L'induction d'une immunité périphérique entraînée dans le pancréas incite à une activité anti-tumorale pour contrôler la progression du cancer du pancréas Partie 2

Discussion

Alors que le trafic de -glucane a déjà été caractérisé, le tropisme spécifique du -glucane vers le pancréas n'a pas été signalé auparavant37. Nous montrons que le -glucane particulaire peut circuler directement dans le pancréas et peut également être phagocyté par les macrophages qui se déplacent ensuite dans le pancréas. La relation entre la cavité péritonéale et le pancréas n'a pas été bien définie, et des études relatives à la physiopathologie de la pancréatite aiguë (PA) ont identifié que les macrophages péritonéaux sont un contributeur principal à la réponse inflammatoire dans la PA, soutenant ainsi une connexion entre le péritoine et le pancréas38.

Nos données d'imagerie montrent en effet que les macrophages péritonéaux qui phagocytent le WGP marqué par un isotope se dirigent principalement vers le pancréas. Des études sur les lésions hépatiques ont en outre soutenu ce modèle d'échange dynamique de cellules entre la cavité péritonéale et les organes solides qui est indépendant de la circulation 39. Ensemble, cela suggère que même dans des conditions homéostatiques, il existe un niveau basal d'échange de cellules immunitaires entre le pancréas et la cavité péritonéale qui peut être exploitée dans le cadre du -glucane particulaire.

Les macrophages sont une partie importante du système immunitaire inné du corps humain et ont des fonctions puissantes d'identification, de phagocytose et d'élimination des bactéries et des substances étrangères. La parodontite, une maladie infectieuse chronique caractérisée par une inflammation gingivale et une perte osseuse alvéolaire, est la principale cause de perte de dents chez les adultes. Il est maintenant clair que la destruction tissulaire de la parodontite est causée par la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection, et les macrophages, en tant que partie importante de la réponse immunitaire de l'hôte, jouent un rôle important dans l'apparition et le développement de l'inflammation.

Par conséquent, nous devons améliorer l'immunité dans notre vie quotidienne. Dans nos recherches, nous avons constaté que Cistanche peut renforcer l'immunité. Ajouter Cistanche dans de l'eau bouillante pour faire du thé Cistanche et le boire 1-2 fois par jour peut améliorer la fonction immunitaire du corps car il contient des ingrédients actifs, tels que des polysaccharides, des flavonoïdes, des alcaloïdes, etc., qui peuvent améliorer le fonction immunitaire du corps. Dans le même temps, l'ajout de Cistanche à la soupe ou à la bouillie, une ou deux fois par semaine, peut renforcer l'immunité.

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Bien que cette étude ait porté sur le WGP particulaire -glucane, il peut également être intéressant de déterminer si le -glucane dérivé de levure soluble présente un tropisme et un mécanisme de signalisation similaires dans le pancréas. Les -glucanes particulaires sont connus pour signaler directement via la Dectine-1, tandis que les -glucanes solubles fonctionneraient via une voie CR3-dépendante pour exercer leurs propriétés anti-tumorales40,41. Une étude a montré que l'administration IP de -glucane soluble entraînait un trafic vers le sang périphérique et les APC dans le péritoine, la rate et la moelle osseuse, indiquant que malgré les différents mécanismes de signalisation moléculaire, une capacité similaire à activer l'immunité entraînée pourrait être possible42. Cependant, étant donné que nos données indiquent que ce trafic dépend de la Dectine-1, seul le -glucane particulaire peut afficher un trafic direct vers le pancréas par le biais de particules et de solubles pouvant déclencher des mécanismes d'immunité entraînée.

De plus, des études antérieures qui caractérisent le trafic de -glucane soluble injecté par voie intraveineuse montrent un trafic vers la rate, les reins et le foie, mais ne mentionnent pas le tropisme vers le pancréas43. Comme le pancréas n'a pas été précédemment considéré comme une cible du trafic de -glucane, il n'est pas clair si le pancréas n'a tout simplement jamais été étudié ou s'il n'y a pas de trafic pancréatique.

Les études futures devraient porter sur la biodistribution des glucanes solubles et particulaires à travers diverses voies d'administration.

-Le trafic de glucane vers le pancréas a un impact multifactoriel sur les populations immunitaires présentes au sein du pancréas. Premièrement, l'arrivée de glucane dans le pancréas a un impact direct sur les populations de macrophages résidents M2 immunosuppresseurs présents dans le pancréas et connus pour être importants dans la promotion des tumeurs pancréatiques. Les données CyTOF et scRNA-Seq ont montré une disparition presque complète de la population de macrophages résidents 7 jours après l'administration de WGP. Fait intéressant, la disparition de la population de macrophages résidents coïncide directement avec une apparition réciproque d'une population de macrophages Ly6Clo. Cette population de macrophages Ly6Clo porte des marqueurs phénotypiques similaires à la population résidente, bien qu'elle penche davantage vers un phénotype M1.

Il est donc probable que les macrophages résidents entrent en contact avec le -glucane qui a acheminé vers le pancréas et que ces cellules se repolarisent, prenant ainsi un phénotype cellulaire différent qui entraîne la formation d'un cluster unique. Deuxièmement, l'arrivée de -glucane dans le pancréas entraîne une amplification de la signalisation des récepteurs de chimiokine/chimiokine qui recrute des macrophages pro-inflammatoires Ly6CHi infiltrant des monocytes de la périphérie vers le pancréas. Vingt-quatre heures après l'administration de WGP, les niveaux de CCL2 dans les lysats pancréatiques entiers sont augmentés de 30- fois. En conséquence, nous montrons que l'influx cellulaire robuste dépendant du -glucane vers le pancréas dépend de CCR2.

Alors que nous nous concentrons sur la dynamique du compartiment myéloïde en raison de l'importance observée de la signalisation CCR2/CCL2, il y a eu une amélioration initiale intéressante du groupe 11 au jour 3, puis une disparition au jour 7 après le traitement WGP. Le cluster 11 a été caractérisé comme ILC2 basé sur l'expression de plusieurs marqueurs tels que KLRG1, IL-5, IL-13 et ICOS. Les ILC2 sont connues pour être des cellules résidentes à long terme dans les tissus44. Des études récentes ont montré que l'activation des ILC2 locales par des alarmines tissu-spécifiques induit leur prolifération, la migration des ganglions lymphatiques et la dissémination sanguine. Il a été démontré que les ILC2 de plusieurs tissus, tels que l'intestin et les poumons, pénètrent dans le sang par extrusion à partir de ces tissus perturbés et migrent vers d'autres tissus tels que le foie44–46.

Un tel mécanisme pourrait expliquer l'augmentation initiale puis la disparition des ILC2 dans le pancréas. Étant donné que les ILC2 ont récemment été impliqués dans la réponse des tumeurs pancréatiques à l'immunothérapie, d'autres recherches sont nécessaires pour étudier l'impact du WGP et l'initiation d'une immunité entraînée sur la population ILC2 du pancréas.

Bien que l'initiation d'un afflux de cellules immunitaires pro-inflammatoires vers le pancréas soit en soi importante, c'est le CCR2 plus Ly6CHi infiltrant les populations de macrophages dérivés de monocytes à partir des caractéristiques d'affichage périphérique de l'immunité entraînée qui a les implications les plus importantes comme l'induction de l'immunité périphérique entraînée dans le pancréas n'a pas encore été caractérisée. Cette immunité entraînée induite est également associée à une reprogrammation métabolique et épigénétique.

Alors que CCR2 est connu pour être un récepteur important dans le recrutement des monocytes, c'est aussi la première indication que la signalisation CCR2 sur les monocytes est requise pour l'établissement d'une immunité entraînée périphérique. Il est à noter que le CCR2 plus les monocytes/macrophages ont été liés à la métastase et à la progression de la tumeur48,49. Cependant, nos données suggèrent que le recrutement de CCR2 reprogrammés et entraînés plus les monocytes/macrophages exercent des effets anti-tumoraux robustes.

Ceci est directement démontré par notre expérience de mélange où les souris qui ont reçu CCR2 plus des cellules myéloïdes de souris formées au WGP ont montré une charge tumorale considérablement réduite par rapport aux souris qui ont reçu des cellules myéloïdes CCR2- de la même souris entraînée.

Alors que nous montrons qu'une immunité entraînée périphérique s'est établie dans le pancréas, nous nous demandons si ces cellules pourraient être réactivées par des cellules tumorales ou leurs facteurs sécrétés. Il a été démontré que la réexposition de cellules myéloïdes pancréatiques formées par WGP in vivo à des milieux conditionnés par la tumeur provoquait vigoureusement une réponse entraînée. Kalafati et al. a récemment montré un rôle pour les granulocytes dans les mécanismes anti-tumoraux entraînés par l'immunité21, cependant, étant donné leur utilisation de modèles sous-cutanés de cancer, l'étude actuellement rapportée est la première instance suggérant que les cellules myéloïdes d'un organe spécifique peuvent être entraînées à réagir directement à cellules tumorales de ce même organe.

Il a été bien établi que les cellules myéloïdes sont capables de tuer directement les cellules tumorales par des mécanismes de phagocytose et de production de ROS50–54, et ici nous montrons que la formation de WGP régule à la hausse de manière significative les fonctionnalités anti-tumorales directes de la phagocytose améliorée des cellules tumorales et de la cytotoxicité médiée par les ROS pour cellules tumorales.

De plus, alors que nous soulignons que les milieux conditionnés par la tumeur peuvent réactiver les cellules myéloïdes entraînées, nous identifions également un facteur spécifique, le MIF, dans le milieu conditionné par la tumeur qui est impliqué dans cette activation. Ces données suggèrent que l'induction d'une immunité entraînée pourrait participer aux mécanismes d'immunosurveillance tumorale. Par exemple, dans les premiers stades du développement tumoral, les tumeurs sécrètent des facteurs solubles qui peuvent restimuler les cellules innées entraînées conduisant à l'éradication de ces cellules tumorales.

Nous traduisons ensuite cette compréhension du potentiel anti-tumoral des cellules myéloïdes innées entraînées qui pénètrent dans le pancréas vers des modèles orthotopiques de PDAC, où nous observons une diminution spectaculaire de la charge tumorale et une augmentation de la survie des souris avec une seule administration de WGP. Nous démontrons en outre que les cellules responsables du contrôle de la tumeur sont principalement formées de CCR2 plus des cellules dérivées de la myéloïde. Contrairement à d'autres modèles proposés de contrôle des tumeurs qui semblent être entièrement motivés par l'induction d'une immunité formée au niveau central dans le BM21, au lieu de cela, dans ce modèle, le trafic précoce de WGP vers le pancréas et la production résultante de CCL2 dans les recrues pancréatiques formées CCR2 plus les cellules myéloïdes de la périphérie qui sont principalement responsables des effets anti-tumoraux. Le trafic WGP directement vers le pancréas repolarise également les macrophages de type M 2- résidant dans les tissus vers des macrophages de type M 1- qui peuvent également freiner la progression tumorale.

Alors que la réduction tumorale observée chez les souris implantées avec des tumeurs KPC qui avaient été mélangées avec CCR2 plus des cellules entraînées était significative, elle n'était pas aussi frappante que chez les souris ayant reçu IP WGP. Cela confirme que les effets anti-tumoraux de l'IP WGP sont doubles ; le recrutement de CCR2 plus des cellules myéloïdes anti-tumorales entraînées dans le pancréas et la repolarisation des macrophages résidents pro-tumorigènes fonctionnent de concert pour susciter des réponses innées anti-tumorales qui conduisent à une réduction de la charge tumorale dans les modèles de PDAC.

Nous notons également la forte expression de MHCII sur ces monocytes/macrophages formés, qui joue probablement un rôle dans le traitement de l'antigène tumoral et la communication avec les lymphocytes T pour déclencher des réponses immunitaires adaptatives contre la tumeur. Fait intéressant, bien que nous ayons confirmé que ces mécanismes anti-tumoraux ne dépendent pas de réponses immunitaires adaptatives, nous avons observé une augmentation significative des cellules CD8 plus T présentes dans CCR2 plus tumeurs mixtes. De plus, étant donné qu'il a été observé que les cellules myéloïdes dans les tumeurs présentaient des niveaux élevés de PD-L1 et que la présence de cellules CCR2 plus entraînées dans le pancréas semblait recruter des lymphocytes T CD8 plus, nous avons estimé que le WGP pouvait potentialiser les effets des anti -Thérapie PD-L1.

Selon la littérature, la thérapie mAb anti-PD-L1 seule n'a eu aucun avantage en termes de survie, tandis que la combinaison de WGP et d'anti-PD-L1 s'est synergisée pour produire de meilleurs résultats de survie que le WGP seul55. Cela suggère que des cellules immunitaires innées entraînées peuvent activer des cellules immunitaires adaptatives dans le TME, cependant, le microenvironnement immunosuppresseur doit probablement être davantage surmonté par les effets concomitants de l'anti-PD-L1. Il est important de noter que malgré une survie améliorée, toutes les souris ont finalement succombé à la tumeur, de sorte que de futures enquêtes sur l'optimisation de ce traitement en termes de dosage et de nombre de traitements sont justifiées.

Les cellules myéloïdes immunosuppressives jouent un rôle essentiel dans la création du TME immunosuppresseur dans la PDAC. Ici, nous démontrons une capacité à engager ces cellules myéloïdes dans le cadre de la PDAC par l'induction d'une immunité innée entraînée dans le pancréas.

Il est important de noter que nous montrons également que la capacité à initier une immunité entraînée dans le pancréas potentialise les effets thérapeutiques de l'immunothérapie telle que la thérapie par blocage immuno-point de contrôle anti-PD-L1. En prêtant une applicabilité clinique supplémentaire à ces résultats, nous montrons également que l'induction d'une immunité entraînée dans le cadre adjuvant peut réduire la taille de la tumeur et prolonger la survie. Ces résultats soulignent le potentiel de l'utilisation du -glucane pour cibler thérapeutiquement les cellules myéloïdes dans le TME et soulignent que l'induction d'une immunité entraînée périphérique dans le pancréas pourrait jouer un rôle conséquent dans la reprogrammation du TME suppressif du PDAC, ce qui pourrait prolonger la vie des patients. diagnostiqué avec cette tumeur maligne mortelle.

Méthodes

Déclaration éthique.

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives éthiques établies par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Louisville. Les expériences ont été menées selon les protocoles approuvés 19471 et 19536.

Souris.

Des souris mâles et femelles âgées de six à huit semaines ont été utilisées dans toutes les expériences. Des souris C57BL / 6 J de type sauvage (WT) ont été achetées au Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, États-Unis) ou élevées dans l'animalerie exempte d'agents pathogènes (SPF) de l'Université de Louisville. Des souris C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin-1−/−) ont été décrites précédemment56. Des souris knock-out globales CCR2 ont été achetées auprès de Jackson Laboratory. Les souris albinos C57BL/6 ont été gracieusement fournies par le Dr Jonathan Warawa de l'Université de Louisville. Des souris NOD/SCID/IL2r Null (NSG) ont été achetées auprès du Jackson Laboratory. La taille maximale de la tumeur autorisée par l'IUCAC n'était pas supérieure à 2000 mm3. Les souris ont été surveillées quotidiennement pour la croissance tumorale et euthanasiées lorsque la charge tumorale dépassait la taille limitée. Les souris ont été maintenues sur un cycle d'obscurité/lumière de 12-h à température ambiante avec une humidité contrôlée (environ 55 %).

Tous les animaux ont été hébergés dans une installation barrière et seules des souris saines ont été utilisées pour les expériences. Toutes les souris étaient âgées d'au moins 6 semaines, et toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées conformément à toutes les lois et directives institutionnelles pertinentes fournies par l'établissement d'élevage de rongeurs (RRF) et approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC). de l'Université de Louisville.

Préparation du -glucane.

Le glucane particulaire hautement purifié sous la forme de particules de glucane entier particulaire (WGP) isolé de Saccharomyces cerevisiae a été fourni par Biothera. Avant utilisation, WGP a été doucement soniqué pendant 15 s, deux fois à l'aide d'un sonicateur Qsonica Q55-110 Q55 (Cole-Parmer) pour s'assurer que les agrégats étaient brisés.

Préparation et utilisation du DTAF-WGP.

Le DTAF (Sigma-Aldrich) à 2 mg/mL a été mélangé avec une suspension de 20 mg/mL de WGP dans du tampon borate (pH 10,8). Celui-ci a été incubé à température ambiante pendant 8 h avec un mélange continu. Après incubation, le WGP a été centrifugé et lavé cinq fois avec du DPBS stérile sans endotoxine froid (Sigma-Aldrich) ou jusqu'à ce que le surnageant ne contienne plus de DTAF visible. La concentration a été ajustée à 10 mg/mL dans le DPBS sans endotoxine pour le stockage. Environ 1 mg de DTAF-WGP a injecté de l'IP dans des souris et des organes C57BL/6 et Dectin-1−/− ont été récoltés 3 jours plus tard.

Préparation du 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) a été mélangé avec DeferoxamineSCN (2,7 mg, dans 0.8 ml DMSO) et mis en suspension dans 10 ml de tampon carbonate de sodium (0,1 M, pH 9,4) pendant la nuit à température ambiante dans l'obscurité en agitant doucement. Le WGP marqué à la déféroxamine a ensuite été lavé avec de l'eau DI (10 × 40 ml) et 30 mg de WGP marqué à la déféroxamine ont été mélangés avec 3 mCi d'oxalate de 89Zr dans 2 ml de tampon Tris•HCl (0,5 M, pH 7,5), et puis incubé à 37 oC pendant 60 min sous agitation. Le 89Zr-WGP a ensuite été centrifugé et lavé avec 3 ml de PBS stérile. La radioactivité du 89Zr-WGP a été mesurée par un calibrateur de dose et utilisée pour des études in vitro et in vivo.

Biodistribution et PET/CT scan avec 89Zr-WGP.

Une imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP)/tomodensitométrie (TDM) a été réalisée chez des souris C57BL/6 et Dectin-1−/− 48 h après l'injection IP de 1 mg de 89Zr-WGP pur ou l'injection de 1 × 106 macrophages qui avaient été co-cultivés avec 25 ug/ml de 89Zr-WGP pendant 2 h, puis lavés doucement pour éliminer l'excès de 89Zr-WGP. Les souris ont été scannées pendant 15 min avec un Siemens R4 MicroPET suivi de 10 min de tomodensitométrie. Le logiciel Siemens IAW a été utilisé pour l'acquisition et la reconstruction du signal TEP, et le logiciel Siemens IRW a été utilisé pour fusionner et analyser les données d'imagerie.

À la fin de l'étude d'imagerie, les souris ont été euthanasiées et les organes d'intérêt ont été prélevés. Pour la biodistribution, 50 µL de sang périphérique ont été prélevés en utilisant une technique de saignement rétro-bulbaire. Le cerveau, le cœur, les poumons, le foie, la rate, les reins, le pancréas, le gros intestin, l'intestin grêle, l'estomac, le fémur, un morceau de peau du flanc des souris et le muscle rectus femoris ont été prélevés, pesés et placés dans un Compteur gamma automatique Wizard 2470 (PerkinElmer) pour mesurer la radioactivité de chaque tissu. Les valeurs CPM ont été calculées à l'aide du logiciel Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Traitement pancréatique.

Après l'euthanasie, le pancréas de la souris a été récolté et délicatement coupé en petits morceaux à l'aide de ciseaux stériles. Ils ont été mis en suspension dans un tube de 15 ml dans un milieu complet (RPMI) avec un tampon de digestion 1X composé de 300 U/ml de collagénase I, 60 U/ml de hyaluronidase et 80 U/ml de DNase (Sigma). Ceux-ci ont été placés dans un incubateur rotatif à 37 degrés avec 5% de CO2 pendant 15 à 20 min. Le tampon de digestion a ensuite été désactivé avec du RPMI 1640 complet glacé et lavé. Les cellules ont été passées à travers un filtre à panier en nylon stérile de 40 µm et de petits morceaux de tissu non digérés ont été écrasés à l'aide d'un bouchon de seringue stérile pour générer une suspension de cellule unique. Si un nombre appréciable de globules rouges (RBC) existait dans l'échantillon, la lyse des RBC a été effectuée en ajoutant 2 ml d'ACK stérile 10x (Thermo Fisher Scientific).

Administration de WGP in vivo.

Les souris ont reçu une dose intrapéritonéale unique de 1 mg de WGP légèrement soniqué, de billes de polystyrène de 3 μm (Sigma-Aldrich) ou de microsphères fluorescentes de 3 μm (Polysciences) (toutes 1 mg dans 200 ul de PBS stérile) ou 200 ul de PBS stérile au jour 0. Pour les études d'immunité typiquement formées, 7 jours après la dose IP initiale, les souris ont été euthanasiées à l'aide de CO2, et le pancréas ainsi que d'autres tissus d'intérêt ont été retirés et traités. Pour les études de titration de dose, 0,5, 1 et 2 mg de WGP ont été livrés IP dans 200 ul de PBS stérile. Pour les études de titration temporelle, les souris ont reçu une injection de 1 mg de WGP et le pancréas a été récolté après 24 h, 48 h, 3, 7, 10, 16 et 30 jours plus tard.

Restimulation ex vivo.

Pour évaluer le phénotype entraîné des cellules mononucléaires chez les souris traitées avec du WGP ou du PBS ex vivo, après traitement du pancréas, des suspensions de cellules pancréatiques ont été étalées dans des plaques à 24 puits et stimulées avec du LPS (10 ng/ml), le surnageant de culture KPC et Pan02 cellules (40 pour cent) et MIF recombinant (rMIF) (10 ng/ml). Le MIF était un don généreux du Dr Robert Mitchell de l'Université de Louisville et était un allié procaryote exprimé, purifié et replié comme décrit précédemment57. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM et incubées à 37 degrés avec 5 % de CO2 pendant 5 à 6 h en présence de 1X brefeldine A (BioLegend). Les cellules ont ensuite été récoltées à l'aide d'un grattoir à cellules, lavées, culottées, puis colorées pour l'expression intracellulaire des cytokines.

Test d'entraînement et de restimulation in vitro.

Des macrophages péritonéaux ou des cellules triées CD11b plus d'un pancréas de souris ont été étalés dans une plaque à puits 24- pendant 2 h à 37 degrés et 5 % de CO2 pour permettre la fixation des cellules sur les plaques, après quoi les cellules flottantes ont été doucement aspiré. Les cellules attachées ont été délicatement lavées avec du PBS stérile puis remises en suspension dans 1 ml de DMEM constitué de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline/streptomycine.

Pour la formation initiale des cellules, 25 μg/ml de WGP particulaire, 25 μg/ml de billes de microparticules de polystyrène de 3 μm (Sigma-Aldrich) ou 100 μL de PBS ont été ajoutés au puits approprié et incubés pendant 24 h. Après 24 h, les puits ont été doucement lavés pour éliminer le stimulus initial et du DMEM frais a été ajouté et les cellules ont été incubées avec 5 % de CO2 à 37 degrés pendant 7 jours. Après 7 jours, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu frais, et les cellules ont été restimulées avec du LPS (100 ng/mL), le surnageant de cellules KPC ou Pan02 (40 %) ou du PBS comme témoin. Vingt-quatre heures après la stimulation, les surnageants ont été récoltés et utilisés dans un ELISA pour TNF- et IL-6.

Médias conditionnés par la tumeur.

Environ 1 × 106 cellules KPC ou Pan02 ont été cultivées dans une plaque à six puits dans 4 mL de DMEM complet à 37 degrés et 5 % de CO2. Après 3 jours, les surnageants ont été récoltés et stockés à -80 degrés en aliquotes pour être utilisés comme milieu conditionné par la tumeur. Comme témoin, le pancréas d'une souris C57BL/6 a été transformé en une suspension cellulaire unique et 1 × 106 de ces cellules ont été cultivées dans une plaque à six puits dans 4 mL de DMEM complet et à 37 degrés et 5 % de CO2, et les surnageants ont également été récupérés après 3 jours. En tant que contrôle, le pancréas de souris naïves a été transformé en une suspension unicellulaire et étalé dans une plaque à six puits pendant 1 jour. Les cellules non adhérentes ont été lavées et ces cellules ont ensuite été cultivées pendant 3 jours et le surnageant a été récolté.

Acquisition de macrophages péritonéaux.

Les souris ont été euthanasiées et 5 ml de RPMI stérile ont été injectés dans le péritoine à l'aide d'une seringue de jauge 25-. L'abdomen a été massé pour libérer les macrophages péritonéaux. Une petite incision a été pratiquée et une pipette de transfert a été utilisée pour retirer la suspension. La cavité péritonéale a ensuite été lavée plusieurs fois avec du RPMI froid et les cellules ont été culottées à 458 × g.

Cytométrie en flux.

Des suspensions unicellulaires dans du PBS avec 1 % de FBS ont été bloquées avec un bloc Fc murin (anti-CD16/CD32) à 4 degrés pendant 15 min. Les anticorps marqués au fluorochrome pour la viabilité (APC/Cy7) et contre les marqueurs de surface CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) et CCR2 (R&D Systems) ont été utilisé. Les informations relatives à tous les flux Abs sont résumées dans le tableau supplémentaire 3. Après 30 minutes d'incubation dans l'obscurité à 4 degrés, les cellules ont été lavées avec du PBS froid et filtrées à travers un filtre à mailles de 40 µm. Les échantillons ont été acquis à l'aide d'un cytomètre FACSCanto II (BD Biosciences) et analysés à l'aide du logiciel FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). La version 6 du logiciel FACSDiva a été utilisée dans FACSCanto pour acquérir toutes les données.

coloration intracellulaire pour l'expression des cytokines.

Après stimulation, les cellules ont été colorées pour les marqueurs de surface souhaités comme décrit ci-dessus. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS froid et 500 ul de tampon de fixation (Biolegend) ont été ajoutés aux tubes, brièvement vortexés et incubés dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 min. Environ 1 ml de tampon de perméabilisation (Biolegend) a ensuite été ajouté et les échantillons ont été centrifugés à 458 × g pendant 5 min à 4 degrés suivi d'un autre lavage en utilisant 1 ml de tampon de perméabilisation. Les cellules ont été remises en suspension dans 200 ul de tampon de perméabilisation et les cellules ont été colorées avec des anticorps contre TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 et IFN ou l'isotype de contrôle respectif pendant une nuit à 4 degrés. Les cellules ont ensuite été lavées, filtrées et les données ont été acquises à l'aide d'un cytomètre en flux.

Isolement FACS de CD11b plus macrophages pour la formation in vitro.

Le pancréas a été transformé en une suspension unicellulaire comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été lavées avec 1 ml de PBS et incubées avec le bloc Fc pendant 10 min à 4 degrés, puis colorées avec un colorant de viabilité (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) et CD11b plus (APC) pendant 30 min à 4 degrés. Les cellules ont été lavées avec du PBS et remises en suspension dans du tampon de fonctionnement MACS froid (Miltenyi Biotech). Viabilité Les cellules CD45 plus CD11b plus ont été triées à l'aide d'un FACS Aria III (BD Biosciences). Les cellules ont été recueillies dans du FBS à 50 %, du PBS à 40 % et de l'HEPES à 10 % (Corning). Après tri, les cellules ont été lavées avec du PBS puis étalées pour un entraînement in vitro, comme décrit ci-dessus.

ÉLISA.

Les surnageants des cellules formées in vitro ainsi que les standards ont été analysés à l'aide de kits ELISA TNF- et IL-6 murins (BioLegend). Le test a été réalisé selon les instructions du fabricant et toutes les conditions ont été réalisées en triple. Un kit ELISA pour rMIF (systèmes R et D) a également été utilisé conformément aux instructions du fabricant pour quantifier le rMIF dans des milieux conditionnés par tumeur Pan02 et KPC et le surnageant de cellules pancréatiques non traitées en culture. Pour quantifier les modifications d'histone, des kits ELISA (kit de quantification de tri-méthyl histone H3K4, kit de quantification d'acétyl-histone H3K27, kit de quantification de tri-méthyl histone H3K27 et kit de quantification d'histone totale H3) ont été achetés auprès d'EpiGentek et les tests ont été effectués sur la base des recommandations du fabricant. instructions. Le lactate a été mesuré par le kit de dosage L-Lactate I (Eton Bioscience).

Analyse Western blot.

Les cellules CD11b plus de souris ayant reçu une injection de PBS ou de WGP (24 h) ont été séparées à l'aide de microbilles CD11b (Miltenyi Biotech). L'histone a été extraite selon les instructions du fabricant (Active Motif, Inc.) et la concentration en protéines a été déterminée en utilisant la quantification de Bradford. Les protéines histones ont été séparées par des gels SDS-PAGE Tris-HCl à 15 % et transférées sur des membranes PVDF (Millipore). La membrane a été bloquée avec 5% de BSA à température ambiante pendant 1 h et incubée pendant une nuit à 4 degrés avec des anticorps primaires, y compris tri-méthyl-histone H3 (lys4) mAb de lapin, acétyl-histone H3 (lys27) XP mAb de lapin, tri-méthyl -histone H3 (Lys27) Rabbit mAb et histone H3 XP rabbit mAb (Cell Signaling Technology), puis incubés avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP (GE Healthcare) à température ambiante pendant 1 h. La membrane a été développée avec Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) et détectée par Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Les étalons de protéines précolorées Precision Plus Protein Kaleidoscope ont été utilisés comme marqueur protéique standard (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Après que les cellules CD11b plus aient été isolées du pancréas de souris chez les souris traitées et non traitées avec le WGP, les cellules ont été conservées dans du TRIzol. Les ARN ont été isolés et transcrits à l'aide de l'amplification TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) à l'aide du système de détection RT-PCR monochrome Bio-Rad MyiQ. En bref, l'ADNc a été amplifié dans un mélange réactionnel de 25 uL composé d'un super-mélange PCR SYBR Green (Bio-Rad), de 100 ng de matrice d'ADN complémentaire et d'amorces sélectionnées (200 nM) en utilisant les conditions de cycle recommandées.

H plus E.

Sept jours après l'injection de billes de PBS/microparticules ou de WGP, les pancréas ont été récoltés et fixés dans du formol à 4 % pendant 1 semaine, suivis d'une inclusion dans de la paraffine selon les procédures standard. Les tissus inclus en paraffine ont été coupés en sections de 5 mm d'épaisseur et colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) pour l'analyse morphologique.

Mesure de l'amylase sérique.

L'amylase sérique murine a été mesurée en utilisant le kit de dosage d'activité d'amylase (Millipore Sigma) et a été utilisée selon les instructions du fabricant. En bref, des souris ont reçu une injection de WGP et 7 jours plus tard, du sang a été prélevé sur des souris en utilisant une technique de saignement rétro-bulbaire. Ces échantillons ont été utilisés pour doser l'amylase sérique.

Épuisement in vivo des lymphocytes T.

Les lymphocytes T ont été appauvris en utilisant un mAb anti-CD4 seul, un mAb antiCD8 seul ou des mAb anti-CD4 et anti-CD8 ensemble. Les anticorps ont été fabriqués en interne. Dans cette procédure d'épuisement, les souris ont injecté IP avec WGP le jour 1 et ont également été injectées IP avec 200 µg de mAbs le jour 1 et le jour 4 pendant la période de traitement. Les souris ont été euthanasiées au jour 7. (clone CD4 GK1.5, clone CD8 53-6.72). L'efficacité de l'épuisement a été confirmée au jour 7.

Épuisement des cellules NK in vivo.

Les cellules NK ont été épuisées par l'injection intrapéritonéale de 100 µg de mAb PK136 (Produit dans le laboratoire du Dr Jun Yan à l'Université de Louisville) aux jours -1 et 5 pendant la période de traitement. Le WGP a été injecté au jour 0 et au jour 7, les animaux ont été euthanasiés et l'efficacité de déplétion des cellules NK a été évaluée en colorant les tissus pancréatiques pour NK1.1.

Appauvrissement en Ly6G.

Les neutrophiles ont été épuisés en injectant 300 µg de mAb anti-Ly6G (Bio X Cell) ou d'IgG2a de rat isotype contrôle (Bio X Cell) aux jours -1, 2 et 6 pendant le traitement. Environ 1 mg de WGP injecté IP le jour 1. Les souris ont été euthanasiées le jour 7 et le pancréas a été évalué pour l'efficacité de l'épuisement. Dans la tumeur, des souris modèles ont reçu une injection de 300 µg de mAb anti-Ly6G ou d'IgG2a de rat d'isotype contrôle les jours -2, 4, 10 et 16. Les souris ont reçu du WGP le jour 0 et ont été implantées avec des tumeurs pancréatiques orthotopiques KPC le jour 7. Les souris ont été euthanasiées au jour 21 et les tissus pancréatiques ont été colorés avec Ly6G pour évaluer l'efficacité de la déplétion des granulocytes à ce moment-là.

Préparation d'échantillons de cytométrie de masse CyTOF.

Les anticorps de cytométrie de masse ont été achetés auprès de Fluidigm ou ont été créés en interne en conjuguant des anticorps purifiés disponibles dans le commerce à l'isotope métallique approprié à l'aide des kits MaxPar X8 Polymer ou MCP9 Polymer (Fluidigm). Des échantillons pancréatiques de trois souris PBS et de trois souris WGP 7- jours ont été traités dans une solution unicellulaire et une stimulation ex vivo a été effectuée comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été délicatement grattées des plaques à l'aide d'un grattoir à cellules stérile, lavées avec du PBS et placées dans un tube de culture stérile. Environ 2 × 106 cellules par échantillon ont été utilisées. Les cellules ont d'abord été colorées pour la viabilité avec 5 uM de cisplatine (Fluidigm) dans du RPMI 1640 sans sérum pendant 5 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées avec du RPMI 1640 contenant 10 % de FBS pendant 5 min à 300 × g. Les cellules ont été colorées avec les anticorps de surface pendant 30 min à température ambiante et lavées deux fois avec un tampon de coloration Maxpar Cell (Fluidigm).

Pour la coloration sur les cytokines intracellulaires, les cellules ont ensuite été fixées avec 1 ml de tampon 1X Maxpar Fix I pendant 30 min à température ambiante, puis lavées deux fois avec 2 ml de tampon 1X Maxpar Perm-S pendant 5 min à 800 × g. Le cocktail d'anticorps cytoplasmique/sécrété a ensuite été ajouté et incubé avec les cellules pendant 30 min à température ambiante. Après incubation, les cellules ont été lavées avec 1 ml de tampon 1X Maxpar Perm-S pendant 5 min à 800 × g et doucement éponger pour éliminer tout liquide du tube.

Pour colorer les antigènes nucléaires, les cellules ont ensuite été mises en suspension dans 1 ml de tampon de coloration d'antigène nucléaire 1X Maxpar pendant 30 min à température ambiante. Le cocktail d'anticorps d'antigène nucléaire a ensuite été ajouté et incubé pendant 30 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées deux fois pendant 5 min à 800 × g avec 2 ml de tampon de perméabilité à la coloration de l'antigène nucléaire. Enfin, les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde à 1,6 % pendant 10 min à température ambiante, puis incubées pendant une nuit dans 125 nM d'IntercalatorIridium (Fluidigm) à 4 degrés.

Acquisition de données CyTOF.

Une fois que les cellules étaient prêtes pour l'acquisition, les échantillons ont été lavés deux fois avec du tampon de coloration cellulaire (Fluidigm) et conservés sur de la glace en attendant l'acquisition. Juste avant l'acquisition, les cellules ont été mises en suspension dans une solution 1:9 de solution d'acquisition cellulaire : billes d'étalonnage EQ 4 éléments (Fluidigm). Un système Helios CyTOF a été utilisé et, en suivant les procédures de démarrage et de réglage appropriées, les échantillons ont été analysés à un rythme inférieur ou égal à 500 événements/seconde jusqu'à 300 000 événements. À l'aide du logiciel CyTOF, les fichiers FCS ont été normalisés. Fichiers FCS et ces fichiers étaient ensuite prêts pour l'analyse des données.

Analyse des données CyTOF.

Les données CyTOF ont été analysées à l'aide de FlowJo, le progiciel CytoBank58 et du flux de travail CyTOF59 qui comprend une suite de progiciels disponibles dans R (r-project.org)60–63. Pour l'analyse effectuée dans le flux de travail CyTOF, les fichiers de l'espace de travail FlowJo exportés depuis Flow Workspace et CytoML ont été utilisés61.

Séquençage d'ARN : extraction et isolement d'ARN.

Sept jours après l'administration de PBS ou de WGP IP, les pancréas ont été récoltés, transformés en une suspension cellulaire unique, colorés pour la viabilité, CD45 et CD11b, et triés à l'aide d'un FACS Aria III. Les échantillons ont été préparés en triple pour chaque groupe expérimental. Une fois ces cellules myéloïdes isolées, les cellules ont été lavées 2x avec du PBS glacé puis lysées avec du Trizol (Invitrogen). Les ARN ont été extraits à l'aide d'un kit QIAGEN RNAeasy (QIAGEN).

L'intégrité de l'ARN isolé a été vérifiée à l'aide du système Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) et quantifiée à l'aide d'un test fluorométrique Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Des bibliothèques d'ARNm-Seq enrichies en Poly-A ont été préparées selon le protocole standard du kit Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) en utilisant 10 ng d'ARN total.

Tous les échantillons ont été ligaturés avec des adaptateurs Illumina et munis d'un code-barres individuel. L'absence de dimères adaptateurs et une taille de bibliothèque constante d'environ 300 pb ont été confirmées à l'aide de l'Agilent Bioanalyzer 2100. La concentration de la bibliothèque et le comportement de séquençage ont été évalués sur un pic standardisé de PhIX à l'aide d'une cellule de flux de séquençage Nano MiSeq d'Illumina. 1,8 pm des bibliothèques regroupées avec 1 % de pics PhiX ont été chargées sur une Flow Cell de séquençage NextSeq 500/550 75 cycles High Output Kit v2 et séquencées sur le séquenceur Illumina NextSeq 500 ciblant 60 millions de lectures 1x75 bp par échantillon.

Séquençage de l'ARN.

Les bibliothèques ont été préparées à l'aide du kit Universal Plus mRNA-seq avec quantification de bibliothèque NuQuant® (NuGen). Les six échantillons ont été répartis sur quatre lignes de séquençage en une seule analyse. Les 24 fichiers de séquençage bruts à une extrémité (.fastq)64 ont été téléchargés à partir du BaseSpace65 d'Illumina sur le serveur KBRIN pour analyse. Le contrôle qualité (CQ) des données de séquence brutes a été effectué à l'aide de FastQC (version 0.10.1)66. Les séquences ont été alignées sur le génome de référence de la souris mm10 à l'aide de STAR (version 2.6)67, générant des fichiers d'alignement au format bam. L'expression différentielle des transcrits codant pour la protéine ENSEMBL a été réalisée à l'aide de DESeq268,69. Les décomptes bruts ont été obtenus à partir des fichiers au format bam alignés sur STAR à l'aide de HTSeq (version 0.10.0)70. Les décomptes bruts ont été normalisés à l'aide de la méthode Relative Log Expression (RLE), puis filtrés pour exclure les gènes avec moins de dix décomptes dans les échantillons71. Les données RNA-seq ont été déposées avec l'accession GEO GSE187464.

Séquençage d'ARN : analyse d'enrichissement de jeux de gènes.

L'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) a été utilisée pour caractériser davantage la biologie des gènes comprenant les conditions WGP vs PBS et leurs différences72. Des ensembles de gènes ont été obtenus à partir de la base de données de signatures moléculaires (MSigDB) pour les processus biologiques Gene Ontology (GO) et les voies Reactome. Pour chaque ensemble de gènes, tous les emplacements de gènes testés dans la comparaison des souris témoins traitées au WGP et au PBS ont été triés de la signification la plus élevée à la plus faible en utilisant des valeurs p. Cette approche permet d'inclure des gènes fortement régulés positivement et négativement dans chaque ensemble de gènes, une approche qui reflète plus précisément les conditions d'une voie biologique. Pour cette analyse, un tableau des ensembles enrichis est suivi d'un graphique d'enrichissement affichant le profil du score d'enrichissement (ES) et la position des membres de l'ensemble de gènes sur la liste classée.

Séquençage unicellulaire : isolement de cellules individuelles et séquençage d'ARN.

Les cellules CD45 plus vivantes ont été triées à partir de pancréas de souris, lavées et remises en suspension dans du PBS 1x (sans calcium ni magnésium) contenant 0 0,04 % de BSA. Des cellules individuelles ont été capturées et des bibliothèques d'ADNc à code-barres ont été construites à l'aide du kit de réactifs Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ (v3.1, 10X Genomics) et du Chromium Controller, conformément aux instructions du fabricant. Les bibliothèques ont été regroupées et séquencées à l'aide d'une configuration de 28 bp × 8 bp × 125 bp pour l'index read1 × i7 x read2 sur l'Illumina NextSeq 500 avec le kit High Output v2.5 du cycle NextSeq 500/550 150 (20024907).

Depuis le séquençage cellulaire : profilage de l'expression génique.

Les fichiers bcl ont été démultiplexés en fichiers fastq à l'aide du logiciel CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Le nombre total de lectures séquencées était de 506 913 062. Les lectures étaient de bonne qualité comme déterminé par FastQC66. Le nombre de gènes a été mesuré à l'aide de CellRanger "count", en utilisant le génome de référence cell ranger-mm10-3.0.0 pour les souris. Une matrice de comptage a été générée pour chaque échantillon et un échantillon agrégé avec le nombre attendu de cellules fixé à 5000.

Les données de comptage brutes déterminées par CellRanger ont été utilisées comme entrée dans un pipeline d'analyse personnalisé dans R qui utilise une variété d'outils d'analyse à cellule unique basés sur Seurat. Le tracé du genou (Fig. 7b supplémentaire) affiche un graphique montrant les nombres d'UMI classés pour chaque code-barres de cellule pour les données agrégées dans les trois groupes. Les cellules au-dessus du point d'inflexion représentent des doublets possibles tandis que celles en dessous du genou représentent des cellules de fond. Les mesures de contrôle de la qualité des cellules ont été analysées à l'aide de Seurat v373, et les codes-barres des cellules présentant les caractéristiques suivantes ont été supprimés de l'analyse : nombre faible (cellules de fond possibles) avec un seuil FDR de 0.01 de la fonction DropletUtils74 "emptyDrops", nombres élevés (cellules doublets possibles) avec plus de nombres que le point d'inflexion du genou, contenu mitochondrial supérieur à 30 % et contenu ribosomique supérieur à 40 %. Les gènes (caractéristiques) ont ensuite été filtrés pour supprimer les identificateurs de gènes retirés et les gènes qui n'étaient pas exprimés dans au moins deux cellules. Voir les Fig. 7a, b supplémentaires pour le nombre initial et filtré de codes-barres cellulaires et de gènes.

Les données d'expression ont été normalisées à l'aide de SCTransform75 où les gènes du cycle cellulaire, le contenu ribosomal et le contenu mitochondrial ont été régressés. Les cellules ont ensuite été regroupées et la réduction de dimension a été effectuée à l'aide d'UMAP76. Les noms de cluster initiaux ont été attribués à l'aide d'une technique de score d'enrichissement GSVA77,78 modifiée. Pour chacun de ces groupes, les meilleurs gènes marqueurs ont été identifiés. Les gènes exprimés de manière différentielle comparant chaque cluster à tous les autres clusters (toutes les comparaisons par paires) ont été déterminés à l'aide de Seurat73 et MAST79. Les données scRNA-seq ont été déposées avec l'accession GEO GSE187464.

Identification des clusters générés avec scRNA-Seq.

Les grappes non dérivées de la myéloïde ont été généralement classées en cellules B (MS4A1), plasmocytes (SDC1), CD8 plus cellules T (CD3e, C8a), CD4 plus cellules T (CD3e, CD4), cellules T régulatrices (T -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), cellules T δ (CD3e, TRGC1, TRGC2, IL7Ra) et cellules immunitaires innées de type 2 (ILC2) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS et Rxrg)80–82. Les neutrophiles ont été identifiés par l'expression de MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 et ADAM8, bien qu'ils puissent être sous-représentés dans ces analyses en raison de leur faible teneur en ARN et de leurs niveaux élevés de RNases intrinsèques83. Les cellules dendritiques conventionnelles (cDC) ont été identifiées par l'expression d'ITGAX et d'ITGAE et les DC plasmacytoïdes (pDC) ont été identifiées par ITGAX et Siglech.

Classification des clusters myéloïdes à partir de scRNA-Seq.

Le cluster 5 exprimait ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- et n'exprimait pas TNFAIP2, indiquant que ces cellules sont des macrophages résidents. Cluster10 a exprimé ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Les clusters 3 et 4 expriment ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, ce qui suggère que les deux sont des sous-ensembles de monocytes/macrophages infiltrants, bien que les gènes inflammatoires améliorés exprimés dans le cluster 3 aient été utilisés pour identifier le cluster 3 comme monocyte/macrophage infiltrant inflammatoire .

Essais de phagocytose.

Le pancréas de souris ayant reçu une injection de PBS/microparticules et de souris formées au WGP in vivo a été récolté 7 jours après l'injection et traité comme décrit précédemment dans une suspension cellulaire unique. Environ 2 × 106 ont été lavés avec HEPES dilué 50x dans du RPMI 1640 puis incubés dans 100 μL de cette solution pendant 1 h à 37 degrés pour activer les cellules. L'Invitrogen promeut Green S.

Le kit de phagocytose Aureus BioParticles™ pour la cytométrie en flux (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Environ 100 μL des particules reconstituées ou 1 × 106 cellules tumorales GFP plus KPC ont été ajoutés aux cellules pancréatiques activées et incubés pendant 1 h à 37 degrés. Les échantillons ont été doucement vortexés toutes les 15 minutes. La réaction a été arrêtée en ajoutant 1 mL de PBS froid. Les échantillons ont été incubés avec Fc Block pendant 10 min à 4 degrés, colorés pour la viabilité, CD45, CD11b et F4/80 pendant 30 min à 4 degrés, puis analysés à l'aide d'un BD FACSCanto. Pour l'analyse, après déclenchement sur des cellules vivantes et CD45, les cellules fluorescentes dans le canal FITC ont été déterminées comme étant phagocytaires.

Test de cytotoxicité.

Le pancréas de souris traitées au WGP et au PBS a été récolté et les populations CD11b plus ont été isolées à l'aide de CD11b magnétiques plus MicroBeads (Miltenyi Biotec) et d'un séparateur autoMACS Pro (Miltenyi Biotec). Les cellules CD11b plus purifiées ont ensuite été lavées et comptées, et celles-ci ont été étalées dans un rapport de 1:20 tumeur: cellules effectrices dans une plaque à puits 96-. Tous les échantillons expérimentaux ont été exécutés en triple exemplaire. Après avoir étalé les cellules CD11b plus, les inhibiteurs de ROS N-acétyl-Lcystéine (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) ou DFO (50 μM, Pharmacopée européenne) ont été ajoutés à un ensemble de cellules dérivées de PBS et de WGP pendant 1 h avant l'ajout de 5000 KPC exprimant la luciférase plus des cellules tumorales pancréatiques à tous les puits. Après 24 h de co-culture, les plaques ont été centrifugées et 20 µL du surnageant ont été mélangés avec 100 µL de Luciférase Assay Reagent (Promega). L'activité luciférase mesurée dans le surnageant était en corrélation avec les cellules tumorales qui avaient été tuées par les cellules effectrices et a été mesurée à l'aide d'un luminomètre (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Le signal de luciférase spontané des cellules tumorales plaquées a été soustrait de la mesure du surnageant. Les valeurs de luciférase sont représentées sous forme d'unités lumineuses relatives (RLU).

Modèles tumoraux in vivo du cancer du pancréas.

Une lignée cellulaire KPC sur fond C57BL/6 dérivée du LSL-KrasG12D/ plus ; LSL-Trp53R172H/ plus ; Le modèle de souris Pdx1-Cre (KPC) a été acheté auprès de Ximbio. Celles-ci et les cellules Pan02 qui étaient un don généreux du Dr Yong Lu de l'Université Wake Forest ont été utilisées dans un modèle orthotopique de cancer du pancréas. Une lignée KPC transfectée avec la GFP et la luciférase (KPCGFP plus Luc plus) a également été une généreuse contribution du Dr Michael Dwinell du Medical College of Wisconsin. Ces cellules ont été utilisées exclusivement chez des souris albinos C57BL/6.

Pour l'implantation de la tumeur, les souris ont été anesthésiées à l'aide d'isoflurane et l'abdomen des souris a été préparé avec de la bétadine et drapé de manière stérile. Une laparotomie médiane de 2 cm a été réalisée en utilisant une technique aseptique avec des instruments stériles. Après laparotomie, le pancréas et la rate ont été extériorisés. Les cellules tumorales ont été mises en suspension dans du PBS glacé et mélangées dans un rapport 1: 1 avec une matrice de membrane basale Matrigel (Corning). 0.1 × 106 cellules tumorales dans 50 uL de la solution PBS-matrigel ont été injectées dans la queue du pancréas à l'aide d'une seringue à insuline de calibre 30-. La formation d'une petite bulle indique une implantation réussie. Le péritoine a été fermé à l'aide d'une suture résorbable tressée en acide polyglycolique 5/0 et la peau a été fermée à l'aide d'une suture non résorbable tressée en soie 5/0. (CP Médical). La buprénorphine a été administrée pour la gestion de la douleur jusqu'à 72 h après la chirurgie et les souris ont été surveillées.

Imagerie in vivo.

Des souris implantées orthotopiquement avec des cellules tumorales GFP plus luciférase plus KPC ont reçu une injection IP de 150 mg/kg de poids corporel à 100 µL de XenoLight D-luciférine-K plus sel bioluminescent substrat (PerkinElmer). Après 10 min, les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et placées à l'intérieur d'un Biospace Lab Photon Imager, qui est une modalité optique in vivo dédiée à faible niveau de lumière pour l'imagerie bioluminescente et fluorescente. Des images de souris ont été prises et utilisées pour mesurer la taille et la croissance de la tumeur.

Modèle de tumeur en mélange.

Les souris ont été entraînées avec 1 mg de WGP et 7 jours plus tard, les populations CD11b plus CCR2 plus et CD11b plus CCR2− ont été triées et mélangées 1: 1 avec des cellules tumorales KPC 1 × 105 cellules tumorales. Les cellules ont été implantées orthotopiquement dans des souris WT et 3 semaines plus tard, les souris ont été euthanasiées et la taille de la tumeur a été évaluée.

Thérapie combinée avec un mAb anti-PD-L1.

Des souris C57BL / 6 ont été traitées avec du WGP au jour -7 et implantées avec des tumeurs pancréatiques orthotopiques KPC au jour 0. Les souris ont été traitées avec 200 µg de mAb anti-PD-L1 anti-souris (Bio X Cell) ou de contrôle d'isotype Rat IgG2b (Bio X Cell) aux jours 3, 7 et 11. Les souris ont ensuite été surveillées pour leur survie.

WGP comme traitement.

Des souris C57BL / 6 ont été implantées avec des tumeurs pancréatiques orthotopiques KPC au jour 0 et les jours 4 et 11, les souris ont reçu 1 mg d'IP WGP ou de PBS. Les souris ont ensuite été surveillées pour leur survie.

Analyses statistiques.

Tous les résultats ont été répétés au moins trois fois de manière indépendante pour vérification, sauf indication contraire. Des résultats représentatifs sont affichés. Les résultats sont représentés sous forme de moyenne ± SEM. Les données ont été analysées à l'aide d'un test t de Student bilatéral ou d'un test U de Mann-Whitney. Des comparaisons de plusieurs groupes ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle suivie des tests de comparaisons multiples de Tukey. Les analyses de corrélation ont été effectuées à l'aide du coefficient de corrélation de Pearson (distribution normale). La signification statistique a été fixée à p < 0.05. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de la version 9 du logiciel GraphPad Prism (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Résumé du rapport.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Disponibilité des données

Les données sources sont fournies dans ce document. Les données RNASeq sont disponibles sous l'accession GEO GSE187464, et les données scRNA-Seq sont disponibles sous l'accession GEO GSE187464. Les données sources sont fournies dans cet article.

Reçu : 2 avril 2021 ; Accepté : 17 janvier 2022.

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Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Wolfgang Zacharias, le Dr Mei Zhang et Sabine Waigel du Brown Cancer Center Genomics Facility pour leur aide dans RNA-Seq et scRNASeq. Nous tenons également à remercier le Dr Clint Geller pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH R01CA213990 et R01AI128818 (JY). CD et CTW ont été pris en charge en partie par le NIH P20GM135004. Une partie de ce travail a été réalisée avec l'aide de l'UofL Genomics Facility, qui est soutenu par le NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), le Brown Cancer Center et les frais d'utilisation. CyTOF a été réalisée dans le Functional Immunomics Core soutenu par NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Le séquençage et le support bioinformatique pour ce travail ont été fournis par NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) et NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Le contenu de cet ouvrage relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les opinions officielles du NIH ou du National Institute for General Medical Sciences (NIGMS).

Contributions d'auteur

AEG a conçu et réalisé les expériences, analysé les données, interprété les résultats et rédigé le manuscrit. RS, CD et HG ont contribué à la conception expérimentale, à l'acquisition et à l'analyse des données. MRW, XH et MZ ont aidé à l'acquisition des données et à la préparation des matériaux. KA et ECR ont contribué à l'analyse informatique et à l'interprétation des analyses RNA-Seq et JHC et ECR ont contribué à l'analyse informatique et à l'interprétation des analyses ScRNA-Seq. DT et CTW ont contribué à l'analyse des données CyTOF. RAM, H.-gZ et YL ont fourni des matériaux et guidé le projet. RAM a effectué un examen critique. JY a dirigé la conception expérimentale et l'étude globale, interprété les données, supervisé la recherche et aidé à la rédaction et à la révision du manuscrit.

Intérêts concurrents

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Informations Complémentaires

Informations supplémentaires La version en ligne contient des informations supplémentaires disponibles sur https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

La correspondance et les demandes de matériel doivent être adressées à Jun Yan.

Informations sur l'examen par les pairs

Nature Communications remercie George Miller et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Les réimpressions et les informations sur les autorisations sont disponibles sur http://www.nature.com/reprints

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre sur les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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