le niveau de calcium et de sodium alimentaires a été analysé à l'aide de la méthode de la flamme d'un spectromètre d'absorption atomique (Unicam Solar 939, Camberley, Surrey, Royaume-Uni). Les valeurs énergétiques métabolisables des mélanges d'aliments complets ont été calculées avec la formule selon Šimeˇcek et al. [19].

2.2. Échantillonnage et mesures

Au cours de la semaine 4, le matin du dernier jour de l'expérience, des échantillons de sang ont été prélevés par ponction du sinus orbitaire sur tous les porcs individuellement dans les deux groupes pour une analyse ultérieure. Le sérum a été obtenu par centrifugation (3 000 tr/min pendant 30 min) et conservé à -20 ◦C jusqu'à l'analyse. Du sang hépariné a été utilisé pour déterminer les paramètres hématologiques, tester l’activité phagocytaire et identifier les sous-populations lymphocytaires.

Tableau 1. Formule et composition chimique des mélanges alimentaires pour porcs (tels que nourris).

2.2.1. Paramètres hématologiques et biochimiques sériques

Une formule sanguine complète a été réalisée avec un analyseur d'hématologie automatisé (analyseur d'hématologie scil Vet ABC ™, Allemagne). Les variables évaluées dans notre étude étaient la valeur de l'hématocrite (HCT), la concentration d'hémoglobine (Hb), le nombre de globules rouges (RBC), le volume corpusculaire moyen (VGM) et le nombre total de globules blancs (WBC). Les paramètres biochimiques sériques : protéines totales, albumine, glucose, urée, triglycérides, cholestérol, créatinine, aspartate aminotransférase (AST), phosphatase alcaline (ALP) et phosphore ont été mesurés à l'aide d'un analyseur de paillasse à accès aléatoire entièrement automatique (Ellipse, Italie). La concentration de calcium dans le sérum a été déterminée au moyen d'un spectromètre d'absorption atomique à flamme (Unicam Solar 939, Camberley, Surrey, Royaume-Uni).

2.2.2. Biomarqueur de la peroxydation lipidique

Les concentrations de produits de peroxydation lipidique (taux de malondialdéhyde, MDA) dans le sérum ont été mesurées sous forme de substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBAR) selon la méthode de modification spectrophotométrique décrite par Costa et al. [21]. En bref, des échantillons de sérum ont été mélangés à une solution composée d'acide trichloroacétique (15 % ; Merck, Darmstadt, Allemagne), d'acide thiobarbiturique (0,38 % ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et acide chlorhydrique (0,25 N ; Mikrochem, Pezinok, Slovaquie) et chauffé pendant 30 min au bain-marie bouillant. Après refroidissement dans l'eau glacée et centrifugation, l'absorbance du surnageant a été mesurée à 535 nm. La concentration de TBAR a été déterminée à partir de la courbe étalon préparée en utilisant du 1,1,3,3-tétraméth oxy propane (malondialdéhyde-bis (diméthylacétal) ; Acros Organics, Geel, Belgique). Les résultats ont été exprimés en nmol de MDA/mL de sérum.

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2.2.3. Test d'activité phagocytaire et identification des sous-populations lymphocytaires

Un test commercial Phagotest® (Celonic, Munich, Allemagne) a été utilisé pour déterminer l'activité phagocytaire et la capacité d'engloutissement des phagocytes. Les instructions du fabricant ont été suivies lors de la réalisation du test. Un test d’immunomarquage direct a été appliqué pour identifier des sous-populations sélectionnées de lymphocytes. Deux combinaisons d'anticorps monoclonaux anti-porcin conjugués de souris : CD3e/CD21 et CD4/CD8a/CD25 ont été utilisées conformément aux spécifications indiquées dans le tableau 2. Du sang hépariné en une quantité de 50 µL a été incubé avec des anticorps monoclonaux pendant 15 min dans l'obscurité. à température de laboratoire. Après incubation, 1 ml de solution de lyse BD FACS a été ajouté aux tubes. Les tubes ont été incubés pendant 20 minutes supplémentaires dans l'obscurité à température du laboratoire, puis centrifugés (300 x g pendant 5 min). Les culots cellulaires ont ensuite été lavés et centrifugés deux fois avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS; MP Biomedicals, Illkirch-Graffenstaden, France) à 300 × g pendant 5 min. Enfin, les cellules ont été remises en suspension dans 200 µL de PBS pour une analyse cytométrique ultérieure.

Tableau 2. Spécifications et quantités d’anticorps monoclonaux anti-porcin de souris utilisés.

L'analyse de l'activité phagocytaire ainsi que l'identification des sous-populations lymphocytaires ont été réalisées sur un cytomètre en flux BD FACSCantoTM à six couleurs (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, Californie, États-Unis) à l'aide du logiciel BD FACS DivaTM. La position des cellules analysées a été déterminée dans des diagrammes de points FSC vs SSC. Les granulocytes, les monocytes et les deux populations cellulaires ensemble, respectivement, ont été sélectionnés pour l'analyse de l'activité phagocytaire. Sur la base de la faible teneur en ADN dans l'histogramme de fluorescence rouge (FL-2), les agrégats bactériens ont été exclus d'une analyse plus approfondie. Le pourcentage de phagocytes actifs et l'intensité moyenne de fluorescence ont été déterminés dans l'histogramme de fluorescence verte (FL-1). Des lymphocytes fermés (Figure 1a, b) ont été utilisés pour l'identification des sous-populations de lymphocytes. Les lymphocytes CD3+ représentent les lymphocytes T et les lymphocytes CD21+ B (Figure 1c). La sous-population CD4+CD8- a été évaluée comme lymphocytes T auxiliaires, CD4-CD8+ comme lymphocytes cytotoxiques, CD4+CD8+ comme lymphocytes T doublement positifs (Figure 1d) et CD4+CD25+ en tant que lymphocytes T régulateurs (Figure 1e). Les proportions de lymphocytes sont exprimées en pourcentage.

2.3. Analyses statistiques

Les résultats ont été évalués statistiquement par un test t non apparié avec le logiciel statistique GraphPad Prism 8.0. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Les résultats obtenus dans cette expérience ont été exprimés en moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM).

Figure 1. Stratégie de synchronisation : (a) détermination de la position des lymphocytes (rouges) sur le dot plot de base (FSC-A versus SSC-A) ; (b) éliminer les doublets et les agglomérats de l'analyse ; (c) analyse de la représentation des lymphocytes CD3+ et CD21+ ; (d) analyse de la représentation des lymphocytes CD4+ et CD8+ ; (e) détermination de la représentation des lymphocytes CD4+CD25+ sur l'histogramme à partir de cellules positives CD4+ (portes en vert).

3. Résultats

3.1. Paramètres hématologiques et biochimiques sériques

Les effets de l'HS sur les profils sanguins hématologiques et biochimiques sont présentés dans le tableau 3. Les paramètres sanguins déterminés, notamment la teneur en globules rouges, globules blancs, hémoglobine, hématocrite, volume corpusculaire moyen, protéines totales, albumine, glucose, urée, triglycérides. , le cholestérol, la créatinine, l'AST, le Ca et le P n'ont pas été affectés par le traitement alimentaire par HS. Cependant, la supplémentation alimentaire en HS a augmenté l'activité de l'ALP (p < 0,05).

Tableau 3. Effet des substances humiques sur certains paramètres hématologiques et biochimiques sériques chez le porcelet

Le niveau sérique de TBAR, produits secondaires de la peroxydation lipidique (qui sont un paramètre important utilisé dans la détermination de la peroxydation lipidique), n'a pas été affecté par l'ajout d'HS.

3.2. Réponse immunitaire cellulaire

L'ajout d'HS à l'alimentation des porcelets n'a pas eu d'effet significatif sur le pourcentage de phagocytes actifs (Tableau 4) et la capacité d'engloutissement des phagocytes (Tableau 5). Les valeurs plus élevées de ces paramètres de réponse immunitaire innée ont été trouvées dans le groupe expérimental par rapport au groupe témoin.

Tableau 4. Effet des substances humiques sur l'activité phagocytaire dans le sang des porcelets évalué en pourcentage de phagocytes actifs - activité phagocytaire

Tableau 5. Effet des substances humiques sur la capacité d'engloutissement des phagocytes exprimé en intensité moyenne de fluorescence (MFI).

Figure 2. Suite.

Figure 2. Effet des substances humiques sur le pourcentage de lymphocytes : (a) CD3+ ; (b) CD21+ ; (c) CD4+CD8- ; (d) CD4-CD8+ ; (e) CD4+CD8+ ; (f) CD4+CD{{10}} ; et (g) le rapport des lymphocytes CD4:CD8 dans le sang des porcelets. La colonne marquée d'un astérisque est significativement différente du contrôle (*** p < 0,001).

4. Discussion

4.1. Réponse immunitaire cellulaire

L’objectif principal de notre étude était de suivre la manière dont les substances humiques (HS) affectaient différents indicateurs de l’immunité cellulaire. Le pourcentage de phagocytes actifs et leur capacité d'engloutissement ont été sélectionnés comme indicateurs pour surveiller l'effet sur l'immunité cellulaire innée. Dans notre étude précédente, il a été constaté que l'ajout d'HS à l'alimentation ({{0}},8 %) des poulets de chair augmentait significativement l'activité phagocytaire ainsi que l'intensité moyenne de la fluorescence (16). De plus, ELnaggar et El-Kelawy [22] ont observé une augmentation de l'activité phagocytaire et de l'indice phagocytaire après une supplémentation en acide humique dans l'alimentation (0.1, 0.2 et 0. 4%) de poulets Sacco. Des résultats similaires ont été obtenus avec des poules pondeuses [17]. Dans la présente étude, la supplémentation en HS dans l’alimentation des porcelets n’a eu aucun effet significatif sur la phagocytose. Cependant, le pourcentage de phagocytes actifs ainsi que leur capacité d'engloutissement étaient numériquement plus élevés chez les porcelets supplémentés en HS que chez les porcelets du groupe témoin. Selon Sanmiguel et Rondón [23], l'effet de l'HS sur les phagocytes dépend du temps. Ils ont constaté que la supplémentation en HS dans l'alimentation (0,1 et 0,2 %) des poules pondeuses augmentait l'indice phagocytaire aux jours 8 et 30 d'application, mais comparés à ceux de Wang et al. [2], qui ont découvert que les porcs dont l'aliment contenait 10 % d'HS avaient un nombre relatif de lymphocytes plus élevé. Des résultats similaires ont été obtenus pour des volailles nourries avec un régime enrichi de 0,15 % d'humate [24], ou complétées avec 20 mg d'acide humique/kg de poids corporel dans de l'eau de boisson [25]. Selon Cetin et al. [24], la supplémentation de l'alimentation des poules pondeuses avec des composés humiques entraîne une augmentation significative du nombre de lymphocytes, qui peut être attribuée à une production accrue d'IL-2, ainsi qu'à l'expression de l'IL{{29}. } récepteur sur les lymphocytes. Les substances humiques semblent améliorer l'activité des cellules productrices d'IL-2-. Cependant, d’autres auteurs n’ont observé aucun effet significatif sur le nombre de lymphocytes chez les porcs nourris avec des aliments supplémentés en acide humique [26] ainsi que chez les poulets ayant reçu des acides humiques dans leur eau de boisson [27] ou dans leur alimentation [22]. . Nos résultats sont similaires aux observations de Mudro ˇnová et al. [16], qui ont constaté que le pourcentage de lymphocytes CD4 était significativement augmenté chez les poulets de chair nourris avec une supplémentation en HS (0,8 %) par rapport au groupe témoin. Ils ont également noté une diminution significative des lymphocytes CD8+ (lymphocytes T cytotoxiques), ce qui a entraîné un rapport CD4:CD8 statistiquement plus élevé, utilisé comme marqueur de stimulation immunitaire. D'autre part, nourrir les poules pondeuses avec un régime à 0,5% d'HS a augmenté de manière significative la proportion de lymphocytes IgM+ qui représentent une sous-population de lymphocytes B et a réduit de manière significative la proportion de lymphocytes CD3+ qui représentent les lymphocytes T totaux. La proportion de lymphocytes T auxiliaires et T cytotoxiques n’était pas affectée [17]. Sur la base de nos résultats, ainsi que de diverses études, il s'ensuit que l'HS peut avoir un effet immunostimulateur qui peut être influencé par la composition et la quantité d'humates utilisés, le mode d'administration, l'espèce animale et, selon ELnaggar et El -Kelawy [22], par l'élevage d'animaux dans diverses régions du monde, différant par leur climat. L'immunomodulation de l'HS pourrait théoriquement consister en la formation de complexes d'humates avec des saccharides. Ces complexes se lient à la surface des lymphocytes T et des cellules NK et affectent leur fonction, notamment la production de cytokines, qui influencent également d'autres cellules du système immunitaire [28].

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4.2. Paramètre hématologique et biochimique sérique

Un autre objectif de cette étude était d'évaluer certains paramètres sanguins hématologiques et biochimiques de porcelets nourris avec des régimes supplémentés en HS. Aucune différence significative dans certaines variables du métabolisme protéique, énergétique et minéral, ainsi que dans les indices hématologiques, n'a été trouvée entre le groupe expérimental d'animaux recevant des suppléments alimentaires HS et le groupe témoin, à l'exception de l'activité ALP dans la présente étude. Les indicateurs biochimiques de notre étude se situaient dans la plage de référence chez tous les porcelets, selon Doubek et al. [29] et Kraft et Dürr [30]. Nos résultats sont conformes aux travaux antérieurs de Wang et al. [2], qui n'ont trouvé aucune altération significative des globules rouges et blancs au cours de leur étude visant à découvrir les effets de l'HS sur les variables sanguines chez les porcs en finition. Après un traitement avec un régime contenant de l'HS, Herzig et al. [31], ainsi que Šamudovská et Demeterová [32], ont observé une augmentation non significative de l'activité de l'ALP chez les poulets. Dans notre enquête, nous avons constaté que le groupe expérimental avait une activité ALP significativement plus élevée que le groupe témoin. Leurs valeurs, quant à elles, sont restées dans la plage de référence pour les niveaux d'ALP chez le porc (2–17 kat·L −1 ) [29,30]. En revanche, Jad'uttová et al. [33] et Rath et al. [34] ont remarqué une réduction significative de l'activité ALP chez les poulets après une alimentation avec HS. Les taux sanguins d'ALP chez les poulets de chair ayant reçu un complément alimentaire HS à 1,00 % ont diminué, selon ces auteurs. Bien que les valeurs diminuées de l'activité de l'ALP dans l'étude de Rath et al. [34] étaient statistiquement différentes des témoins, elles ne reflétaient aucun effet toxique de l'HS sur des organes sélectifs (muscle, rein, cœur ou foie). La quantité d’HS apportée par l’alimentation peut affecter la concentration de minéraux dans le sang. Les niveaux de calcium et de phosphore dans le sérum sanguin des porcelets n'ont pas été affectés par l'administration d'HS à une concentration de 0,5 %. La capacité de l’HS à chélater les métaux, qui est influencée par une quantité importante de chaînes latérales d’acide carboxylique, pourrait être à l’origine de la diminution des concentrations sériques minérales [34]. Dans notre étude, les concentrations de calcium et de phosphore dans le sang des porcelets n’ont pas diminué en dessous des valeurs de référence par l’ajout d’HS au mélange alimentaire du groupe expérimental. Le MDA est le produit de la peroxydation lipidique provoquée par les radicaux libres d'oxygène, qui peut être utilisé comme marqueur pour évaluer le statut antioxydant et la peroxydation lipidique [35]. Le MDA a été déterminé comme biomarqueur du stress oxydatif en mesurant les niveaux de substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBAR) dans le sang. Une diminution du stress oxydatif se caractérise par une réduction des taux de MDA. Des recherches antérieures ont montré que l'HS peut avoir des propriétés antioxydantes, protégeant contre divers troubles liés au stress oxydatif généralement provoqué par les radicaux libres. Par exemple, Wang et al. [15] ont constaté qu'une supplémentation alimentaire en humate de sodium (2000 mg·kg−1 ) pouvait améliorer le statut antioxydant des porcelets sevrés. Ils ont observé une réduction significative de la teneur en MDA du sérum, ainsi qu’une augmentation significative de la capacité antioxydante totale. Cependant, les HS sont des matériaux naturels de composition variable, qui peuvent entraîner une efficacité différente, qui peut également dépendre de la quantité administrée. Dans l’expérience actuelle, aucune variation n’a été observée dans les taux sériques de MDA (TBAR) des porcelets nourris avec HS par rapport au groupe témoin. Nos résultats sont cohérents avec ceux de Zhang et al. [36], qui ont constaté que l’ajout d’humate de sodium à l’alimentation (0,1, 0,3 et 0,5 %) des poules pondeuses n’avait aucun effet sur la capacité antioxydante totale du sérum ni sur les valeurs de MDA.

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5. Conclusions

Sur la base des résultats obtenus dans cette étude, on peut conclure qu'une supplémentation alimentaire avec 0,5 % de substances humiques pourrait avoir un effet stimulant sur certaines cellules immunitaires chez les porcelets. Il y a eu une augmentation significative de la proportion de lymphocytes CD4+CD8- dans le sang. La supplémentation en substances humiques a augmenté la PAL sérique. Ces valeurs restent toutefois dans la plage de référence. Les résultats ont montré que même une concentration aussi faible d’HS peut affecter positivement l’immunité cellulaire des porcelets. Étant donné que la concentration de substances humiques que nous avons choisie n'a eu un effet significatif que sur certains indicateurs de l'immunité cellulaire, des études supplémentaires seront nécessaires pour choisir une concentration appropriée et confirmer l'effet stimulant sur l'immunité dans cette catégorie d'animaux.

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