Le lecteur d'ARN M6 A YTHDF2 contrôle l'immunité antitumorale et antivirale des cellules NK, partie 3

YTHDF2 est nécessaire à la survie, à la prolifération et aux fonctions effectrices des cellules NK médiées par l'IL-15

L'IL-15 est l'une des cytokines, sinon la plus importante, pour les fonctions pléiotropiques des cellules NK. Nous et d'autres avons déjà découvert que l'IL-15 joue un rôle clé dans la régulation de l'homéostasie, de la survie et des fonctions effectrices des cellules NK (Becknell et Caligiuri, 2005 ; Carsonet al., 1997 ; Carson et al., 1994 ; Wang et al., 2019b ; Yu et al., 2013).

La pléiotropie des cellules fait référence à leur capacité à remplir différentes fonctions dans différents environnements. La pléiotropie cellulaire est étroitement liée à l’immunité, car de nombreuses cellules du système immunitaire peuvent jouer divers rôles différents.

Dans le système immunitaire, les lymphocytes T constituent un type de cellule très critique. Ils reconnaissent et attaquent les agents pathogènes, tout en régulant l’activité d’autres cellules immunitaires. La pléiotropie des lymphocytes T est très importante car lorsque le système immunitaire rencontre un nouvel agent pathogène, les lymphocytes T doivent jouer différents rôles sur une courte période pour réagir efficacement. Par exemple, lorsque le système immunitaire rencontre une infection bactérienne, les lymphocytes T doivent jouer le rôle de tuer les bactéries, et lorsque le système immunitaire rencontre une infection virale, les lymphocytes T doivent jouer le rôle de régulation d’autres cellules immunitaires.

De plus, dans le système immunitaire, une classe de cellules appelées macrophages a également des effets pléiotropes. Ils peuvent phagocyter et décomposer les agents pathogènes étrangers, et peuvent également activer d’autres cellules immunitaires pour attaquer les agents pathogènes. La pléiotropie des macrophages est importante car ils doivent jouer différents rôles dans différents environnements. Par exemple, dans les infections virales, les macrophages doivent sécréter certaines substances pour combattre le virus, tandis que dans les infections bactériennes, les macrophages doivent engloutir et digérer les bactéries pour éliminer l’agent pathogène.

En résumé, il existe une relation étroite entre la pléiotropie cellulaire et l’immunité. Les cellules pléiotropes peuvent jouer différents rôles dans des environnements infectés par différents agents pathogènes, renforçant ainsi la capacité du système immunitaire à réagir et améliorant l'immunité du corps contre divers agents pathogènes. Par conséquent, nous devons prêter attention à la pléiotropie des cellules et également renforcer la culture de l’immunité pour maintenir la santé humaine. On voit que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire, car Cistanche deserticola peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance. Ces substances sont très importantes pour la mémoire et l’apprentissage. En outre, Cistanche deserticola peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutriments et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau.

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Dans la présente étude, nous montrons que les niveaux d'ARNm et de protéines de YTHDF2 régulés positivement par l'IL -15 dans les cellules NK (Fig. 6 A; et Fig. 1, D – F). Par conséquent, nous avons supposé que YTHDF2 était nécessaire à la survie médiée par l’IL-15 et aux fonctions effectrices des cellules NK.

Nous avons d'abord tenté d'identifier des facteurs de transcription potentiels en aval de la signalisation IL-15 qui régulent directement l'expression de YTHDF2. Nous avons analysé l'Encyclopédie des éléments d'ADN en utilisant la base de données Genome BrowserDatabase de l'Université de Californie à Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu), qui fournit des prédictions sur les sites de liaison sur l'ensemble du génome, en combinaison avec JASPAR (//jaspar.genereg .filet).

Nous avons constaté que STAT5, qui est un facteur clé en aval de l'IL-15 dans les cellules NK, possède quatre sites de liaison à moins de 2 kb en amont du site d'initiation de la transcription (TSS) de Ythdf2, ce qui indique que l'IL-15 peut positivement réguler la transcription de Ythdf2 dans les cellules NK de souris via STAT5.

En utilisant l'inhibiteur de STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), nous avons montré que l'inhibition de STAT5 entraînait une diminution de Ythdf2 aux niveaux d'ARNm et de protéines dans les cellules NK murines (Fig. S4, A et B).Pour confirmer davantage que YTHDF2 est un facteur en aval régulé par STAT5, nous avons utilisé des souris Stat5fl/fl Ncr1-iCre (ci-après appelées souris Stat5ΔNK), où STAT5 est spécifiquement supprimé dans les cellules NK de souris (Wiedemann et al., 2020).

Nous avons traité les cellules spléniques NK de souris Stat5WT et Stat5ΔNK avec IL-15. Nous avons constaté que YTHDF2 diminuait considérablement dans les cellules NK des souris Stat5ΔNK par rapport aux cellules NK des souris Stat5WT aux niveaux d'ARN et de protéine (Fig. 6, B et C; et Fig. S4, C et D).

Le test du rapporteur luciférase a montré que STAT5a et STAT5b activaient directement la transcription du gène Ythdf2 (Fig. 6, D et E). Les résultats de l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) – qPCR ont montré que STAT5 présente un enrichissement significatif sur quatre sites par rapport au contrôle IgG normal, indiquant une liaison directe dans les cellules NK de souris (Fig. 6 F). Ensemble, nos résultats démontrent que l'expression de YTHDF2 est régulée par STAT5 en aval de la signalisation IL-15 dans les cellules NK.

Nous nous sommes ensuite demandé si les cellules NK déficientes en Ythdf2- étaient défectueuses dans leur réponse à l'IL-15. Nous avons isolé des cellules NK spléniques de souris Ythdf2ΔNK et de souris Ythdf2WT et les avons cultivées in vitro en présence d'IL -15. Nous avons constaté que la croissance des cellules NK était significativement diminuée chez les souris Ythdf2ΔNK par rapport aux souris Ythdf2WT (Fig. 6 G). Le test de marquage CellTrace Violet (CTV) a montré que la prolifération des cellules NK était altérée par le déficit en Ythdf2 (Fig. 6 H).

 L'analyse de la distribution du cycle cellulaire a révélé une fraction significativement accrue de cellules NK provenant de souris Ythdf2ΔNK dans la phase G0/G1, mais une fraction significativement diminuée de cellules NK provenant de souris Ythdf2ΔNK dans la phase S (Fig. 6 I), suggérant que le déficit en Ythdf2 résulte en arrêt de phase G0/G1 dans les cellules NK.

De plus, il y avait une augmentation de deux à trois fois du nombre de cellules NK apoptotiques (annexine V + Sytox-Blue +/-) des souris Ythdf2ΔNK par rapport à celles des souris Ythdf2WT (Fig. 6 J), indiquant la survie défectueuse des cellules NK après la perte de Ythdf2. Ces résultats suggèrent que YTHDF2 régule la réactivité des cellules NK à l'IL-15 in vitro. Étant donné que l'IL-15 est mal traduite et sécrétée in vivo à un état d'équilibre (Corbel et al., 1996 ; Fehniger et al., 2001), pour explorer si les cellules NK déficientes en Ythdf2- sont défectueuses dans leur réponse à l'IL-15 in vivo, nous avons traité des souris avec de l'IL-15.

Nous avons constaté que les cellules Ythdf2-déficientes par rapport aux cellules WT NK présentaient une prolifération cellulaire significativement réduite et une apoptose cellulaire accrue lorsque les souris étaient traitées avec de l'IL-15 (Fig. 6 K ; et Fig. S4, E – J). Ces données suggèrent que YTHDF2 régule la réactivité des cellules NK à l'IL-15, en particulier dans certaines conditions avec un niveau élevé d'IL-15. Nous avons également constaté que les niveaux d'ARNm et de protéines d'IFN-, de granzyme B et de perforine étaient significativement réduits dans les cellules NK Ythdf2ΔNK par rapport aux cellules NK Ythdf2WT en réponse à l'IL-15 (Fig. 6, L – N), indiquant que YTHDF2 contribue également aux fonctions effectrices des cellules NK médiées par l'IL -15 in vitro.

Collectivement, nos données démontrent que YTHDF2 est nécessaire pour la survie, la prolifération et les fonctions effectrices des cellules NK médiées par l'IL-15. Nous avons ensuite étudié les mécanismes en aval par lesquels YTHDF2 régule la survie, la prolifération et la fonction effectrice des cellules NK médiées par l'IL-15. Nous avons constaté que les cellules NK des souris Ythdf2ΔNK et Ythdf2WT présentaient des niveaux similaires de récepteurs IL -15 CD122 (IL -15 R ) et CD132 (IL -15 R c ; Fig. S4 K). La signalisation IL-15 est médiée par au moins trois voies de signalisation en aval dans les cellules NK : Ras – Raf – MEK – ERK, PI3K – AKT – mTOR et JAK1/3 – STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Pour étudier quelle voie de signalisation est régulée par YTHDF2 dans les cellules NK, nous avons examiné les niveaux de phosphorylation de ERK, AKT, S6, STAT3 et STAT5 dans les cellules NK de souris Ythdf2ΔNK ou de souris Ythdf2WT après stimulation avec IL -15.

Les résultats ont montré que le déficit en Ythdf2 n'affectait pas la phosphorylation de ERK, AKT, S6 et STAT3 lors de la stimulation par IL-15 (Fig. S4, L et M), mais inhibait de manière significative l'activation de STAT5, comme en témoigne la réduction des niveaux de phosphorylation de STAT5 dans Ythdf{{ 7}}cellules NK déficientes que celles des cellules NK de souris Ythdf2WT (Fig. 6 O), ce qui indique que YTHDF2 est requis pour une signalisation IL-15/STAT5 optimale dans les cellules NK activées.

Parce que nous avons montré que STAT5 phosphorylé en aval de IL-15 se lie au promoteur de Ythdf2 (Fig. 6, D – F), et que nous avons démontré ici que YTHDF2 est nécessaire pour une phosphorylation optimale de STAT5, nos données suggèrent une boucle de rétroaction positive STAT5 – YTHDF2 en aval. d'IL-15 qui peut contrôler la survie, la prolifération et les fonctions effectrices des cellules NK.

L'analyse à l'échelle du transcriptome identifie Tardbp comme une cible YTHDF2 dans les cellules NK

Pour aborder le mécanisme moléculaire par lequel YTHDF2 régule les cellules NK, nous avons d'abord effectué le séquençage de l'ARN (seq) dans les cellules NK Ythdf2WT et Ythdf2ΔNK étendues par IL-2. La suppression de Ythdf2 dans les cellules NK a abouti à 617 gènes exprimés de manière différentielle, dont 252 gènes régulés positivement et 365 gènes régulés négativement (Fig. S5 A).

L'analyse de l'ontologie des gènes (GO) a montré que les gènes différentiellement exprimés étaient enrichis de manière significative dans les processus du cycle cellulaire, de la division cellulaire et des processus liés à la division cellulaire, notamment la cytokinèse mitotique, la ségrégation des chromosomes, le fuseau, le nucléosome, le corps médian et le chromosome (Fig. 7). UN).

L'analyse de l'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) a démontré un enrichissement significatif des ensembles de gènes caractéristiques des cibles E2F, du point de contrôle G2/M et du fuseau mitotique dans les cellules Ythdf2ΔNKNK (Fig. S5 B). Les gènes liés au cycle cellulaire et à la division cellulaire, notamment Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 et Plk1 (Bertoli et al., 2013), étaient significativement diminués dans les cellules NK des souris Ythdf2ΔNK (Fig. 7 B ).

Les gènes de ségrégation des fuseaux et des chromosomes tels que Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 et Tpx2 (Gorbsky, 2015) étaient également significativement régulés négativement dans les cellules NK de souris Ythdf2ΔNK par rapport aux cellules NK de souris Ythdf2WT (Fig. 7 C).

De plus, les gènes de survie cellulaire, notamment Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) et Rffl (Yanget al., 2007), étaient significativement diminués dans les cellules NK des souris Ythdf2ΔNK (Fig. 7D). Les gènes de fonction effectrice des cellules NK, notamment Klrk1, Ncr1, CD226 et Gzma (Bezman et al., 2012), étaient également significativement régulés négativement dans les cellules NK de souris Ythdf2ΔNK (Fig. 7 D).

Ces données confirment nos rôles caractérisés de YTHDF2 dans la régulation de la prolifération, de la survie et des fonctions effectrices des cellules NK. Nous avons ensuite effectué m6A-seq dans des cellules NK expansées par IL-2 de souris Ythdf2WT et Ythdf2ΔNK. L'analyse en composantes principales a montré que trois répétitions biologiques de chaque génotype se sont regroupées (données non présentées), suggérant une bonne répétabilité des échantillons m6A-seq.

L'analyse d'optimisation hypergéométrique de l'enrichissement de motifs (HOMER) a identifié le motif consensus m6A (GGAC), indiquant l'enrichissement réussi des transcrits modifiés par m6A (Fig. 7 E). Les modifications de m6A étaient principalement localisées dans les transcrits codant pour les protéines, et les pics étaient enrichis dans les 59 régions non traduites (UTR) et 39UTR, en particulier autour des codons de départ et d'arrêt (Fig. 7 F et Fig. S5 C).

L'analyse d'enrichissement GO des gènes avec des pics de m6A a révélé que la plupart des transcrits marqués par m6A dans les cellules NK étaient enrichis dans des voies impliquées dans le cycle cellulaire et la prolifération cellulaire (Fig. S5 D).

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