Le rôle mélanogénique dépendant du sérum/PDGF du niveau infime de la kinase oncogène PAK1 dans les cellules de mélanome prouvé par le test de kinase hautement sensible

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Sommaire:Nous avons précédemment démontré que la kinase oncogène PAK4, que les mélanomes et les mélanocytes normaux expriment à un niveau très élevé, est essentielle à leurmélanogénèse. Dans la présente étude, en utilisant le test de kinase "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) très sensible, nous avons étudié le potentiel mélanogénique d'une autre kinase oncogène PAK1, que les cellules de mélanome (B16F10) n'expriment qu'à un niveau très infime. Après avoir transfecté des cellules de mélanome avec PAK1-shRNA pour faire taire le gène PAK1, la teneur en mélanine,tyrosinasel'activité et l'activité kinase de PAK1 ont été comparées entre le type sauvage et les transfectants. Nous avons constaté que (i) PAK1 est activé de manière significative par des hormones mélanogènes telles que IBMX (3-isobutyl-1-méthyl xanthine) et -MSH (hormone stimulant les mélanocytes), (ii) faisant taire le gène PAK1 endogène dans cellules de mélanome par le biais de shRNA spécifiques à PAK1-réduit à la fois la teneur en mélanine ettyrosinaseactivité en présence d'hormones sériques et mélanogènes au niveau basal, (iii) la PAK1 de type sauvage ajoutée de manière exogène dans les cellules de mélanome augmente le niveau de mélanine inductible par la -MSH de plusieurs fois sans affecter le niveau basal, et (iv) - La mélanogénèse induite par MSH/IBMX ne se produit guère en l'absence de sérum ou de PAK1, ce qui indique clairement que PAK1 est essentielle principalement pour le sérum et MSH/IBMX-dépendants.mélanogénèse, mais pas la base, dans les cellules de mélanome. Les résultats de cette étude pourraient fournir la première base scientifique pour expliquer pourquoi une grande variété de PAK 1-bloquants à base de plantes tels que le CAPE (ester phénéthylique de l'acide caféique), la curcumine et la shikonine dans les cosmétiques sont utiles pourblanchiment de la peau.

Mots clés:PAK1,mélanogénèse, mélanomes,tyrosinase, MITF,blanchiment de la peau, sérum

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Introduction

La couleur des poils, des iris des yeux et de la peau est contrôlée par une famille de pigments appelés mélanines. La source intracellulaire de mélanine est la tyrosine et est convertie en mélanine par une série d'oxydation enzymatique (hydroxylation) qui impliquetyrosinase, TRP (protéine liée à la tyrosinase) 1 et TRP2. L'expression des gènes codant pour ces enzymes mélanogènes nécessite au moins deux facteurs de transcription oncogènes/mélanogènes (MTF) : la bêta-caténine et le MITF (facteur de transcription associé à la microphtalmie). La majorité des composés à base de plantes dansblanchiment de la peaules cosmétiques inhibent directement ces enzymes mélanogènes ou régulent à la baisse les MTF. Les analogues de la tyrosine tels que l'acide kojique appartiennent à la première catégorie (tyrosinaseinhibiteurs), tandis que la majorité des restes tels que le CAPE (ester phénéthylique de l'acide caféique), la curcumine et la shikonine appartiennent à la deuxième catégorie (régulateurs MTF) (1,2). Fait intéressant, bon nombre de ces régulateurs MTF, notamment CAPE, la curcumine, la shikonine et la cucurbitacine, sont connus pour bloquer la kinase oncogène/vieillissante PAK1 (RAC/CDC42-kinase activée 1) (3-5). Ainsi, il est très probable que PAK1 soit impliqué dans l'activation de ces facteurs de transcription mélanogéniques/oncogènes dans les cellules ciliées, les iris des yeux ou les mélanocytes de la peau. En effet, au moins la bêta-caténine fait partie des substrats directs de PAK1 (6). PAK1 phosphoryle la bêta-caténine au Ser 675 pour l'activation, conduisant à une transformation maligne. De plus, la bêta-caténine est essentielle pour l'activation de MITF, conduisant àmélanogénèseou/et l'oncogenèse des mélanocytes (7).

Fait intéressant, cependant, il a été récemment révélé que l'inactivation du gène PAK1 en soi chez les souris pigmentées ne produit aucune souris albinos (Hong He et al., observation non publiée), ce qui indique clairement qu'au moins la mélanogénèse basale dans les cellules ciliées et les yeux iris est indépendant de PAK1, bien que la contribution de PAK1 à la peaumélanogénèsereste à préciser.

Nous avons précédemment montré que la kinase oncogène PAK4 (CDC42-kinase dépendante 4) est fortement exprimée dans les mélanomes et les lignées cellulaires de mélanocytes normaux, et responsable de leur mélanogénèse, activant CREB/beta-caténine-MIFT-tyrosinasetandis que PAK2 (RAC/CDC42-activated kinase 2), un autre membre hautement exprimé de la famille PAK, ne joue aucun rôle dans leur mélanogénèse (8).

Dans cette étude, nous fournissons la première preuve biochimique d'un rôle spécifique d'une autre kinase oncogène appelée PAK1 dans la peaumélanogénèse, malgré le fait que son niveau d'expression est infime : le silençage induit par le shRNA du gène PAK1 dans les mélanocytes (B16F10) dérivés du mélanome de souris a réduit de manière significative la -MSH/IBMX-inductiblemélanogénèseau niveau basal, tandis que la surexpression du gène PAK1 a stimulé la mélanogénèse induite par -MSH sans affecter le basal. De plus, nous avons découvert que la mélanogenèse induite par -MSH/IBMX nécessite un facteur sérique qui est très probablement PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes). Dans le milieu sans sérum, seule la basemélanogénèsese déroule.

cistancheréduire l'activité de la tyrosinase

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériaux

Les cellules de mélanome B16F10 ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (Rockville, MD, États-Unis). Les plasmides PAK1-SureSilencing, la transfection attractive, le kit maxi de plasmide endofree® ont été achetés auprès de Qiagen (Valencia, CA 91355, USA). Les anticorps primaires PAK1-, les anticorps secondaires biotinylés, le réactif signalfireTM ECL ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Le réactif Kinase Glo et l'ATP (kit ATP_Glo kinase) ont été achetés auprès de Promega (Madison, Wisconsin, États-Unis). La lipofectamine et les cellules compétentes JM109 ont été achetées chez Invitrogen et Life Technology. AG1295 et AG1478 ont été achetés chez Calbiochem (San Diego, CA, USA). Tous les autres produits chimiques, y compris le PDGF-bb humain, ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Silençage du gène PAK1 dans les mélanocytes de souris (B16F10) par transfection stable avec un shARN spécifique de PAK 1- de souris

2.2.1. Culture de cellules

Des cellules de mélanome B16F10 ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de FBS activé par la chaleur et de 1 % de pénicilline/streptomycine (10,000 U/mL et 100 µg/mL) à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.

2.2.2. Transfection stable avec le shRNA spécifique de PAK1- de souris

La transfection par ShRNA de la lignée cellulaire B16F10 a été réalisée essentiellement selon la même procédure décrite précédemment (9), mais avec des shRNA spécifiques à la PAK 1- de souris (# KM04553, Qiagen). Les quatre clones distincts suivants de shARN ont été utilisés pour la transfection : le clone 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), le clone 2 (CATCAAGAGGTGACAATATTCT), le clone 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) et le clone 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) ainsi que le shRNA non ciblé shCONTROL comme contrôle négatif (WT) . Cependant, dans cette étude, les clones 1 et 2 se sont avérés plus efficaces que les clones 3 et 4 pour faire taire le gène PAK1 de souris dans cette lignée de mélanocytes (données non présentées). Des transfectants stables ont été sélectionnés en présence de G418 (1 mg/mL) qui tue plus de 99 % des cellules non transfectées.

2.2.3. Analyse Western-blot du niveau de protéine PAK1 et test in vitro de l'activité kinase de PAK1 dans les transfectants

2.2.3.1. Analyse Western blot

Afin de quantifier le niveau extrêmement faible de PAK1 à la fois dans la lignée cellulaire témoin (WT) et dans les transfectants silencieux PAK 1- (résistants au G418-), en minimisant les niveaux de "bruit non spécifique", nous avons effectué analyse par transfert en utilisant un anticorps polyclonal de lapin contre PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) comme anticorps primaire. Brièvement, chaque clone a été ensemencé à la concentration de 2 × 105 cellules/puits dans une plaque à 6 puits, pré-cultivé pendant 48 h, et les lysats cellulaires ont été bouillis dans 25 µL de tampon SDS-PAGE pendant 5 min. Huit µL (contenant 15 µg de protéines totales) de chaque surnageant par fente ont été utilisés pour SDS-PAGE. La nitrocellulose a été buvardée avec l'IgG anti-PAK1 (dilution 1: 1, 000 comme anticorps primaire) et comme anticorps secondaires, l'IgG anti-lapin liée à la HRP et l'IgG anti-biotine (# 7074, # 7075, Cell Signaling) ont été utilisés pour détecter à la fois les bandes PAK1 et -actine qui ont finalement été visualisées avec le système ECL d'Amersham. Les tests de Western blot étaient représentatifs de trois expériences indépendantes.

2.2.3.2. Dosage de la kinase "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) pour PAK1 dans les cellules de mélanome

L'activité kinase de PAK1 dans les mélanocytes WT et les transfectants shRNA (SH) a été mesurée par une modification substantielle (5) d'une méthode vieille de dix ans (que nous avons baptisée "Macaroni-Western") développée par un groupe italien (1{{39 }}). En bref, des lignées cellulaires de mélanome B16F10 (WT ou SH, 2 × 105 cellules/mL) ont été pré-cultivées sur une plaque à puits 6- pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 100 nM -MSH ou 100 µM IBMX pendant 48 h. Les cellules ont été rompues par un tampon de lyse contenant 50 mM de Tris HCl pH 7,5 et 150 mM de NaCl et 1 % de Triton-X. Pour l'immunoprécipitation (IP) de PAK1, les lysats cellulaires éliminés ont été incubés avec des IgG anti-PAK1 (dilution 1:50) et des billes de protéine A-agarose pendant 1-2 h dans la chambre froide avec agitation continue par un mélangeur rotatif (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Japon). L'IP résultant (PAK1) de chaque lysat a été incubé avec le kit de dosage ATP Glo kinase (Promega) en présence d'ATP et de MBP (protéine basique de la myéline) pendant 1 h à 37 degrés, et le niveau d'ATP restant a été mesuré par l'ATP- réaction dépendante de la luciférine-luciférase qui génère éventuellement une luminescence (10). La suspension finale a été centrifugée et le surnageant a été transféré dans une plaque 96-puits pour lecture. La luminescence a été enregistrée par le lecteur de microplaques MTP-880Lab (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japon) avec un temps d'intégration de 0,5 s par puits.

2.3. Mesure de la teneur en mélanine et de l'activité tyrosinase chez les transfectants

2.3.1. Mesure de la teneur en mélanine

La teneur en mélanine a été déterminée comme décrit précédemment (11). En bref, des cellules B16F10 (transfectants shRNA spécifiques de type sauvage ou PAK1-) ont été étalées à une densité de 2 × 104 cellules/puits dans une plaque à puits 24-. Après 24 h de culture, 100 µM d'isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) ou 100 nM de -MSH ont été ajoutés et incubés pendant 72 h supplémentaires à 37 degrés. Les cellules ont été lavées deux fois avec un tampon phosphate, puis lysées avec 500 µL d'une solution contenant 1 M de NaOH et 10 % de DMSO et incubées à 80 degrés pendant 1 h, pour solubiliser la mélanine, et la teneur en mélanine a été mesurée à 490 nm. Pour comparer la teneur en mélanine dans les cellules de type sauvage et transfectées, la quantité totale de mélanine produite par les mélanocytes de type sauvage a été considérée comme le contrôle (100 %) et celle des transfectants a été calculée en conséquence.

2.3.2. Dosage de l'activité de la tyrosinase intracellulaire

Tyrosinasel'activité a été déterminée comme décrit précédemment (12), avec une légère modification. Les cellules B16F10 (de type sauvage ou les transfectants) ont été étalées à une densité de 2 × 104 cellules/puits, et après 24 h de culture, 100 µM IBMX ou 100 nM -MSH ont été ajoutés et incubés pendant 72 h supplémentaires à 37 degrés . Les cellules ont ensuite été lavées avec un tampon phosphate glacé et lysées avec un tampon phosphate (pH 6,8) contenant 1 % de Triton-X (500 µL/puits). Les plaques ont été congelées à -80 degrés pendant 30 min. Après décongélation, 100 µL de L-DOPA à 1 % ont été ajoutés à chaque puits. Après incubation à 37 degrés pendant 2 h, l'absorbance a été mesurée à 490 nm.

2.4. Mesure de la teneur en mélanine dans les mélanocytes de type sauvage et PAK1-surexprimant après traitement -MSH

En utilisant le vecteur Myc (2 µg), les mélanocytes (B16F10) ont été transfectés de manière transitoire avec soit la PAK1 de type sauvage (WT) soit la PAK1 dite "constitutivement activée" (CA) portant la mutation T423E. Après 3 jours de culture, chaque clone transfecté a été récolté pour une nouvelle expérience. L'effet de la surexpression de PAK1- sur la teneur en mélanine a été mesuré par les mêmes procédures décrites précédemment (8). En bref, les mélanocytes, soit la surexpression de type sauvage, soit la surexpression de PAK1- qui expriment soit la PAK1 de type sauvage, soit son mutant CA, ont été incubés avec 100 nM de MSH pendant 3 jours. Les cellules ont été lysées avec une solution contenant 1 M de NaOH et 20 % de DMSO pour dissoudre la mélanine, et sa teneur a été déterminée à 405 nm.

2.5. Mélanogénèse en milieu sans sérum

Des cellules B16F10 (transfectants shRNA spécifiques de type sauvage ou PAK1-) ont été étalées à une densité de 2 × 104 cellules/puits dans une plaque 24-puits en présence de 10 % de FBS. Après 24 h d'incubation, le milieu de culture est remplacé par un milieu sans sérum, et cultivé pendant 72 h supplémentaires avec ou sans IBMX 100 µM ou 100 nM -MSH pour mesurer la teneur en mélanine.

2.6. Effet des inhibiteurs des récepteurs PDGF/EGF sur la mélanogénèse dépendante du sérum

2 × 104 cellules B16F10 ont été ensemencées dans chaque puits pendant 24 h dans un milieu contenant 10 % de FBS, puis cultivées pendant 72 h supplémentaires dans le milieu frais contenant 100 nM -MSH et les éléments suivants : (1) pas de sérum, (2) 10 % FBS seul, (3) 10 % FBS plus 2 µM AG1295 (inhibiteur du récepteur PDGF) et (4) 10 % FBS plus 400 nM AG1478 (inhibiteur du récepteur EGF), pour mesurer la teneur en mélanine.

2.7. analyses statistiques

Les données sont exprimées en valeurs moyennes avec leurs erreurs standard. Les comparaisons statistiques ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test à plages multiples de Duncan. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de SAS (version 9.2 ; SAS Institute, Cary, Caroline du Nord, États-Unis), et p inférieur ou égal à 0.05 a été considéré comme significatif.

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3. Résultats

3.1. Activation de PAK1 dans une lignée cellulaire de mélanome (B16F10) par des hormones mélanogènes

Deux hormones mélanogènes, -MSH (hormone de stimulation des mélanocytes) et IBMX (3-isobutyl-1-méthyl xanthine) sont souvent utilisées pour stimulermélanogénèsedans les mélanocytes tels que la lignée cellulaire de mélanome B16F10. Ainsi, nous avons d'abord examiné si ces hormones peuvent activer PAK1 dans cette lignée cellulaire, bien que le niveau de protéines de PAK1 y soit extrêmement faible, comparé à ceux de PAK2 et PAK4 (8). Pour surveiller les changements dans l'activité kinase de PAK1 dans les cellules, nous avons récemment développé un test de kinase hautement sensible/spécifique appelé protocole de test de kinase « Macaroni-Western » (IP ATP-Glo) en combinant l'immuno-précipitation (IP) de PAK1 à partir de cellules lysats et le kit ATP_Glo kinase de Promega (5). En utilisant ce test de kinase, nous avons constaté que -MSH (100 nM) et IBMX (100 µM) activent PAK1 dans les cellules de mélanome, avec -MSH étant plus puissant que IBMX (voir la figure 1). Cependant, nous devons rappeler aux lecteurs que l'activation du pli de PAK1 montrée ici n'est qu'apparente, car au cours de ce test chronophage IP et kinase (plus de 3 h au total) se déroulant sans ces hormones mélanogènes, PAK1 serait progressivement normalisé sur temps. En d'autres termes, nous ne pouvons pas figer le statut exact de la kinase de PAK1 à la fin de la culture cellulaire traitée avec ces stimulateurs, et l'activation du pli n'est qu'un reflet sous-estimé de l'activation de PAK1 survenue pendant la culture cellulaire par ces simulateurs.

3.2. Silençage du gène PAK1 par les shARN dans la lignée cellulaire de mélanome de souris

Afin d'étudier plus avant biochimiquement si PAK1 contribue à lamélanogénèsedans les cellules de la peau (mélanocytes), nous avons transfecté de manière stable la lignée cellulaire de mélanome B16F10 avec un shARN spécifique à PAK 1- de souris pour faire taire sélectivement le gène PAK1.

3.2.1. Faire taire le gène PAK1 dans les mélanocytes

Notre analyse préliminaire par Western blot a suggéré que dans deux clones silencieux PAK 1- distincts (SH1 et 2), les niveaux de protéine PAK1 sont significativement (d'environ 75 %) réduits, mais le taux de croissance de cette lignée cellulaire de mélanome en soi n'était pas significativement affectée par le silençage PAK1 (données non présentées). Cependant, la quantification précise des niveaux de protéine PAK1 en scannant ce western blot était plutôt difficile, principalement en raison du bruit de fond élevé autour de la bande PAK1 dans l'effort de visualiser ses niveaux d'expression extrêmement faibles. Au lieu de cela, en utilisant le test de kinase "Macaroni-Western" (5,10), nous avons vérifié que l'activité kinase de PAK1 dans les clones SH1 et 2 n'est que d'environ 25-30 % de celle des cellules témoins (WT) ( voir Figure 2A).

3.2.2. Réduction de la mélanogénèse par silençage du gène PAK1

Notre prochaine question critique était de savoir si une telle réduction de l'activité kinase de PAK1 affectemélanogénèse. Ainsi, la teneur en mélanine de ces clones (SH1 et 2) a été comparée aux cellules de mélanome de type sauvage (WT), après traitement de toutes ces cellules avec -MSH, un inducteur mélanogène, pendant 72h. Comme le montre la figure 2B, la teneur en mélanine de ces mélanocytes déficients en PAK 1- (SH1 et 2) est réduite d'environ 50 % (51-55 %), atteignant le niveau de base dans le WT sans hormone mélanogène. Pour voir si cette réduction de la teneur en mélanine est associée à la suppression de l'activité de la tyrosinase, nous avons mesuré latyrosinaseactivité dans les cellules déficientes en PAK1-(clones SH1 et 2), par rapport au WT. Comme le montre la figure 2C, l'activité de la tyrosinase dans les cellules déficientes en PAK 1- n'est que d'environ 45 % (33-58 %) de celle du WT, atteignant à nouveau le niveau basal (non stimulé), indiquant clairement que PAK1 est essentiel pour la production de mélanine induite par -MSH entyrosinasedans les mélanocytes. En outre, d'une manière très similaire, la mélanogenèse induite par IBMX a également été réduite en faisant taire le gène PAK1 dans cette lignée cellulaire de mélanome (données non présentées). Toutefois, compte tenu des deux facteurs suivants, il est très probable que seulement la moitié desmélanogénèsedans les mélanocytes est dépendant de PAK1-, et le reste (en grande partie "basique") est dépendant de PAK4- : (i) PAK4 est également essentiel pour la mélanogenèse induite par -MSH dans les mélanocytes (8), et (ii) environ 25 % du gène PAK1 semble être encore exprimé dans ces transfectants (SH1 et 2). Cependant, il reste à clarifier vigoureusement si PAK1 est responsable de l'induction hormonale ou basale.mélanogénèse.

De plus, nous avons confirmé que la PAK1 endogène est activée de manière significative par des inducteurs mélanogènes tels que IBMX et -MSH dans cette lignée cellulaire de mélanome (voir Figure 1), mais sans aucun changement significatif dans son autophosphorylation à Thr 423, à en juger par l'anti-pAK1 anticorps (données non présentées).

3.3. Augmentation de la mélanogénèse induite par -MSH par PAK1 surexprimée

Par surexpression du gène PAK1 de type sauvage (WT) dans les mélanocytes (lignée cellulaire B16F10) par transfection, nous avons révélé que le gène PAK1 ajouté de manière exogène augmente de plusieurs fois le niveau de mélanine inductible par la MSH (voir la gauche de la figure 3, comparer voies 2 et 4), alors qu'il n'affecte guère le niveau de mélanine "basal" indépendant en soi (comparer les voies 1 et 3 dans le panneau de gauche de la figure 3), ce qui suggère que PAK1 contribue principalement à -MSH/IBMX-dépendantmélanogénèse, et non la mélanogénèse basale sans stimulateur(s) exogène(s).

3.4. Effet du sérum sur la mélanogénèse induite par -MSH/IBMX

Plus intéressant, nous avons constaté que l'induction de la mélanogénèse par -MSH/IBMX nécessite 10 % de FBS (sérum bovin fœtal) en plus de PAK1. Comme le montre la figure 4A, dans un milieu sans sérum, soit -MSH ou IBMX à peine induit lamélanogénèsedans les cellules WT, bien que le FBS à 10 % seul (sans -MSH/IBMX) ait induit lamélanogénèsesignificativement (d'environ 60 %). Fait intéressant, la mélanogenèse dans les transfectants SH (cellules déficientes en PAK 1-) en présence ou en l'absence de sérum était au même niveau que celle des cellules WT en l'absence de sérum (voir figure 4B), ce qui suggère que la mélanogenèse dépendante du sérum nécessite également PAK1. À l'appui de cette notion, le sérum seul active de manière significative l'activité kinase de PAK1 dans les cellules WT, mais l'activation dépendante de la MSH de PAK1 dans les cellules WT nécessite du sérum (voir la figure 4C).

En ce qui concerne la nature chimique du facteur sérique mélanogénique qui seul active PAK1, nous supposons qu'il s'agit du PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) pour les raisons suivantes : (i) il y a plus d'une décennie, nous avons montré que le PDGF est le seul facteur de croissance dans sérum qui active PAK1 par la transactivation du récepteur EGF (facteur de croissance épidermique) par le récepteur PDGF (13,14), et très récemment d'autres ont prouvé que soit PDGF soit EGF seul stimule effectivement lemélanogénèsede mélanocytes (15,16).

3.5. La mélanogénèse dépendante du sérum/PDGF nécessite un récepteur EGF

Pour tenter d'identifier la nature chimique spécifique de ce facteur sérique mélanogénique, nous avons testé l'effet de l'AG1295 (inhibiteur spécifique du récepteur PDGF) ou de l'AG1478 (inhibiteur spécifique du récepteur EGF) sur le sérum dépendantmélanogénèsedans les mélanocytes. Comme le montre la figure 5, AG1295 2 µM ou AG1478 400 nM a fortement réduit la dépendance sériquemélanogénèseau niveau équivalent à la mélanogénèse de base (sans sérum). Étant donné que le PDGF est abondamment présent dans le sérum, mais pas l'EGF et que l'AG1295 n'inhibe pas le récepteur de l'EGF, tandis que l'AG1478 n'inhibe pas le récepteur du PDGF (13), il est très probable que le PDGF dans le sérum active son récepteur qui à son tour trans-active le récepteur de l'EGF qui active finalement PAK1 qui est essentiel pour la mélanogénèse dépendante du sérum (pour plus de détails, voir la figure 6). Sur la base de cette hypothèse, nous discuterons plus tard du mécanisme le plus probable sous-jacent à la synergie apparente entre -MSH et sérum/PDGF pour l'activation de PAK1, conduisant à une mélanogénèse robuste.

Enfin, il convient de souligner que la teneur en mélanine "basale" sans -MSH n'a pas été modifiée de manière significative par le mutant CA (constitutivement actif) surexprimé de PAK1 portant la mutation T423E (voir le panneau de gauche de la figure 3, voie 5) comme s'il s'agissait d'un DN (dominant négatif) ou d'un mutant inactif. En fait, -MSH n'induit pas du tout la phosphorylation de WT PAK1 à Thr 423 (données non présentées). Ainsi, on pourrait conclure que l'auto-phosphorylation de PAK1 à Thr 423 n'a rien à voir avec l'activation induite par -MSH de PAK1, ce qui conduit à la robustessemélanogénèsedans les cellules de mélanome. Étant donné que le mutant T423E de PAK1 est bien connu pour être hautement oncogène (6), peut-être que l'auto-phosphorylation au niveau de Thr 423 pourrait servir à passer de la signalisation "mélanogène" à la signalisation "oncogène".

4. Discussion

De notre observation sur la mélanogénèse dépendante de PAK1-et dépendante de PAK4-dans les cellules de mélanocytes/mélanomes, deux problèmes potentiellement intéressants doivent être soulignés : (i) L'activité mélanogénique "spécifique" de PAK1 ( exprimé que très finement) doit être bien supérieur à celui de PAK4 (fortement exprimé) dans les cellules de mélanome. (ii) Il semble que PAK1 soit principalement responsable de la mélanogénèse induite par le sérum, tandis que PAK4 est principalement responsable de la mélanogénèse intrinsèque (basale)mélanogénèse. En d'autres termes, bien que la déficience en PAK4- soit embryonnairement mortelle chez la souris, alors que la déficience en PAK1- seule ne parvient pas à produire des souris "albinos", la différence apparente dans la couleur de peau d'origine (basemélanogénèse) entre les Noirs et les Blancs, par exemple, pourrait être au moins en partie le reflet de la différence de niveau d'expression de PAK4, ainsi que de la différence de niveau de mélanogénèsetyrosinases.

In vivo, en utilisant des souris HRM-2 (pigmentées mais glabres), nous avons récemment montré qu'une crème contenant 10 μM de PF3758309 (inhibiteur de PAK1/PAK4-) réduit la mélanogénèse induite par les UV dans leur peau à la niveau basal, bien qu'il reste encore à clarifier si PAK4 ou PAK1 est responsable de l'induction UV de la mélanogénèse (8). Étant donné que PAK1 est responsable de la mélanogénèse inductible, mais pas de la mélanogénèse basale, il serait intéressant de tester si PAK1 contribue de manière significative à la mélanogénèse inductible par les UV.mélanogénèse(bronzage) également, en utilisant le rare mutant PAK1 KO (knock out) dérivé de la souche C57B16 de souris portant des cheveux et des yeux foncés (Hong He et al., observation non publiée), dans une tentative de comprendre si une variété de PAK1 à base de plantes les bloqueurs dans les cosmétiques sont utiles ou non comme écrans solaires. Fait intéressant, il a été rapporté que PAK1 était activé par une irradiation UV et d'autres agents endommageant l'ADN (17).

Il a été montré que -MSH active la Tyr kinase JAK2 (18), qui à son tour active PAK1 par la phosphorylation au niveau de Tyr 285 (au lieu de Thr 423), conduisant à l'interaction PIX-PAK1 (19). Cela pourrait expliquer pourquoi ni l'activation de PAK1 dépendante de -MSH ni la mélanogénèse n'impliquent l'autophosphorylation de PAK1 à Thr 423. Ainsi, nous avons récemment étudié si la mélanogénèse dépendante de PAK1-est bloquée par un puissant JAK à base de plantes2- inhibiteur appelé cucurbitacine I (CBI) du melon amer (Goya) qui inhibe directement JAK2 (20), et a constaté que le CBI inhibe lamélanogénèseen présence d'hormones mélanogènes de plus de 70 %, ce qui suggère la possibilité que le CBI bloque non seulement PAK1 mais également PAK4 (5). Dans ce contexte, il serait très intéressant de noter que les bloqueurs de PAK 1- à base de plantes tels que le CAPE, la curcumine, la shikonine et le FTY 720 pourraient inhiber la mélanogénèse induite par la MSH dans les cellules cutanées de souris ou humaines seulement d'environ 50 % même à leurs concentrations où PAK1 est presque complètement bloqué (1,2), alors que le pan-PAK-bloquant synthétique PF3758309, inhibant à la fois PAK1 et PAK4, abolit lemélanogénèsedans les cellules de la peau d'environ 90 % à 300 nM (8). En d'autres termes, le système mélanogénique induit par -MSH dans les mélanocytes pourrait distinguer les bloqueurs spécifiques de PAK 1- des bloqueurs pan-PAK. Jusqu'à présent, aucun bloqueur spécifique de PAK 4- à base de plantes (autre que les siARN spécifiques de PAK 4-) ​​n'a été identifié. Cependant, il a récemment été démontré qu'un quassinoïde très puissant appelé glaucarubinone dérivé d'un arbre amer cultivé dans les jungles amazoniennes bloque à la fois PAK1 et PAK4, inhibant la croissance des cellules cancéreuses pancréatiques à la fois in vitro et in vivo (21). Ainsi, il serait très intéressant de tester si ce bloqueur de PAK à base de plantes supprime presque complètement la mélanogénèse des cellules de la peau, comme le fait le PF3758309.

L'objectif principal de cette étude était de se concentrer sur le rôle mélanogénique spécifique de PAK1, et non d'étudier en détail comment PAK1 active la voie de signalisation mélanogénique, y compris les enzymes mélanogènes et les MTF. Cependant, il est très probable que PAK1 active directement la bêta-caténine en phosphorylant au Ser 675, conduisant à l'activation de MITF qui est essentiel pour l'expression de gènes codant pour des enzymes mélanogènes telles quetyrosinase(Tyr).

Récemment, nous avons découvert que PAK4 (CDC42-kinase dépendante 4) est également impliquée dansmélanogénèsede la même lignée cellulaire de mélanome en activant deux facteurs de transcription, CREB et la bêta-caténine, tous deux essentiels à l'activation de MIFT (8). Étant donné que CREB est connu pour être activé par la LIM kinase (22,23) qui, comme la bêta-caténine, fait partie des substrats directs communs de PAK1 et PAK4 (6,18), il est très probable que PAK1 et PAK4 partagent le même CREB /voies de signalisation bêta-caténine-MITF pour activer les gènes des enzymes mélanogènes.

Cependant, les voies de signalisation détaillées conduisant à l'activation de PAK1 dépendante de -MSH/IBMX pourraient différer significativement de celles conduisant à l'activation de PAK4, principalement parce que la première implique le facteur sérique (PDGF). Le sérum seul est capable d'activer PAK1 (13) et stimule également l'activation dépendante de -MSH/IBMX de PAK1. En d'autres termes, il existe une nette synergie entre le sérum et ces hormones mélanogènes à la fois dans l'activation de PAK1 etmélanogénèse.

Voici notre hypothèse de travail sur la façon dont cette synergie pourrait avoir lieu. La principale voie de signalisation menant à l'activation de PAK1 est la cascade oncogénique EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique)-RAS-PI 3 kinase-RAC/CDC42-PAK1. Cependant, cette cascade seule n'est pas suffisante pour l'activation complète. Il a besoin d'un autre facteur appelé PIX, une protéine adaptatrice SH3 qui se lie directement à PAK1 via son motif riche en Pro de 18 acides aminés appelé PAK18. L'interaction PIX-PAK1 nécessite une troisième protéine appelée JAK2, une Tyr-kinase, qui phosphoryle PAK1 à Tyr 285. RAS régule à la hausse JAK2 via la prolactine. Selon quelques découvertes antérieures de notre part et d'autres (13-16), le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) est le ou les principaux facteurs sériques mélanogènes essentiels pour le -MSH/IBMX induitmélanogénèse, car il active son récepteur (PDGFR) Tyr-kinase qui à son tour trans-active l'EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique=ErbB1) Tyr-kinase, conduisant à l'activation de PAK1 via l'oncogène RAS-PI3 kinase-RAC /voie CDC42 (13). Ainsi, le PDGF dans le sérum seul peut activer PAK1 et induire la mélanogénèse jusqu'à mi-chemin. Cependant, pour l'activation complète de la mélanogénèse dépendante de PAK1-, -MSH/IBMX est nécessaire pour activer le JAK2 via une voie dépendante de l'AMPc (qui pourrait impliquer la PKA) qui sécurise finalement l'interaction PIX-PAK1 (pour plus de détails, voir Figure 6).

En conclusion, nous présentons ici la toute première preuve biochimique qui pourrait expliquer comment une variété de bloqueurs de PAK 1-à base de plantes tels que le CAPE, la curcumine et la shikonine dans les crèmes cosmétiques pourraient contribuer au "blanchiment de la peau" effets. Une série d'études analogues avec des mélanocytes humains sont attendus pour plus de preuves ou de confirmation.

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