La relation entre la cyclo-oxygénase (COX-2) et la maladie induite par l'hypoxie

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La prostaglandine intracellulaire E2 contribue à la mort des cellules tubulaires proximales induite par l'hypoxie

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Les cellules tubulaires proximales (PTC) sont particulièrement vulnérables à l'apoptose induite par l'hypoxie, un facteur pertinent pourmaladie du rein. Nous avons émis l'hypothèse ici que la mort du PTC sous hypoxie est médiée par la production dépendante de la cyclo-oxygénase (COX -2) de prostaglandine E, (PGE,), qui a été confirmée dans les cellules tubulaires proximales humaines HK -2 parce que l'hypoxie (1 pour cent O,)-l'apoptose induite (i) a été empêchée par un COX-2(cyclo-oxygénase) et par des antagonistes des récepteurs de la prostaglandine (EP) et (ii) a été associée à une augmentation de la PGE intracellulaire, (iPGE,) due au facteur inductible par l'hypoxie-1 -régulation transcriptionnelle positive de la COX{{3 }}(cyclo-oxygénase). L'apoptose a également été prévenue par les inhibiteurs du transporteur de captation des prostaglandines PGT, ce qui indique que l'iPGE contribue à l'apoptose induite par l'hypoxie (au contraire, la mort des PTC induite par l'hypoxie/réoxygénation était exclusivement due à la PGE extracellulaire). Ainsi, l'iPGE est un nouvel acteur dans la pathogenèse des lésions tubulaires induites par l'hypoxie et la PGT pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour la prévention des lésions hypoxiques-dépendantes dans les maladies rénales.

Il est bien établi que l'hypoxie tubulaire est un facteur pertinent pour les maladies aiguës et chroniques.maladie du rein'2 Les cellules tubulaires proximales (PTC) sont très actives en termes de consommation d'oxygène en raison de leurs activités de réabsorption exigeantes en énergie et, par conséquent, elles sont vulnérables à l'hypoxie. Il a été montré que l'apoptose joue un rôle important dans les PTC de culture exposées à l'hypoxie, mais les voies de signalisation responsables de l'activation de la machinerie apoptotique n'ont pas été étudiées. Nous et d'autres avons découvert que la prostaglandine E (PGE), un médiateur lipidique important de nombreux processus physiologiques et pathologiques dans leun rein, joue un rôle important dans la signalisation conduisant à l'apoptose de la PTC lors d'un traitement avec du cisplatine7, de l'albumine8ou de la leptine et de la gentamycine. Dans tous les cas, l'augmentation de la PGE dépendait de l'expression accrue de la cyclo-oxygénase-2(COX-2)(cyclo-oxygénase), une enzyme inductible qui, avec COX-1l, est l'étape limitant la vitesse de synthèse des prostaglandines. Chez l'humainun rein, COX basale-2(cyclo-oxygénase)l'expression est moins intense que celle de COX-1. COX-2(cyclo-oxygénase)a été identifié dans des podocytes et des parties de l'anse de Henle et du système vasculaire rénal dans des conditions physiologiquesun reiny compris PTC, et peut contribuer à des lésions rénales. Fait intéressant, l'hypoxie augmente l'expression de COX-2(cyclo-oxygénase)et/ou la production de PGE,12-i7 dans de nombreux types de cellules. En fait, nous avons déjà découvert que l'hypoxie améliore le contenu intracellulaire en PGE, ainsi que sa libération dans le milieu extracellulaire8. Par conséquent, il est théoriquement possible que la PGE médie l'effet apoptotique de l'hypoxie sur le PTC.

La plupart des études sur l'apoptose dépendante de la PGE, se sont essentiellement concentrées sur les mécanismes impliquant la PGE extracellulaire, car il est largement admis que la PGE, exerce ses effets biologiques par l'activation des récepteurs PGE, couplés à la protéine G, qui traversent la membrane plasmique (récepteurs des prostaglandines de la série E PE1-4)1. Néanmoins, dans certains modèles, la PGE intracellulaire (iPGE) est pertinente dans la mort cellulaire apoptotique720-22. Cela implique que pour induire l'apoptose, la PGE doit atteindre à nouveau le milieu intracellulaire et activer un sous-ensemble de récepteurs EP, qui sont situés à l'intérieur de la cellule (récepteurs iEP). Étant donné que la tâche de capture de PGE est principalement effectuée par le transporteur d'absorption de prostaglandine (PGT) 23-26, l'inhibition de PGT entraîne la prévention de la mort cellulaire apoptotique médiée par iPGE7.

Compte tenu de ce contexte, dans le présent travail, nous avons étudié si un COX-2(cyclo-oxygénase)-augmentation dépendante de l'iPGE, les niveaux médiatisent l'apoptose induite par l'hypoxie dans le PTC.

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Méthodes

Réactifs.

AG1478, vert de bromocrésol (BG), PGE, AH6809, GW627368X, cristal violet, solutions de bleu trypan, bromosulfophtaléine (BRS), 3-(5'-hydroxyméthyl2'-furyl)-1-benzyl indazole (YC1), et l'actinomycine D ont été achetées chez Sigma (St. Louis, MO, USA). Le Z-VAD-FMK et le célécoxib provenaient respectivement de Calbiochem (Darmstadt, Allemagne) et de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, États-Unis). TriReagent a été acheté auprès de Vitro (Madrid, Espagne), et les membranes PVDF et le réactif luminol de transfert Western ont été acquis auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californie, États-Unis). Réactif antifade ProLong Gold avec 4,6-diamidino{{14 }} L'indole de phényle (DAPI), le kit de détection d'apoptose d'annexine-V-FITC (isothiocyanate de fluorescéine)/iodure de propidium (PI) et la sonde de diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA, États-Unis) et Molecular Probes (Oregon, États-Unis), respectivement. Les anticorps ont été obtenus à partir des sources suivantes : anti-PGE et anti-COX-2(cyclo-oxygénase)les anticorps provenaient d'Abcam (Cambridge, Royaume-Uni); l'anti-Bax et l'anti-Bcl-2 provenaient de Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); l'anticorps anti-HIF-la et -lapin-Alexa-Fluor 488 provenaient de BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) et Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), respectivement ; Le conjugué anti- -actine et lapin anti-souris IgG peroxydase a été acheté chez Sigma (St.Louis, MO, USA).

Culture cellulaire et conditions expérimentales.

Des cellules tubulaires proximales humaines HK -2 ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, États-Unis). (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine/amphotéricine B et 1 % de glutamine (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) et 1 % d'insuline-transferrine-sélénium (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). Dans toutes les expériences, les cellules ont été étalées à 70-90 % de confluence et, une fois complètement attachées, elles ont été cultivées dans des conditions hypoxiques (1 % d'oxygène) ou normoxiques (21 % d'oxygène).Hypoxieles expériences ont été réalisées dans un In vivo200hypoxieposte de travail (Ruskin Technology, West Yorkshire, Royaume-Uni). Pourhypoxie/expériences de réoxygénation, les cellules ont été soumises àhypoxiependant 24 h, puis les cellules ont été incubées dans des conditions normoxiques jusqu'à 3 h (période de réoxygénation).

Analyse par immunofluorescence de l'iPGE et analyse Western blot de la COX-2(cyclo-oxygénase)et HIF-1 .

Les cellules pour l'analyse par immunofluorescence et l'analyse Western blot ont été respectivement divisées sur des lamelles de verre (4 × 104 cellules / lamelle de verre) ou dans des plaques à six puits (15 × 104 cellules / puits) et incubées comme décrit dans "Résultats". Ensuite, l'immunofluorescence et l'analyse par immunotransfert ont été effectuées essentiellement comme décrit précédemment. Les dilutions de travail des anticorps étaient : 1/50 pour la PGE, 1/1000 pour la COX-2(cyclo-oxygénase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 et 1/5000 pour -actin. La détection par immunofluorescence a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne), par le biais du service de microscopie confocale (ICTS 'NANBIOSIS'U17) du Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN at the Université d'Alcal, Madrid, Espagne)

Transfection transitoire.

Transfection transitoire avec siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), le vecteur d'expression mammalien pcDNA3 contenant l'ADNc de la 15-hydroxy-prostaglandine déshydrogénase humaine de type sauvage (p15-PGDH) ou la Constructions de plasmide rapporteur de luciférase pour la COX humaine-2(cyclo-oxygénase)phPES2-Luc, humainhypoxieélément de réponse (HRE)p9HIF1-Luc et R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) et la détermination de l'activité de la luciférase ont été effectuées comme décrit ailleurs27,28.

Numération cellulaire et morphologie des cellules/noyaux.

Le nombre de cellules adhérentes a été déterminé par spectrophotométrie avec une méthode modifiée de coloration au cristal violet2. Pour détecter des signes d'apoptose, la morphologie cellulaire a été observée à l'aide d'une microscopie à contraste de phase. Les noyaux cellulaires ont été visualisés après coloration de l'ADN avec DAPI comme décrit précédemment 0, la morphologie apoptotique typique qui a été examinée comprenait le rétrécissement cellulaire, la condensation et la fragmentation nucléaires et la formation de corps apoptotiques. Pour la quantification, six champs ont été examinés dans chaque condition expérimentale de manière aveugle pour estimer le pourcentage de noyaux ayant une apparence semblable à l'apoptose.

Test d'apoptose par cytométrie en flux et test de viabilité cellulaire par test d'exclusion du colorant bleu trypan.

Les cellules adhérentes à la plaque ont été détachées par trypsinisation et, avec les cellules détachées précédemment récupérées du milieu de culture, ont été utilisées pour le dosage.

Le kit de détection d'apoptose Annexin-V-FITC/PI a permis la détection par cytométrie en flux des cellules HK-2 apoptotiques et nécrotiques, comme décrit précédemment7. coloration. Les cellules nécrotiques n'étaient positives qu'au PI et les cellules HK -2 vivantes ne présentaient aucune coloration.

Le test d'exclusion du colorant bleu trypan a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire. Les cellules viables (blanches) et les cellules mortes (bleues) ont été comptées à l'aide d'un microscope optique et d'un hémocytomètre.

Analyses statistiques.

Chaque expérience a été répétée au moins trois fois. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ils ont été soumis à une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Le niveau de signification a été fixé à P inférieur ou égal à 0.05.

Résultats

L'hypoxie induit la mort des cellules tubulaires proximales HK-2.

Hypoxieréduit le nombre de cellules HK -2, tel qu'évalué par le test au cristal violet (Fig. la), et induit également l'arrondissement et le détachement des cellules de la plaque (Fig. lb, panneau supérieur). Comme prévu,hypoxiea déclenché un modèle de mort cellulaire avec des caractéristiques morphologiques claires de l'apoptose (voir la coloration nucléaire avec DAPI sur la Fig. lb, panneau inférieur, à gauche) telles que le rétrécissement cellulaire avec une condensation nucléaire importante, une fragmentation et la formation de corps de type apoptotique.Hypoxie- L'apoptose induite a été confirmée par l'augmentation de la coloration de l'annexine V-FITC, évaluée par cytométrie en flux, et sa prévention avec l'inhibiteur de pan-caspase Z-VAD-FMK (Fig. lc).Hypoxieont également déterminé une diminution du nombre de cellules viables mais n'ont pas induit de changements statistiquement significatifs du nombre de cellules nécrotiques (Fig. lc, encart).

Figure 1. L'hypoxie induit la mort des cellules tubulaires proximales HK-2.(a) Nombre de cellules diminué (dosage au cristal violet). (b) Caractéristiques morphologiques de l'apoptose. Photomicrographies représentatives à contraste de phase (panneau supérieur, grossissement d'origine, 10 ×) Photomicrographies de coloration DAPI (panneau inférieur, grossissement d'origine, 40 ×). (c) Augmentation de l'apoptose (études de cytométrie en flux). Les cellules annexine V plus comprennent les cellules annexine V plus / iodure de propidium (c'est-à-dire les cellules apoptotiques précoces avec une intégrité préservée de la membrane plasmique) et les cellules annexine V plus / iodure de propidium plus (c'est-à-dire les cellules apoptotiques tardives). Encart : Types de populations cellulaires (l'annexine V-/l'iodure de propidium plus les cellules sont des cellules nécrotiques et l'annexine V-/l'iodure de propidium-sont des cellules vivantes). Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au nombre total d'événements. Informations générales :(1) Les cellules ont été incubées pendant 24 h dans des conditions normoxiques (21 % d'O2) ou hypoxiques (1 % d'O,), comme indiqué dans "Methods". L'inhibiteur de pan-caspase Z-VAD-FMK (25 μM) était ajouté 1 h avant le début de l'exposition àhypoxie. (2) Les microphotographies sont des exemples représentatifs de trois expériences indépendantes. Barres et barres d'erreur dans les graphiques : chaque barre représente la moyenne ± SEM de 3 expériences différentes *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoxie;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoxieplus ZVAD.

COX-2(cyclo-oxygénase)La voie des récepteurs /iPGE,/EP intervient dans la mort des cellules tubulaires proximales HK-2 induite par l'hypoxie.

Afin d'évaluer le rôle du COX-2(cyclo-oxygénase)/voie du récepteur iPGE2/EP danshypoxie-induite par la mort des cellules HK-2, nous avons d'abord pré-incubé des cellules avec du célécoxib, un COX-2(cyclo-oxygénase)inhibiteur1 ; AH6809, un antagoniste des récepteurs EP1, EP2 et EP3 ou GW627368X, un antagoniste du récepteur EP433 ; ou avec du vert de bromocrésol ou du bromosul-fophtale dans les deux inhibiteurs de PGT435.PGT a également été renversé par transfection avec de l'ARNsi.

Figure 2. COX-2(cyclo-oxygénase)La voie des récepteurs /iPGE,/EP intervient dans la mort des cellules tubulaires proximales HK -2 induite par l'hypoxie.(a) Prévention de la mort cellulaire par des inhibiteurs de la voie. Panneau supérieur ; Les barres montrent le pourcentage de mort cellulaire totale (à gauche) ou le pourcentage d'annexine V apoptotique plus les cellules (à droite). Avant d'être exposé àhypoxie, les cellules ont été pré-incubées pendant 1 h avec 3 μM de célécoxib (COX-2(cyclo-oxygénase)inhibiteur ); 10 μuM AH6809, （EP1-3 antagoniste des récepteurs）, 10 μM GW627368X（EP4 antagoniste des récepteurs） ; ou avec 50 μM de vert de bromocrésol (BG) ou 25 μM de bromosulfophtaléine (BrS), deux inhibiteurs de PGT. Panneau inférieur : Gauche : Prévention de la mort cellulaire en abattant le PGT par transfection avec un siARN (test d'exclusion de plongée au bleu trypan). Encadré : Efficacité de l'inactivation du PGT (analyse Western blot) À droite : Dépendance à la concentration de l'effet préventif du vert de bromocrésol (BG). (b) Prévention de la mort cellulaire par transfection avec un vecteur d'expression de mammifère contenant l'ADNc de l'enzyme d'inactivation de la prostaglandine 15-hydroxy-prostaglandine déshydrogénase (15- PGDH) (test d'exclusion du colorant bleu trypan). Encart : expression de {{ 11}}PGDH (analyse Western blot) dans des cellules transfectées. (c)Hypoxieinduit une augmentation sensible à la PGT de l'iPGE, Gauche : PGE, l'immunofluorescence dépendante seule ou fusionnée avec une coloration nucléaire avec DAPI est montrée (grossissement original, 40 x) Droite : approche quantitative des images présentées dans le panneau de gauche à l'aide du logiciel Image J. (d) L'inhibiteur de l'activation de l'EGFR AG1478 n'empêche pas l'EGFR de mort cellulaire HK-2. Les cellules ont été pré-incubées pendant 1 h avec 1 μM AG1478 avant d'être soumises àhypoxie. （e） L'inhibiteur de PGT BG ne modifie pas l'expression de Bax et Bcl-2 dans les cellules HK-2 soushypoxie(analyse Western blot). (f) Prévention dehypoxie/mort cellulaire induite par la réoxygénation par les inhibiteurs de la voie (test d'exclusion du colorant bleu trypan). Les cellules ont été pré-incubées avec des inhibiteurs de la voie et soumises àhypoxiecomme en (a). Ensuite, les cellules ont été exposées à la normoxie pendant 3 h. Informations générales : (1) les cellules ont été incubées pendant 24 h dans des conditions normoxiques (21 % O) ou hypoxiques (1 % O,), comme indiqué dans "Méthodes". (2) Les microphotographies sont des exemples représentatifs de trois expériences indépendantes. (3) Les solvants des inhibiteurs (luL/mL milieu) n'ont pas modifié l'effet dehypoxiesur la mort cellulaire (les résultats ne sont pas présentés). (4) Analyse Western blot : une protéine égale a été confirmée en sondant avec un anti- -actine ou un anticorps anti-GAPDH. (5)Barres et barre d'erreur dans les graphiques : chaque barre représente la moyenne ± SEM de 3 expériences différentes.*P<0.01><0.01>hypoxieouhypoxie/réoxygénation.

Comme le montre la figure 2a,hypoxie-la mort cellulaire induite par les tubules proximaux a été évitée dans tous les cas. L'inhibition de l'apoptose par le célécoxib a indiqué que COX-2(cyclo-oxygénase)joue un rôle pertinent danshypoxie-la mort cellulaire apoptotique induite (Fig. 2a, panneau supérieur, à droite). Plus précisément, le fait que l'apoptose ait été empêchée par l'antagonisme des récepteurs EP indique que l'apoptose est médiée par la COX-2(cyclo-oxygénase)-production dépendante de PGE. D'autre part, il est fort probable que l'iPGE, contribue àhypoxie-induit la mort des cellules HK-2 parce qu'elle a été empêchée par ; (i) l'inhibition de la PGT (Fig.2a) ou (i) la surexpression de la 15- PGDH (Fig. 2b), qui inactive l'iPGE2 par son oxydation25 (à noter, la procédure de transfection elle-même a augmenté la sensibilité des cellules HK -2 àhypoxie: la mort cellulaire était de 45-55 % pour la transfection dans les conditions de contrôle, contre 15-20 % dans les cellules non transfectées). Un soutien supplémentaire à la contribution de l'iPGE, àhypoxie-induite par la mort des cellules HK-2, sont nos découvertes précédentes quihypoxiedétermine une augmentation du contenu cellulaire de l'iPGE,1 et que cette augmentation a été empêchée par les inhibiteurs de PGT (Fig. 2c).

Les voies de signalisation MAPK peuvent induire l'apoptose, étant donné que les récepteurs iEP transactivent le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)36, ce qui conduit à l'activation des MAP kinases ERK1/2 et p38 dans les cellules HK-20, nous avons demandé si pré -l'incubation des cellules HK-2 avec l'inhibiteur d'activation de l'EGFR AG1478 empêchéehypoxie-la mort cellulaire induite. Nous avons trouvé des résultats négatifs (Fig.2d) et par conséquent, il est peu probable que la transactivation de l'EGFR médie la mort des cellules HK -2 soushypoxie.

Dans plusieurs modèles expérimentaux, la réduction de l'ATP dérivé des mitochondries pendanthypoxieprovoque une augmentation du rapport d'expression de la protéine pro-apoptotique Bax à la protéine anti-apoptotique Bcl -2, ce qui conduit à la libération de cytochrome C dans le cytosol, à l'activation de la caspase 9, puis au clivage et à l'activation de l'effecteur en aval caspases37,38. Cependant, la pré-incubation avec l'inhibiteur de PGT BG dans des cellules HK-2 soushypoxien'a pas entraîné de changements compatibles avec un changement anti-apoptotique dans l'équilibre entre l'expression de Bc-2 et Bax(Fig.2e), ce qui ne supporte pas un rôle de ces protéines dans la cellule HK-2 mort soushypoxie.

Suite à une exposition hypoxique, des épisodes de réoxygénation (ischémie/lésion de reperfusion) peuvent induire des dommages cellulaires supplémentaires. Le « paradoxe » de la lésion de réoxygénation peut être compris en tenant compte du fait que les cellules subissent des changements spécifiques dans les activités enzymatiques, la fonction mitochondriale, la structure du cytosquelette, le transport membranaire et les défenses antioxydantes en réponse àhypoxie, qui prédisposent alors collectivement aux lésions de réoxygénation39. La réoxygénation contribue aux lésions rénales aiguës lors d'un accident vasculaire cérébral ischémique, d'une transplantation rénale, d'une insuffisance circulatoire ou d'une chirurgie rénale et cardiovasculaire. Dans ce contexte, la valeur thérapeutique potentielle de l'inhibition dehypoxie/mort cellulaire tubulaire proximale induite par la réoxygénation par intervention dans le COX-2(cyclo-oxygénase)La voie des récepteurs /iPGE,/iEP est évidente. Par conséquent, nous avons demandé si l'iPGE négociait spécifiquementhypoxie-induit la mort cellulaire ou médie égalementhypoxie/mort cellulaire induite par la réoxygénation (un modèle in vitro qui imite l'ischémie rénale/lésion de reperfusion in vivo). Comme le montre la Fig.2f, la mort cellulaire (évaluée par le test d'exclusion de plongée au bleu trypan) a été empêchée par COX-2(cyclo-oxygénase)inhibiteur du célécoxib ainsi que par les antagonistes des récepteurs EP AH6809 ou GW627368X. Comme pour la Fig.2a, ces résultats suggèrent que COX-2 joue un rôle pertinent danshypoxie/la mort cellulaire induite par la réoxygénation et, plus précisément, que la mort cellulaire est médiée par COX-2(cyclo-oxygénase)-production dépendante de PGE, puisqu'elle a été empêchée par l'antagonisme des récepteurs EP. Cependant, étant donné que la mort cellulaire n'a pas été empêchée par les inhibiteurs de PGT, le vert de bromocrésol ou la bro-mosulfophtaléine (Fig.2f et Figure supplémentaire 2d), il est plus probable quehypoxie/ La mort des cellules HK -2 induite par la réoxygénation est médiée exclusivement par la PGE extracellulaire.

HIF-1 -régulation transcriptionnelle dépendante de COX-2(cyclo-oxygénase)l'expression des gènes contribue à unehypoxie-augmentation induite de l'iPGE, dans les cellules tubulaires proximales HK-2. PGE, la biosynthèse implique la libération des glycérophospholipides membranaires de l'acide arachidonique par la phospholipase A, suivie de la conversion par les isoenzymes COX de l'acide arachidonique en prostaglandine H, et, enfin, par l'isomérisation de la glande prosta en H, en PGE, par les prostaglandines E synthases comme la PGE synthase microsomale-1 (mPGES-1)19. Nous avons trouvé quehypoxie-l'apoptose induite dans les cellules HK-2 est très probablement médiée par un COX-2(cyclo-oxygénase)-augmentation dépendante de la production de PGE,(Fig.2). Étant donné que COX-2(cyclo-oxygénase)est une enzyme dont l'expression peut être induite parhypoxie, nous avons émis l'hypothèse qu'unhypoxie-augmentation induite de PGE, la production dans les cellules HK-2 pourrait être la conséquence d'une augmentation de l'expression de COX-2(cyclo-oxygénase). Afin de confirmer notre hypothèse, nous avons étudié (i) l'effet dehypoxiesur l'expression de COX-2(cyclo-oxygénase)protéine et ARNm et (ii) l'effet de COX-2(cyclo-oxygénase)inhibiteur célécoxib sur lehypoxie-augmentation induite de l'iPGE, Nos résultats ont indiqué quehypoxiedéterminé de manière transitoire la régulation transcriptionnelle à la hausse de COX-2(cyclo-oxygénase)expression(Fig. 3a,b)et que COX-2(cyclo-oxygénase)l'inhibition a atténué l'augmentation de l'iPGE, dans les cellules HK -2 soushypoxie(Fig.3c). De façon intéressante,hypoxiea également déterminé la régulation positive transitoire de l'expression de la protéine mPGES-1 (Fig, 3a, encart), mais n'a pas affecté l'expression de l'ARNm de mPGES-1 (Fig, 3b. Encart). Ces résultats ont indiqué qu'une expression accrue de COX-2(cyclo-oxygénase)et mPGES-1 est responsable de lahypoxie-augmentation induite de l'iPGE.

Figure 3. Régulation transcriptionnelle dépendante de HIF-la de COX-2(cyclo-oxygénase)l'expression génique contribue à l'augmentation induite par l'hypoxie de l'iPGE, dans les cellules tubulaires proximales HK-2.(a)L'expression de COX-2(cyclo-oxygénase)la protéine est augmentée transitoirement parhypoxie(analyse Western blot). Encart : la protéine d'expression mPGES-1 est également régulée positivement de manière transitoire parhypoxie. (b)Expression COX-2(cyclo-oxygénase)L'ARNm est transitoirement augmenté parhypoxie. Encart : l'expression de l'ARNm mPGES-1 n'est pas affectée parhypoxie. (c) Prévention par le célécoxib, un COX-2(cyclo-oxygénase)inhibiteur, de l'augmentation de l'iPGE, induite parhypoxie. Les cellules ont été préincubées pendant 1 h avec du célécoxib 3 μM. Gauche∶PGE, l'immunofluorescence dépendante seule ou fusionnée avec une coloration nucléaire au DAPI est montrée (grossissement original, 40 ×). Droite : Approche quantitative des images présentées dans le panneau de gauche à l'aide du logiciel Image J. (d) Contribution des mécanismes transcriptionnels. À gauche : l'actinomycine D, inhibiteur de la transcription (Act. D), prévient unehypoxie-augmentation induite du COX-2(cyclo-oxygénase)expression protéique (analyse Western blot). Les cellules ont été prétraitées pendant 1 h avec 1 ug/ml d'Act. D avant d'être exposé àhypoxiependant 3 h.Droite : Augmentation de l'activité d'un COX-2(cyclo-oxygénase)construction de journaliste. (e) L'inhibiteur de HIF-la YC -1 empêchehypoxieCOX transcriptionnelle induite-2(cyclo-oxygénase)régulation à la hausse. Les cellules ont été préincubées pendant 1 h avec 0.5 uM YC-1. Gauche : Prévention de la COX-2(cyclo-oxygénase)régulation à la hausse. Les cellules ont été exposées àhypoxiependant 8h. Centre : Prévention de l'augmentation de l'activité d'un COX-2(cyclo-oxygénase)construction de journaliste. À droite : inhibition de l'activité d'une construction de rapporteur axée sur l'EDH. Les cellules ont été exposées àhypoxiependant 8 h.(f) l'inhibiteur de HIF-la YC-1 augmente la mort cellulaire apoptotique (études de cytométrie en flux). Avant d'être exposé àhypoxie, les cellules ont été pré-incubées pendant 1 h avec 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 inhibe lahypoxie-augmentation induite de l'expression HIF-1a (analyse Western blot). Informations générales : (1) les cellules ont été incubées pendant 24 h dans des conditions normoxiques (21 % O,) ou hypoxiques (1 % O,), comme indiqué dans "Méthodes". (2) Les microphotographies sont des exemples représentatifs de trois expériences indépendantes. (3) Analyse Western blot : une protéine égale a été confirmée en sondant avec un anticorps anti- -actine (4) Barres et barres d'erreur dans les graphiques : chaque barre représente la moyenne ± SEM de 3 expériences différentes *P<0.01 vs.="" other="">

Examiner plus en détail la contribution des mécanismes transcriptionnels à l'augmentation de la COX-2(cyclo-oxygénase)expression des protéines soushypoxie, expression de COX-2(cyclo-oxygénase)a été évaluée dans des cellules HK-2, qui ont été pré-incubées avec l'inhibiteur de transcription actinomycine D avant d'être soumises àhypoxiependant 5h. Comme le montre la Fig.3d,hypoxie-augmentation induite du COX-2(cyclo-oxygénase)l'expression de la protéine a été empêchée par l'actinomycine D. De plus,hypoxiea également déterminé une augmentation de l'activité d'un COX-2(cyclo-oxygénase)construction de promoteur préalablement transfectée dans des cellules HK-2 (Fig.3d à droite). Pris ensemble, les résultats présentés à la Fig. 3d suggèrent que les mécanismes transcriptionnels contribuent à unehypoxie-augmentation induite du COX-2(cyclo-oxygénase)l'expression des protéines. Néanmoins, il y avait un écart entre le moment de l'activation du promoteur COX-2 et le moment de la COX maximale-2(cyclo-oxygénase)Expression de l'ARNm : tandis que l'augmentation transitoire de COX-2(cyclo-oxygénase)L'expression de l'ARNm était maximale après 2 h (Fig.3b), le promoteur COX-2 était activé après 3 h (Fig.3d), ce qui reflète probablement la contribution des mécanismes post-transcriptionnels à l'augmentation de COX{{6 }}(cyclo-oxygénase)expression4. En conséquence, nous supposons que COX-2(cyclo-oxygénase)L'ARNm est stabilisé soushypoxie, ce qui entraînerait une augmentation des niveaux de COX-2(cyclo-oxygénase)Expression d'ARNm sans aucune contribution (à ce moment) d'activité accrue de la COX -2(cyclo-oxygénase)promoteur. Cependant, il est également possible qu'un décalage temporel entre l'activation du promoteur et l'accumulation de substrat mesurable puisse également contribuer à l'écart entre le moment de l'activation du promoteur COX-2 et le moment de la COX maximale{{1 }}(cyclo-oxygénase)Expression de l'ARNm.

HIF-1 est un facteur de transcription hétérodimérique composé de la sous-unité dépendante de l'oxygène et de la sous-unité exprimée de manière constitutive. En dessous dehypoxie, HIF-l s'accumule et entre dans le noyau, où il génère le facteur de transcription HIF-1 après dimérisation avec HIF-1 . HIF-1 favorise alors l'expression de ses gènes cibles en se liant àhypoxie-les éléments réactifs (HRE) présents dans leur région régulatrice et orchestrent ensuite les réponses adaptatives cellulaires pour combattrehypoxie 3. Étant donné quehypoxiepeut activer COX-2(cyclo-oxygénase)expression de manière dépendante de HIF-1-par le biais d'un HRE fonctionnel présent dans la séquence du promoteur COX-22, nous avons examiné le rôle de HIF-l dans unehypoxie-augmentation induite du COX-2(cyclo-oxygénase)expression. Nous avons également examiné l'activité d'une construction de promoteur COX-2 transfectée dans des cellules HK-2. Comme le montre la figure 3e, la pré-incubation avec le HIF-1un inhibiteur YC-1, qui a émousséhypoxie-l'augmentation induite de l'expression de HIF-la et de l'activité d'une construction reporter HRE a entraîné la prévention de l'augmentation de l'expression de COX -2(cyclo-oxygénase)et l'activité du COX-2(cyclo-oxygénase)promoteur construit à HK-2 soumis àhypoxie. En résumé, les résultats sont présentés dans la Fig, 3a-e soutiennent la notion que HIF-1 -régulation transcriptionnelle dépendante de COX-2(cyclo-oxygénase)est responsable de lahypoxie-augmentation induite de l'iPGE2.

Bien que les conséquences de l'activation du HIF-1a surhypoxie-l'apoptose induite sont controversées (probablement parce qu'elles peuvent être dépendantes du contexte), nous avons analysé (de manière préliminaire) le rôle de HIF-1a dans notre système expérimental. Puisque nous avons déjà trouvé cette intervention dans le COX-2(cyclo-oxygénase)/iPGE, la voie du récepteur EP inhibe l'augmentation de l'expression de HIF-la déclenchée parhypoxie8,56 nous avons demandé si l'inhibition de HIF-la entraînait la prévention dehypoxie-induite par l'apoptose des cellules HK-2. Comme le montre la figure 3f, la pré-incubation avec YC-1, un inhibiteur de HIF-l, a en fait augmentéhypoxie-apoptose induite. Par conséquent, il est peu probable que HlF-la

Discussion

Tissuhypoxieest considérée comme étant d'une importance cruciale dans la physiopathologie des maladies rénales chroniques et des lésions rénales aiguës, étant PTC la partie la plus sensible des tubules rénaux contrehypoxie. Ici, nous avons examiné le rôle de PGE, dans les dommages infligés parhypoxieau PTC humain et a constaté que la production accrue d'iPGE provenait de la régulation à la hausse de la COX dépendante de HIF-la -2(cyclo-oxygénase)l'expression des gènes et l'expression accrue de mPGES-1, contribue àhypoxie-la mort cellulaire apoptotique induite dans les cellules HK-2. Étant donné que l'hypoxie tubulaire est un facteur pertinent pour les maladies rénales aiguës et chroniques -2, ces résultats indiquent que le transporteur de prostaglandine PGT est une nouvelle cible thérapeutique dans les maladies rénales.

Hypoxieaugmente non seulement l'iPGE mais également sa libération dans le milieu extracellulaire8, de sorte que la PGE sécrétée (extracellulaire) pourrait également jouer un rôle danshypoxie-apoptose induite (par exemple, déclenchement de cascades apoptotiques par l'activation canonique des récepteurs EP situés au niveau de la membrane cellulaire). Deux études antérieures ont montré que la mort cellulaire soushypoxieétait également due à COX-2(cyclo-oxygénase)-production dépendante de PGE,1345. D'autre part, dans certains types de cellules (fibroblastes, microglie, neurones et lignées cellulaires de leucémie aiguë lymphoblastique), l'apoptose induite par la PGE est médiée par l'activation dépendante de la PGE des récepteurs EP46-48. Nous avons trouvé ici quehypoxieL'apoptose induite par les cellules HK -2 a également été empêchée par l'antagonisme des récepteurs EP (Fig.2a, panneau supérieur, à droite). Mais comme les récepteurs EP ont été classiquement décrits comme des récepteurs de la membrane plasmique, de sorte qu'ils sont inaccessibles pour l'iPGE2-, nous supposons que les récepteurs EP qui médient l'effet apoptotique de l'iPGE, dans les cellules hypoxiques HK-2 sont un sous-ensemble situé au niveau intracellulaire (c'est-à-dire les récepteurs iEP).

Contrairement au rôle de l'iPGE2 danshypoxie-induite par l'apoptose dans les cellules HK-2, nous avons constaté que seule la PGE extracellulaire médiehypoxie/mort des cellules HK -2 induite par la réoxygénation car elle n'a pas été empêchée par les inhibiteurs de la PGT (Fig. 2f). Bien que les mécanismes pathologiques de la lésion cellulaire aprèshypoxie/réoxygénation ne sont pas complètement compris, il est admis que la mort cellulaire se produit en grande partie par la production excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Cela est particulièrement vrai pour les cellules HK-249,50. Cependant, bien quehypoxiepeut également augmenter la production de ROS, à notre connaissance, il n'y a aucune preuve que les ROS jouent un rôle important danshypoxie-induit la mort des cellules HK-2. Cela suggère que les effets létaux de l'hypoxie et de l'hypoxie/réoxygénation dans les cellules HK-2 sont médiés par différents mécanismes, ce qui pourrait expliquer pourquoi BG et BS protègent contrehypoxiemais pas contrehypoxie/réoxygénation. Par conséquent, l'inhibition de la PGT pourrait apporter des avantages thérapeutiques dans la PTC contre les lésions cellulaires induites par l'hypoxie, mais pas contre l'effet délétère dehypoxie/réoxygénation.

HIF-1 -régulation à la hausse dépendante de COX-2(cyclo-oxygénase)a été un événement critique pourhypoxie-induite par l'apoptose des cellules HK -2 (Fig.3e). Cependant, notre observation selon laquelle l'inhibiteur de HIF YC -1 améliorait la mort cellulaire apoptotique (Fig.3f) est déconcertante, bien que des rapports précédents aient déjà montré des résultats similaires1. Une explication possible est un scénario hypothétique dans lequel HIF-la intervient non seulement dans la régulation positive pro-apoptotique de COX-2(cyclo-oxygénase)mais aussi la régulation à la hausse des molécules protectrices. En effet, HIF-1-régulait l'expression de molécules protectrices contrehypoxietels que le long ARN non codant DARS-AS1'et le microARN-2103 a été spécifiquement trouvé dans les cellules HK-2. Cependant, bien que ces éléments de preuve soutiennent notre scénario hypothétique, des expériences spécifiques doivent être réalisées pour le confirmer.

Étude de la réponse des cellules rénales àhypoxiepeut améliorer notre compréhension de la pathologie rénale. Nous avons étudié, bien que de manière préliminaire, le rôle d'une augmentation du rapport d'expression de la protéine pro-apoptotique Bax à la protéine anti-apoptotique Bcl-2 danshypoxie-apoptose induite dans les cellules HK-2. Nos résultats ont indiqué que l'inhibition de PGL n'entraînait pas de changements compatibles avec un changement anti-apoptotique dans l'équilibre entre l'expression de Bcl-2 et Bax(Fig.2e), ce qui ne supporte pas un rôle de ces protéines dans Mort des cellules HK -2 dépendantes de l'iPGE soushypoxie. À notre connaissance, il n'y a que deux études sur l'implication de l'axe Bcl{{0}}/Bax dans l'apoptose induite par l'hypoxie dans le PTC et les deux impliquaient des concentrations d'O, anoxiques ou presque anoxiques5 Lorsque PTC a été exposé à 0,2 % d'O., l'expression de Bax est restée inchangée et l'apoptose était liée à une diminution du degré d'expression de Bcl-2. Cependant, l'expression de Bcl-2 n'a pas été affectée par 1 % d'O, malgré le présence d'apoptose, ce qui coïncide avec nos résultats Par conséquent, d'autres mécanismes qui n'impliquent pas nécessairement des changements quantitatifs dans l'expression de Bcl -2 ou de Bax doivent être pris en compte : par exemple, l'induction de l'apoptose dans des cellules de gliome en culture par iPGE2 ne nécessite que son association physique avec Bax, qui déclenche la translocation de Bax vers les mitochondries 202. Ainsi, le mécanisme par lequel l'iPGE contribue à l'apoptose des cellules HK-2 mérite une étude plus approfondie.

Notre groupe a découvert qu'un COX-2(cyclo-oxygénase)-augmentation dépendante de l'iPGE, médie la mort apoptotique dans les cellules HK -2 exposées au cisplatine ', corps apoptotiques7" ethypoxie(nos résultats actuels). Étant donné que la PGE est rapidement libérée à l'extérieur de la cellule après avoir été synthétisée2, son transport vers l'intérieur par la PGl joue un rôle essentiel dans l'apoptose induite par l'iPGE dans les cellules HK-2. Par conséquent, chaque fois que les dommages PTC sont médiés par l'iPGE, le traitement avec des inhibiteurs de PGT pourrait être une approche thérapeutique utile avec des applications potentielles telles que la prévention des dommages PTC induits par le cisplatine, l'inhibition de la propagation des lésions tubulaires à travers les corps apoptotiques ou la limitation de la effet délétère dehypoxiesur PTC.