La Tyrosine Kinase C-Abl potentialise l'immunité antivirale médiée par l'interféron par la phosphorylation STAT1

RÉSUMÉ

L’activation induite par l’interféron (IFN) du transducteur de signal et activateur de la famille de transcription (STAT) est un événement important dans l’immunité antivirale. Nous montrons ici que les kinases non réceptrices c-Abl et Arg interagissent directement avec STAT1 et potentialisent la phosphorylation de STAT1 sur Y701. c-Abl / Arg pourrait médier la phosphorylation de STAT1 indépendamment des Janus kinases en l'absence d'IFNg et potentialiser la phosphorylation de STAT1 médiée par l'IFNg. De plus, la dimérisation de STAT1, la translocation nucléaire et la transcription génique en aval sont régulées par c-Abl/Arg. Le déficit en c-Abl/Arg (abl1/abl2) supprime de manière significative les réponses antivirales dans les cellules infectées par le virus de la stomatite vésiculaire. Par rapport au véhicule, l’administration de l’inhibiteur sélectif c-Abl/Arg AMN107 a entraîné une mortalité significativement accrue chez les souris infectées par le virus de la grippe humaine. Notre étude démontre que c-Abl joue un rôle essentiel dans la voie de signalisation de l'activation STAT1 et constitue une approche importante dans la régulation de l'immunité antivirale.

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INTRODUCTION

Les interférons (IFN) jouent un rôle clé dans l'immunité innée contre les infections virales et la surveillance immunitaire en régulant l'activation des Janus kinases (JAK) et du transducteur de signal et activateur de transcription (STAT) et en reprogrammant l'expression des gènes cellulaires (Stark et Darnell, 2012). La liaison des IFN à leurs récepteurs respectifs entraîne la phosphorylation croisée de trois JAK associés (JAK1, JAK2 et TYK2) et le recrutement de STAT, permettant aux résidus tyrosine uniques proches des extrémités C-terminales de ces STAT d'être phosphorylés par les JAK. (Platanias, 2005). Les STAT activés se dimérisent ensuite, migrent vers le noyau et se lient aux promoteurs des gènes sensibles à l'IFN pour induire leur transcription. La phosphorylation de la tyrosine des STAT est une étape essentielle de la voie JAK-STAT de signalisation de l'IFN et est impliquée dans la dimérisation de STAT, la translocation nucléaire et la liaison de l'ADN (Stark et Darnell, 2012). Ainsi, la phosphorylation de la tyrosine fonctionne comme un commutateur d'activation STAT. Les preuves obtenues grâce à une perturbation ciblée des gènes JAK chez la souris suggèrent que les JAK sont les tyrosine kinases STAT les plus importantes (Villarino et al., 2017). Cependant, il a également été démontré que les résidus de tyrosine dans STAT1, STAT3 et STAT5 sont phosphorylés dans les cellules déficientes en JAK par les récepteurs du facteur de croissance épidermique et du facteur de croissance dérivé des plaquettes avec une activité intrinsèque de tyrosine kinase (Leaman et al., 1996 ; Vignais et al. ., 1996). De plus, une activation constitutive des STAT a été observée dans des cellules transformées exprimant des tyrosine kinases oncogènes telles que v-Src, v-Abl et BCR-Abl, mais il reste à déterminer si les STAT sont les substrats directs de ces kinases (Danial et Rothman). , 2000 ; Reddy et coll., 2000). La kinase Abelson c-Abl de mammifère codée par le gène c-abl (abl1) et la protéine du gène apparenté à Abl Arg codée par le gène arg (abl2) sont membres d'une famille de tyrosine kinases intracellulaires non réceptrices qui sont nécessaires à de multiples processus cellulaires, y compris la prolifération, l'apoptose, l'adhésion, la migration cellulaire et les réponses au stress (Bradley et Koleske, 2009 ; Colicelli, 2010 ; Greuber et al., 2013 ; Pendergast, 2002). L'activité kinase de c-Abl est étroitement régulée dans des conditions physiologiques normales. Les événements de transduction rétrovirale et de translocation chromosomique donnent respectivement lieu à l'expression de v-Abl ou de BCR-Abl, une forme oncogène d'Abl (Advani et Pendergast, 2002). De plus, la suppression ciblée du gène c-abl chez la souris entraîne des phénotypes pléiotropes associés à un dysfonctionnement immunitaire, notamment une létalité périnatale élevée, une atrophie splénique et thymique, une lymphopénie et une susceptibilité accrue aux infections (Schwartzberg et al., 1991). De plus, le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) BCR-Abl positive avec les inhibiteurs d'Abl STI571 (imatinib) et AMN107 (nilotinib) est associé à une immunosuppression chez un sous-ensemble de patients (Dietz et al., 2004 ; Hochhaus et al., 2016 ; Mattiuzzi et al., 2003). Des études antérieures ont démontré que cAbl joue un rôle dans la régulation de la transduction, du développement, de la prolifération et de la production de signaux médiés par le TCR (récepteur des lymphocytes T) et le BCR (récepteur des lymphocytes B) (Gu et al., 2009 ; Pendergast, 2002). ; Silberman et coll., 2008). Les souris déficientes en Abl présentent également un nombre réduit de cellules T/B (Gu et al., 2009 ; Liberatore et Goff, 2009 ; Schwartzberg et al., 1991). Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’immunité altérée qui surviennent en l’absence ou l’inhibition de c-Abl restent insaisissables. Il a été largement rapporté que la voie de signalisation JAK-STAT est essentielle à la transformation induite par BCR-Abl (Carlesso et al., 1996 ; Danial et al., 1998 ; de Groot et al., 1999). Par conséquent, il convient de rechercher si JAK-STAT peut également contribuer à l’immunité innée impliquée par c-Abl. Nous rapportons ici que STAT1 interagit avec et est phosphorylé par c-Abl de manière indépendante de JAK, par laquelle la dimérisation, la localisation nucléaire et la transcription génique en aval de STAT1 sont régulées. Ces résultats ont révélé que, outre la JAK kinase, c-Abl est indispensable à l’activation complète de STAT1 et aux réponses antivirales ultérieures médiées par l’IFN.

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RÉSULTATS

La transcription des gènes en aval de la séquence activée par l'interféron gamma est régulée par la kinase Abl

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 ont été identifiés dans les MEF c-abl/arg double-knockout (DKO) et WT, dont 960 étaient régulés positivement et 784 étaient régulés négativement (Figure 1A, à gauche). Pour étudier plus en détail les fonctions cellulaires potentielles et les voies associées de ces DEG, nous avons effectué une analyse Gene Ontology (GO) (pour les termes du processus biologique, de la fonction moléculaire et du composant cellulaire) (Figure S1A). Les gènes régulés négativement par c-Abl et Arg étaient principalement associés aux réponses de défense du virus (GO : 0009615, GO : 0051607 et GO : 0045071) et aux réponses immunitaires (GO : 0002376, GO : 0045087). Une analyse plus approfondie a montré que les gènes spécifiques de l'IFN (Liu et al., 2012) étaient enrichis parmi les gènes régulés négativement (Figures 1A, à droite et S1B). Pour valider les profils d'expression différentiels, les niveaux de transcription des gènes antiviraux, notamment cxcl10, psmb9, tap1 et isg15, ont été déterminés par des tests quantitatifs de transcription inverse en temps réel (RT-PCR) et normalisés aux niveaux de psma5. , qui n'est pas très réglementé par c-Abl. Par rapport aux MEF WT, les c-abl/arg/MEF présentaient des niveaux de transcription significativement inférieurs de ces gènes, mais les réductions induites par DKO ont été complètement inversées par le sauvetage de c-Abl de manière dose-dépendante (Figures 1B et S1C). Ces données suggèrent qu'un panel de gènes induits par l'IFN était régulé par c-Abl et Arg. Pour étudier les éléments transcriptionnels clés régulés par les kinases Abl en réponse à l'IFN, un système rapporteur de luciférase a été construit sur la base du promoteur bidirectionnel partagé tap1/psmb9 régulé par l'IFNg (Figure 1C). Comme prévu, l'inhibiteur sélectif c-Abl/Arg AMN107 a inhibé de manière significative l'activité transcriptionnelle du promoteur tap1 (rouge) (Figure 1D). Notamment, contrairement à la suppression des éléments de séquence consensus agissant sur NFkB (bleu) ou IFN (jaune), le traitement par AMN107 a eu peu ou pas d'effet sur l'activité du promoteur tap1 lorsque l'élément de séquence activée par gamma (GAS) (vert) a été supprimé (Figure 1D). ). Ces résultats indiquent que l'élément cis GAS ciblé par STAT1- est impliqué dans la transcription tap1 régulée par c-Abl, ce qui suggère fortement que STAT1 est responsable de la régulation médiée par c-Abl de l'expression des gènes sensibles à l'IFN.

c-Abl interagit directement avec STAT1

L'expression de TAP1 induite par l'IFN est régulée par c-Abl, éventuellement via STAT1, ce qui suggère que STAT1 pourrait être associé à c-Abl. Pour confirmer cette hypothèse, des lysats de cellules MCF-7 ont été soumis à une immunoprécipitation anti-c-Abl suivie d'un immunoblot avec un anticorps anti-STAT1. STAT1 était présent dans les immunoprécipités anti-c-Abl mais pas dans les IgG (Figure 2A). Ensuite, les cellules 293T ont été cotransfectées avec Myc-cAbl et Flag-STAT1 ou Flag-Vector comme contrôle. La présence de Myc-c-Abl dans les immunoprécipités anti-Flag préparés à partir de cellules coexprimant Flag-STAT1 mais pas Flag-Vector a montré une association entre Myc-c-Abl exprimé de manière ectopique et Flag-STAT1 (Figure 2B, à gauche). Un résultat similaire a également été obtenu dans une expérience réciproque (Figure 2B, à droite). De plus, l'autre membre de la famille Abl, Arg (Abl2), qui est hautement homologue de c-Abl dans son domaine N-terminal (NTD), a également interagi avec STAT1 (Figure S2A).

Figure 1. c-Abl régule les promoteurs des gènes sensibles à l'IFN via les éléments GAS

Ensuite, les lysats préparés à partir de cellules 293T exprimant Flag-c-Abl ont été incubés avec GST-STAT1 ou GST conjugué à l'agarose seul, et Flag-c-Abl a été détecté dans le GST-STAT1 mais pas dans les adsorbats de GST (Figure 2C). Pour exclure toute liaison indirecte médiée par d'autres composants dans les lysats cellulaires, des immunoprécipités anti-Flag préparés à partir de cellules 293T exprimant Flag-c-Abl ont été soumis à une SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium – polyacrylamide) et les protéines ont été transférées à une membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène) puis épongé avec du GST-STAT1 ou du GST soluble (comme contrôle). Les résultats ont montré que GST-STAT1, mais pas GST, se liait directement à c-Abl in vitro (Figure 2D). Pour définir le domaine de liaison à c-Abl, STAT1 complet ou tronqué conjugué à l'agarose et fusionné à la GST (Figure 2E, panneau supérieur) a été incubé avec les lysats de cellules 293T exprimant Flag-c-Abl. L'analyse des adsorbats par immunoblot avec un anticorps anti-Flag a démontré que les acides aminés 577 à 750 de STAT1, qui composent une région contenant le domaine SH2 et le domaine de transactivation, étaient responsables de l'interaction c-Abl (Figure 2E, panneau inférieur) . De même, Flag-STAT1 immunoprécipité par l'anticorps anti-Flag a été fractionné par SDS-PAGE et transféré sur une membrane PVDF. Ensuite, la membrane a été transférée avec un GST-c-Abl SH3 ou un GST-c-Abl SH2 et GST solubles uniquement. Le résultat a montré que le domaine c-Abl SH3 était le principal domaine responsable de l'association STAT1 (Figure 2F). De plus, l'interaction in situ de c-Abl endogène avec STAT1 a été évaluée par le test de ligature de proximité Duolink (PLA). Les complexes STAT1: c-Abl ont été observés principalement dans le cytoplasme et la formation de ces complexes a été considérablement potentialisée par la stimulation par l'IFNg (Figure 2G). Collectivement, ces résultats démontrent une association directe entre c-Abl et STAT1 in vitro et in vivo.

Figure 2. c-Abl interagit avec STAT1

c-Abl intervient dans la phosphorylation de STAT1 indépendante de JAK

Pour déterminer si STAT1 est un substrat de c-Abl, STAT1 purifié marqué par His a été incubé avec du c-Abl recombinant (contenant le domaine catalytique au niveau des acides aminés 237 à 643) en présence d'ATP pour un test de kinase in vitro. L'immunotransfert du produit de réaction avec l'anti-phospho-tyrosine et l'anti-phospho-STAT1 Y701 a démontré que STAT1 était directement phosphorylé par c-Abl au niveau des résidus de tyrosine, y compris Y701, in vitro (Figure 3A). Ensuite, nous avons constaté que Flag-STAT1 exprimé dans les cellules 293T était phosphorylé par la tyrosine, en particulier sur le résidu Y701, par Myc-c-Abl, mais pas par le mutant Myc-c-Abl (K290R) inactif en kinase. De plus, lors du traitement avec l'inhibiteur sélectif de c-Abl/Arg AMN107, la phosphorylation de STAT1 médiée par c-Abl a été presque éliminée, ce qui indique que la phosphorylation de la tyrosine de STAT1 dépend de l'activité de la c-Abl kinase (Figure 3B). La phosphorylation de STAT1 médiée par c-Abl était considérablement altérée lorsque STAT1 Y701 était remplacé par de la phénylalanine, indiquant que Y701 est le principal phosphosite d'Abl (Figure 3C). De plus, STAT1 a également été phosphorylé par Arg (Figure S2B). Pour mieux délimiter les résidus STAT1 spécifiques phosphorylés par c-Abl, Flag-STAT1 coexprimé avec Myc-c-Abl a été soumis à une chromatographie liquide couplée à une analyse par spectrométrie de masse en tandem. Outre le phosphosite STAT1 Y701, bien défini et fonctionnellement important (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993), deux autres phosphosites, Y106 et Y665, ont également été identifiés (Figure S4A). Par rapport à WT STAT1, les mutants Y106F et Y701F présentaient une phosphorylation de la tyrosine compromise (Figure 3C). Cependant, la phosphorylation de STAT1 Y701 n'a pas été considérablement affectée par la phosphorylation de Y106 et Y665, ce qui indique que Y106 et Y665 peuvent jouer des rôles distincts (Figure S4B). Ensemble, ces résultats indiquent que les résidus tyrosine de STAT1, y compris le résidu Y701 précédemment signalé, peuvent être phosphorylés par les kinases de la famille Abl.

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Les JAK sont principalement responsables de la phosphorylation de STAT1 Y701 induite par l'IFN (Villarino et al., 2017). Comme prévu, la phosphorylation de STAT1 Y701 a été induite par l'IFNg et a été significativement inhibée par le ruxolitinib, un inhibiteur bispécifique de JAK1 et JAK2 (Figure 3D). Notamment, une phosphorylation compromise de Y701 a également été observée lors de l'inhibition d'Abl (Figure 3D, piste 4), indiquant que c-Abl contribue partiellement à l'activation de STAT1 induite par l'IFNg. De plus, la phosphorylation de STAT1 Y701 a également été induite par le DPH, un activateur de c-Abl perméable aux cellules, dans une moindre mesure que par l'IFNg, qui pourrait être complètement inversée par l'AMN107 (Figure 3E). Pour confirmer l'activation d'Abl induite par DPH, la phosphorylation de c-Abl Y412, un indicateur de l'activation d'Abl, a également été détectée (Figure 3E). Il a été démontré que l'activation de JAK2 se produit en premier et qu'elle est nécessaire pour l'activation ultérieure de JAK1 (Briscoe et al., 1996). Pour exclure l'effet de JAK2 sur l'activation de STAT1, nous avons établi une lignée cellulaire jak2-KO MCF-7 via CRISPR. Une phosphorylation diminuée mais détectable de STAT1 Y701 a été observée dans les cellules jak2-KO MCF-7 par rapport à celle des cellules parentales MCF-7, qui pourrait être potentialisée de la même manière en présence de Myc-c-Abl. mais pas Myc-c-Abl (K290R) (Figure 3F) et a encore diminué après le traitement par AMN107. Dans c-abl/arg/cellules, la phosphorylation de STAT1 induite par l'IFNg au niveau de Y701 a été fortement compromise de manière dépendante du temps et de la dose (Figure 3G). Toutes ces observations démontrent que la kinase c-Abl pourrait directement phosphoryler et activer STAT1 indépendamment de la voie de signalisation IFNg-JAK et que, plus important encore, ces deux kinases pourraient avoir des effets synergiques sur la phosphorylation de STAT1 en Y701.

Figure 3. STAT1 est phosphorylé par c-Abl

Figure 4. c-Abl favorise la formation de dimères STAT1 et l'importation nucléaire

La phosphorylation médiée par c-Abl régule l'activité de transactivation de STAT1

La phosphorylation de la tyrosine des STAT est une étape essentielle dans la voie JAK-STAT de signalisation de l'IFN et est impliquée dans la dimérisation des STAT, la translocation nucléaire et la liaison de l'ADN. Pour déterminer si la phosphorylation médiée par c-Abl régule la dimérisation de STAT, GFP-STAT1 et Flag-STAT1 ont été coexprimés dans des cellules 293T en présence ou en absence de Myc-c-Abl. Les niveaux de GFP-STAT1 dans les immunoprécipités anti-Flag ont été examinés pour indiquer la dimérisation de STAT1. Comme le montre la figure 4A, la coexpression de c-Abl a potentialisé la formation d'homodimères STAT1-STAT1. La microscopie par immunofluorescence des cellules MCF-7 a en outre démontré que l'ablation de c-abl/arg ou le traitement par AMN107 altère de manière significative la translocation nucléaire STAT1 induite par l'IFNg (figures 4B et 4C).

De plus, des tests de décalage d'électromobilité ont été utilisés pour analyser l'activité de liaison au promoteur de STAT1. Une région promotrice IRF1 marquée à la biotine contenant la séquence consensus de liaison STAT1 a été utilisée comme sonde de détection (Aaronson et Horvath, 2002). Cette sonde a été incubée avec des extraits nucléaires de cellules 293T exprimant de manière exogène STAT1 avec ou sans c-Abl, qui ont été équilibrés sur la base de la figure S5A. Comme le montre la figure 4D, de nombreux complexes liés à la sonde IRF1 contenant STAT1 ont été observés dans des extraits nucléaires (figure 4D, piste 1). La formation de complexes a légèrement augmenté avec le traitement par IFNg (Figure 4D, piste 2) et a augmenté de manière significative dans les cellules exprimant de manière ectopique c-Abl (Figure 4D, piste 3). Cependant, par rapport à WT STAT1, c-Abl a montré peu ou pas d'effet sur la liaison du promoteur de STAT1 hébergeant Y701F (Figure 4D, pistes 7 et 8), tandis que les mutations Y106F et Y665F n'ont montré pratiquement aucune différence avec WT STAT1. La spécificité des complexes contenant STAT1 et la sonde de détection a été confirmée lors de l'ajout d'une sonde concurrente non marquée (Figure 4D, piste 9). De plus, l'ajout d'un anticorps anti-STAT1 a entraîné la formation d'une bande super-décalée (Figure 4D, piste 11). Lorsque les sondes marquées ont été incubées avec des extraits nucléaires de cellules 293T comme contrôle, aucun complexe n'a été observé (Figure 4D, piste 10). Ces résultats démontrent que la phosphorylation de STAT1 Y701 médiée par c-Abl potentialise la liaison de STAT1 avec ses promoteurs cibles.

Figure 5. c-Abl régule l'expression des gènes liés à l'IFN

Ensuite, la transactivation induite par l'IFNg des principaux gènes régulés par STAT1-, notamment ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 et tap1, a été évaluée dans WT ou c-abl/ arg Cellules DKO MCF-7 via RT-PCR. Comme prévu, la transcription des gènes était significativement altérée par l'épuisement de c-abl/arg (Figure 5A). De plus, les gènes généralement induits par l'IFNg et l'IFNa n'ont pas pu être stimulés par les IFN en présence d'AMN107 (figures 5B et 5C). Ces résultats démontrent que l'activité de transactivation de STAT1 est régulée positivement par c-Abl.

c-Abl favorise les effets antiviraux dépendants de l'IFN

TAP1 et PSMB9 sont impliqués dans la production et la présentation de peptides dans la voie de traitement des antigènes du CMH de classe I (Ghannam et al., 2014 ; Vitale et al., 1998). Conformément aux découvertes précédentes, la présentation de l'antigène de l'ovalbumine par les cellules JAWS II aux cellules B3Z était significativement supprimée par l'AMN107 en raison de la production réduite d'IL2 (Figure 6A). Pour évaluer plus en détail les conséquences biologiques antivirales de la régulation de STAT1 par c-Abl, WT et c-abl/arg/MEF prétraités avec ou sans IFNg dilué en série ont été infectés par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV). L'infection par le VSV a provoqué une mort cellulaire plus grave dans les cellules c-abl/arg/MEF et WT traitées avec AMN107 que dans les cellules WT MEF traitées avec des véhicules (Figure 6B). Le traitement par IFNg a considérablement réduit la mort cellulaire induite par une infection virale, mais il a eu un effet beaucoup moins prononcé en présence d'AMN107. Conformément à cette découverte, l'ablation de c-abl/arg dans les MEF a entraîné une insensibilité à la stimulation de l'IFN, mais cet effet a été notamment inversé par le sauvetage de c-Abl (Figure 6B). Ensuite, les cellules A549 traitées avec ou sans AMN107 ont été infectées par le virus de la maladie de Newcastle (NDV) exprimant la GFP, et les résultats ont révélé que la réplication virale était également potentialisée par le traitement par AMN107 mais supprimée par l'expression de c-Abl (Figure 6C). Conformément à la découverte selon laquelle la transfection d'ADN conduit à l'activation de la réponse endogène à l'IFN (Park et al., 2003), la transfection avec le vecteur pcDNA a inhibé la prolifération virale. Notamment, la transfection avec Flag-c-Abl a entraîné un effet inhibiteur plus prononcé sur la prolifération virale que la transfection avec un vecteur vide (Figure 6C). De plus, le traitement par IFNg a eu peu d’effet, voire aucun, sur l’infection virale en présence de l’inhibiteur sélectif de c-Abl, AMN107 (Figure 6D). Ces données suggèrent que c-Abl joue un rôle important dans les effets antiviraux médiés par STAT1-. Nous avons ensuite étudié les rôles de c-Abl dans l'infection virale chez des souris call/fl, Lck-Cre (c-abl-conditional knockout, c-abl-cKO), chez lesquelles c-abl a été spécifiquement inactivé dans les thymocytes (Figure S7A). ), puisque l'inactivation germinale du gène c-abl entraîne une fuite et la mort dans les deux premières semaines suivant la naissance (Koleske et al., 1998 ; Schwartzberg et al., 1991). Ensuite, les souris WT et c-abl-cKO ont été infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe A (IAV). Une mortalité statistiquement non significativement plus élevée a été observée chez les souris c-abl-cKO que chez les souris WT. Les souris WT auxquelles on a administré en continu l'AMN107, qui supprime systématiquement les kinases c-Abl/Arg dans tous les tissus, ont démontré une sensibilité significativement accrue à l'IAV (Figure 6E). Collectivement, ces résultats indiquent que c-Abl est nécessaire à l’immunité antivirale chez les animaux.

Figure 6. c-Abl favorise les effets antiviraux dépendants de l'IFN

DISCUSSION

L’IFNg est l’une des cytokines immunomodulatrices les plus importantes et joue un rôle essentiel dans l’immunité innée contre les infections virales. Dans la signalisation canonique de l'IFNg, lors de la stimulation de l'IFNg, JAK1 et JAK2 sont recrutés dans les queues cytoplasmiques des récepteurs agrégés de l'IFNg (IFNGR) et activés par des événements séquentiels d'autophosphorylation et de transphosphorylation (Stark, 2007 ; Villarino et al., 2017). Ensuite, STAT1 s'ancre à IFNGR par l'association de son domaine SH2 avec une séquence de reconnaissance dans IFNGR (Y440DKPH444), au sein de laquelle Y440 est phosphorylé par les JAK (Greenlund et al., 1995). Suite à sa phosphorylation en Y701 par les JAK, STAT1 se dimérise et se transloque dans le noyau, où il favorise la transcription d'un ensemble de gènes sensibles à l'IFNg (Aaronson et Horvath, 2002 ; Stark et Darnell, 2012). L'ablation de Stat1 chez la souris entraîne une absence de réponses transcriptionnelles à l'IFN et un manque d'activités antimicrobiennes et antivirales induites par l'IFN dans les cellules (Meraz et al., 1996). Les souris Stat1 / démontrent également une susceptibilité accrue au développement de tumeurs spontanées et induites par des produits chimiques (3-méthylcholanthrène) (Kaplan et al., 1998) et une hypersensibilité à certaines pathologies inflammatoires (Bettelli et al., 2004 ; Villarino et al. ., 2010). De plus, la signalisation STAT1 protège les cellules T de la cytotoxicité médiée par les cellules tueuses naturelles (Kang et al., 2019).Ces résultats suggèrent que STAT1 intervient dans l'activation immunitaire innée et l'immunité tumorale.

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Schlatterer et coll. rapporté que c-Abl, mais pas Arg, pourrait induire une perte neuronale en provoquant l'activation de STAT1 et la production d'interféron. Cependant, le mécanisme exact responsable de l'activation de STAT1 dépendante de c-Abl n'a pas été élucidé (Schlatterer et al., 2012). Ici, nous montrons que c-Abl se lie et phosphoryle STAT1 et interagit avec STAT2 directement in vitro (Figures 2 et 3, S8A, S9A et S10A). STAT1 Y701 est exclusivement phosphorylé par les kinases JAK, qui régulent la formation de dimères STAT1 (Schindler et al., 1992 ; Shuai et al., 1993) et la navette nucléocytoplasmique pendant la signalisation de l'IFNg (Mao et al., 2005 ; Mertens et al., 2006 ; Zhong et al., 2005). Notre étude a révélé de manière inattendue que c-Abl, une autre kinase autre que les JAK, contribue également indépendamment à la phosphorylation de STAT1 Y701 (Figure 3). Bien que la phosphorylation de Y701 médiée par c-Abl ne soit pas aussi puissante que celle des JAK, il semble nécessaire que Y701 atteigne une phosphorylation maximale, car une phosphorylation sérieusement altérée de Y701 a été observée dans les cellules c-abl / arg/ lors d'un stimulus IFNg, et l'IFNg- La phosphorylation induite de STAT1 Y701 a été inhibée par l'AMN107, de 1,25 mM à 5 mM, de manière dose-dépendante (figures 3G et S11A). Cependant, la phosphorylation de Y701 n'est pas beaucoup affectée par l'état de phosphorylation de Y106 et Y665, les deux autres phosphosites de c-Abl, ce qui indique que la phosphorylation potentialisée de STAT1 par Y701 ne résulte pas d'une phosphorylation multisite médiée par c-Abl de STAT1 mais est peut-être attribué à une activité JAK accrue. Des études antérieures ont montré qu'une activation constitutive de JAK1 et une activation variable de JAK2 avaient été observées dans des cellules exprimant BCR-Abl (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). De plus, il a été démontré que BCR-Abl active modestement STAT1 et STAT2 via la phosphorylation de la tyrosine de JAK1, JAK2 et JAK3 (Henderson et al., 1997). Les preuves actuelles soutiennent que Abl et JAK peuvent avoir des effets synergiques prononcés sur la phosphorylation de STAT1 à Y701 (Figure 3E).

En plus de Y701, la phosphorylation de Y106 et Y665 a été identifiée simultanément (figures 3C et S4A). Ces phosphosites n'étaient pas impliqués dans la phosphorylation de STAT1 Y701 ou dans l'homodimérisation de STAT1 (figures S4B et S4C). Cependant, Murphy et ses collègues ont découvert que l'interaction entre les NTD (domaine d'interaction protéique N-terminal, acides aminés 1 à 136) des monomères est nécessaire pour la dimérisation des molécules STAT complètes non phosphorylées (Ota et al., 2004). Les mutants STAT1 (F77A et/ou L78A) ne parviennent pas à former des dimères non phosphorylés, et ces mutants présentent une phosphorylation persistante du phénotype dans les cellules traitées à l'IFN et une résistance à la déphosphorylation médiée par TC45-in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 dans le NTD, proche de F77 et L78, peut être responsable du maintien de STAT1 dans un état dimère phosphorylé et du maintien de STAT1 dans le noyau sous rayonnement ionisant (figures S6A et S6B). De plus, le domaine SH2 interagit avec le domaine contenant de la tyrosine phosphorylée lorsque la formation d'homodimères phosphorylés est induite par l'IFN (Shuai et al., 1994). Y665, qui appartient au domaine SH2, peut affecter la dimérisation. Les fonctions des sites de phosphorylation médiés par c-Abl (Y106 et Y665) nécessitent des recherches plus approfondies.

Semblable aux JAK, la phosphorylation médiée par c-Abl régule la formation de dimères STAT1 (y compris la formation d'homodimères STAT1- STAT1 et d'hétérodimères STAT1-STAT2 (Figures 4A, S12A et S12B)), la translocation nucléaire et la liaison à l'ADN. , et transcription de gènes stimulés par l'IFN. La perturbation de l'Abl a contribué à une prolifération virale potentialisée et à une mort cellulaire accrue induite par le virus (Figures 6B, 6C et 6D). De plus, nous avons constaté que les rayonnements ionisants (IR) induisaient une translocation nucléaire de STAT1 en l'absence de l'inhibiteur de c-Abl (figures S6A et S6B). L'IR active directement c-Abl (Pendergast, 2002), puis la signalisation IFNg dépendante de STAT1-, ce qui peut fournir un mécanisme sous-jacent par lequel la radiothérapie déclenche une attaque immunitaire innée et adaptative en cascade d'IFN sur la tumeur (Burnette et al. ., 2011) et offre un statut immunitaire inné plus fort en réponse aux stimuli IR. Par rapport aux compagnons de portée WT, les souris chez lesquelles c-abl a été inhibé de manière conditionnelle dans les thymocytes ont présenté une mortalité plus élevée mais non statistiquement significative. Notamment, les souris auxquelles on a administré systématiquement l'inhibiteur de c-Abl/Arg AMN107 avaient une mortalité plus élevée (Figure 6E), ce qui indique que l'expression de c-Abl dans divers tissus a contribué à l'immunité antivirale chez les animaux. À partir de ces données, nous suggérons que l’Abl endogène offre une résistance basale latente à l’infection virale et que l’Abl activée stimulée par les cellules de protection contre les rayonnements ionisants. Les kinases Abl sont activées de manière constitutive chez la plupart des patients atteints de LMC. Les inhibiteurs de la kinase Abl, STI571 et AMN107, représentent le traitement de première ligne pour le traitement de la LMC. Cependant, des infections des voies respiratoires supérieures et une immunosuppression sont fréquemment observées, qui peuvent être causées par la répression de la voie de régulation immunitaire médiée par STAT (Hochhaus et al., 2016 ; Mattiuzzi et al., 2003). Nos résultats ont ajouté une base théorique pour optimiser la thérapie.

cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire

En résumé, il a été constaté que la tyrosine kinase c-Abl s'associe à STAT1 in vivo et in vitro, favorise la phosphorylation de STAT1 au niveau de Y701 indépendamment des JAK, potentialise la transactivation et médie les réponses immunitaires innées contre l'infection, en particulier dans le contexte de c -Stress lié à l'Abl. Notre découverte fournit une approche supplémentaire pour l’activation de STAT1, qui contribue au corpus croissant de connaissances concernant la régulation de la voie de signalisation en aval de l’IFN.

LES RÉFÉRENCES

Aaronson, DS et Horvath, CM (2002). Une feuille de route pour ceux qui ne connaissent pas JAK-STAT. Sciences 296, 1653-1655.

Advani, AS et Pendergast, AM (2002). Variantes BcrAbl : aspects biologiques et cliniques. Loèche. Rés. 26, 713-720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH et Kuchroo, VK (2004). La perte de T-bet, mais pas de STAT1, empêche le développement d'une encéphalomyélite auto-immune expérimentale. J. Exp. Méd. 200, 79-87.

Bradley, WD et Koleske, AJ (2009). Régulation de la migration cellulaire et de la morphogenèse par les kinases de la famille Abl : mécanismes émergents et contextes physiologiques. J. Cell Sci. 122, 3441-3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN et Kerr, IM (1996). Les mutants kinase-négatifs de JAK1 peuvent maintenir une expression génique inductible par l'interféron gamma, mais pas un état antiviral. EMBO J. 15, 799-809.

Carlesso, N., Frank, DA et Griffin, JD (1996). Phosphorylation du tyrosyle et activité de liaison à l'ADN des transducteurs de signal et des protéines activatrices de transcription (STAT) dans les lignées cellulaires hématopoïétiques transformées par Bcr/Abl. J. Exp. Méd. 183, 811-820.

Chai, SK, Nichols, GL et Rothman, P. (1997). Activation constitutive des JAK et des STAT dans les lignées cellulaires exprimant BCR Abl et les cellules du sang périphérique dérivées de patients leucémiques. J. Immunol. 159, 4720-4728.

Colicelli, J. (2010). ABL tyrosine kinases : évolution de la fonction, de la régulation et de la spécificité. Sci. Signal. 3, re6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY et Rothman, PB (1998). Une interaction directe de Jak1 et de v-Abl est nécessaire pour l'activation des STAT et la prolifération induite par v-Abl. Mol. Biol cellulaire. 18, 6795-6804.

Danial, NN, et Rothman, P. (2000). Signalisation JAK-STAT activée par les oncogènes Abl. Oncogène 19, 2523-2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R. et Koenderman, L. (1999). L'activation de STAT5 par BCR-Abl contribue à la transformation des cellules leucémiques K562. Sang 94, 1108-1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR et Vuk-Pavlovic, S. (2004). Le mésylate d'imatinib inhibe la prolifération des lymphocytes T in vitro et l'hypersensibilité de type retardé in vivo. Sang 104, 1094-1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. et Liu, X. (2017). Régulation globale de l'expression différentielle des gènes par les kinases oncogènes c-abl/arg. Méd. Sci. Surveiller. 23, 2625-2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et coll. (2014). La régulation positive des sous-unités de l'immunoprotéasome dans la myosite indique une inflammation active avec l'implication des cellules présentatrices d'antigène, des lymphocytes T CD8 et de l'IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. et Schreiber, RD (1995). Recrutement statistique par les récepteurs de cytokines phosphorylés à la tyrosine : un processus ordonné et réversible piloté par affinité. Immunité 2, 677-687.

Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. et Pendergast, AM (2013). Rôle des kinases de la famille ABL dans le cancer : de la leucémie aux tumeurs solides. Nat. Rév. Cancer 13, 559-571.

Gu, JJ, Ryu, JR et Pendergast, AM (2009). Abl tyrosine kinases dans la signalisation des lymphocytes T. Immunol. Rév.228, 170-183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. et Deisseroth, AB (1997). Rôle potentiel de bcr-abl dans l'activation de la kinase JAK1. Clin. Cancer Rés. 3, 145-149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). Bénéfices et risques à long terme du nilotinib de première ligne par rapport à l'imatinib pour la leucémie myéloïde chronique en phase chronique : mise à jour de 5- année de l'essai randomisé ENESTnd. Leucémie 30, 1044-1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. et Snapper, SB (2019). La signalisation STAT1 protège les cellules T de la cytotoxicité médiée par les cellules NK. Nat. Commun. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ et Schreiber, RD (1998). Démonstration d'un système de surveillance des tumeurs dépendant de l'interféron gamma chez des souris immunocompétentes. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 95, 7556-7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA et Baltimore, D. (1998). Rôles essentiels des tyrosine kinases Abl et Arg dans la neurulation. Neurone 21, 1259-1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE et Stark, GR (1996). Rôles des JAK dans l'activation des STAT et la stimulation de l'expression du gène c-fos par le facteur de croissance épidermique. Mol. Biol cellulaire. 16, 369-375.