Effet thérapeutique et mécanisme des glycosides de phényléthanol Cistanche sur la spermatogenèse induite par le cyclophosphamide chez la souris

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ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Sommaire]

Objectif:Explorer l'effet thérapeutique deGlycosides phényléthanoïdes Cistanchesur des souris présentant une spermatogenèse induite par le cyclophosphamide et de clarifier au préalable son mécanisme d'action.Méthode:Méthode d'extraction à l'éthanol pour extraireGlycosides phényléthanoïdes Cistanche. Quarante souris BALB/C ont été réparties au hasard en un groupe témoin, un groupe modèle, un groupe à faible doseGlycoside phényléthanoïde Cistanche(50 mg·kg-1) et un groupe à dose élevée (100 mg·kg-1), avec 10 souris dans chaque groupe. À l'exception du groupe témoin, les souris des autres groupes ont reçu une injection quotidienne de cyclophosphamide (80 mg·kg-1) pendant 5 jours consécutifs afin de préparer des modèles murins de troubles de la spermatogenèse. Après la dernière administration, les souris des groupes à faible dose et à forte dose deGlycosides phényléthanoïdes Cistancheont reçu les doses correspondantes par gavage, et les souris du groupe témoin et du groupe modèle ont reçu le même volume de solution saline normale par gavage, une fois par jour pendant 30 jours. Vingt-quatre heures après le dernier gavage, le tissu testiculaire de souris a été prélevé. Un dosage immuno-enzymatique a été utilisé pour déterminer le niveau de testostérone dans l'homogénat de tissu testiculaire de souris. La densité des spermatozoïdes, la motilité des spermatozoïdes et le taux d'anomalies des spermatozoïdes de chaque groupe ont été comparés. Les changements morphologiques du tissu testiculaire ont été observés par coloration HE. Résultats : par rapport au groupe témoin, la densité et le taux de motilité des spermatozoïdes du groupe modèle ont diminué (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Glycosides phényléthanoïdes Cistancheont été significativement augmentés (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Glycoside phényléthanoïde Cistanchegroupe a augmenté de manière significative, les couches sont distinctes, les cellules spermatogènes sont disposées proprement, étroitement et régulièrement, et le sperme peut être vu dans la lumière.Conclusion: Glycosides phényléthanoïdes Cistancheont un effet thérapeutique significatif sur le trouble de la spermatogenèse causé par le cyclophosphamide chez la souris, et son mécanisme peut être lié à l'amélioration des niveaux de testostérone dans les tissus testiculaires.

[Mots clés]Glycosides phényléthanoïdes Cistanche; cyclophosphamide; trouble de la spermatogenèse; souris, BALB/C

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En raison de l'accélération du rythme social, des mauvaises habitudes de vie et de la pollution de l'environnement, et d'autres facteurs, la qualité anormale du sperme comme l'oligospermie et l'asthénospermie sont devenues la principale cause d'infertilité masculine [1]. À l'heure actuelle, il existe moins de médicaments pour traiter l'oligospermie et l'asthénospermie, et l'effet thérapeutique n'est pas évident. Les prescriptions ou les ingrédients actifs de la médecine traditionnelle chinoise ont de bons effets sur l'amélioration de la fonction de reproduction masculine [2-6]. Cependant, en raison de la grande variété de médicaments sur ordonnance, la relation entre les effets pharmacologiques et les ingrédients efficaces du médicament n'est pas claire, ce qui limite la promotion et l'application des médicaments spermatogènes. La recherche et le développement des ingrédients efficaces de la médecine chinoise et l'étude de ses effets thérapeutiques dans les troubles de la reproduction ont une bonne valeur d'application.Glycosides phényléthanoïdes Cistanchesont l'un des ingrédients actifs les plus importants dansCistanche désertique. Ce sont généralement des glycosides naturels contenant des liaisons ester et des liaisons oxo-glycosidiques avec -glucose comme noyau. On les trouve largement dans les plantes dicotylédones [7]. Des études [8] ont montré queCistanchephényléthanoïdeglycosidespeut protéger le sperme de rat des dommages oxydatifs in vitro, mais il n'existe aucun rapport sur sa spermatogenèse. Cette expérience étudie l'effet thérapeutique des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche sur la fonction spermatogène de souris présentant une spermatogenèse induite par le cyclophosphamide et fournit une base expérimentale et théorique pour l'application deGlycosides phényléthanoïdes Cistanchedans le traitement des troubles de la spermatogenèse.

1. Matériels et méthodes

1.1. Animaux de laboratoire, principaux réactifs et instruments

40 souris BALB/C adultes de classe SPF, âgées de 6-8 semaines, avec une masse corporelle de 20-22 g, ont été achetées au Centre d'expérimentation animale de l'École de médecine de base de l'Université de Jilin, et le numéro de certificat de l'animal : SCXK (Kirghizistan) 2008-005. Les souris ont été élevées de manière adaptative pendant 5 jours avant l'expérience. Conditions d'alimentation : 22 degrés ~ 25 degrés, rythme circadien (12h/12h), eau potable et nourriture gratuites. Cistanche est un produit de Xinjiang Dakang Trading Company. Le cyclophosphamide pour injection a été acheté auprès de Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (numéro de lot 11061921). Le kit d'immunodosage enzymatique de testostérone homogénat de tissu testiculaire a été acheté auprès de Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (numéro de lot) 20120812), les autres réactifs sont tous de qualité analytique produite dans le pays. Lecteur de microplaques PLUS384 (MDC aux États-Unis), microscope inversé TE2000U (Nikon, Japon) et centrifugeuse J-26XP (Nanodrop, États-Unis).

1.2 Préparation de Cistanche Phényléthanol Glucoside

10 g de poudre de cistanche ont été extraits par reflux avec de l'éthanol à 70 %, deux fois, 2 h à chaque fois, pour obtenir le concentré de glycosides d'alcool phénéthylique. La solution concentrée a été chromatographiée sur la colonne de résine macroporeuse D101 et éluée avec de l'éthanol à 70 % pour obtenir l'alcool phénécoside Cistanche. Le spectrophotomètre UV a identifié l'extrait à une longueur d'onde de 333 nm.

1.3 Préparation du modèle animal et mode d'administration du médicament

Après 40 souris mâles BALB/C nourries de manière adaptative pendant 5 jours, les souris ont été réparties au hasard en 4 groupes (10 souris dans chaque groupe) : groupe témoin, groupe modèle, CistancheGlycosides phényléthanoïdes Cistanchegroupe à faible dose, etGlycosides phényléthanoïdes Cistanchegroupe à forte dose. À l'exception du groupe témoin, les trois autres groupes de souris ont reçu une injection intrapéritonéale de cyclophosphamide 80 mg·kg-1 pour chaque souris pendant 5 jours consécutifs afin de préparer des modèles animaux de troubles de la spermatogenèse. Une fois le modèle préparé, les souris des groupes à faible et à forte dose deCistanchephényléthanoïde ont reçu respectivement 50 et 100 mg·kg-1·j-1. Les souris du groupe témoin et du groupe modèle ont reçu des volumes égaux de solution saline normale. Une fois par jour pendant 30 jours. Toutes les souris ont été sacrifiées 24 heures après la dernière administration de médicament et des tests bilatéraux ont été effectués. Le testicule droit a été fixé avec du formaldéhyde. L'épididyme et les testicules ont été prélevés du côté gauche. Le testicule a été homogénéisé et centrifugé à 3,000 min pendant 10 min. Le surnageant a été prélevé et stocké dans une glacière à -20 degré pour le test. L'épididyme gauche a été testé pour la densité des spermatozoïdes, la motilité des spermatozoïdes et le taux de déformation.

1.4 Détermination de la densité des spermatozoïdes, de la motilité des spermatozoïdes et du taux de déformation

Placer un tube à essai contenant 10 ml de solution nutritive de sperme [9] dans un bain-marie à température constante pour le préchauffer à 37 degrés, prélever un épididyme unilatéral pour enlever le tissu conjonctif et la graisse, couper le tissu et le mettre dans un tube à essai à 37 degrés pendant 10 minutes Une fois que le sperme est entièrement libéré, prenez 1 goutte sur la plaque de comptage des cellules sanguines et calculez la densité du sperme selon la méthode de comptage des cellules. Le résultat est exprimé en nombre de spermatozoïdes par millilitre ; en outre, prélevez 5μL de suspension de sperme et la même quantité d'éosine-Y du tube à essai. Mélangez bien, placez-le à température ambiante pendant 10 minutes, ajoutez un couvercle en verre et observez avec un microscope optique. Les spermatozoïdes morts sont colorés en rose, les spermatozoïdes vivants ne sont pas colorés et le cytoplasme est transparent. Chaque spécimen compte 200 spermatozoïdes, calcule la viabilité des spermatozoïdes, le résultat est exprimé en pourcentage, viabilité des spermatozoïdes=un nombre de spermatozoïdes vivants / le nombre total de spermatozoïdes × 100 %. 5 μL supplémentaires de suspension de sperme ont été fixés dans du méthanol pendant 5 minutes, séchés et colorés avec une solution aqueuse à 2% d'éosine pendant 1 heure, rincés et séchés au sèche-cheveux. Recherchez les parties avec moins de chevauchement de spermatozoïdes sous une lentille de faible puissance et utilisez une lentille de forte puissance pour vérifier la morphologie des spermatozoïdes dans l'ordre. Chaque souris a inspecté 1,000 sperme complet. Les têtes de spermatozoïdes sans crochets, en forme de banane, amorphes, têtes grasses et têtes doubles ont été jugées comme des difformités. Le taux de déformation des spermatozoïdes a été calculé et les résultats ont été exprimés en pourcentage. Taux de déformation des spermatozoïdes=nombre de spermatozoïdes déformés / nombre total de spermatozoïdes × 100 %.

1.5 Détermination des hormones de reproduction

Le testicule a été décollé de la membrane et placé dans une boîte à flacons, et le milieu d'homogénéisation pré-refroidi (0.01mol·L-1 saccharose, 0.01mol ·L-1 Tris- HCl, 0,1 mmol·L-1 solution EDTA-Na2, pH 7,4), couper le tissu testiculaire avec des ciseaux ophtalmologiques, le verser dans un tube d'homogénéisation en verre et centrifuger à 4, 000×g pendant 10 minutes à basse température et prélevez le surnageant. Utilisez le kit de dosage immuno-enzymatique pour mesurer le niveau de testostérone dans l'homogénat de tissu testiculaire et testez 3 échantillons parallèles pour chaque échantillon. Les étapes et méthodes expérimentales ont été réalisées conformément aux instructions du kit.

1.6 Observation morphologique des testicules

Prenez des sections de paraffine de testicules de souris, colorées avec HE, et observez la distribution des spermatogonies et des cellules spermatogènes dans le tissu testiculaire sous un microscope optique.

1.7 Analyse statistique

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel statistique SPSS17.0. La densité des spermatozoïdes, le taux de motilité des spermatozoïdes, le taux de déformation des spermatozoïdes et le niveau de testostérone testiculaire des souris de chaque groupe ont été exprimés en x ± s, et la comparaison entre les groupes a été effectuée par analyse de variance à un seul facteur.

2. résultats

2.1. Densité des spermatozoïdes, motilité des spermatozoïdes et taux de déformation des spermatozoïdes de chaque groupe de souris

Par rapport au groupe témoin, la densité et la viabilité des spermatozoïdes du groupe modèle ont diminué (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche phénoxyéthanol glycosideaugmenté (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Niveaux de testostérone dans les tissus testiculaires des souris de chaque groupe

Les niveaux de testostérone dans les homogénats de tissu testiculaire du groupe témoin et du groupe modèle étaient (10.26±0.57) et (5.33±0.84) nmol·L-1, respectivement. Le niveau de testostérone du groupe modèle était significativement inférieur à celui du groupe témoin (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchele groupe à forte dose de cistanche phénéthyl glycoside était significativement plus élevé que celui du groupe à faible dose (P<>

2.3 Morphologie des testicules de souris dans chaque groupe

Observés au microscope optique, les tubules séminifères dans les testicules du groupe normal étaient densément disposés, le niveau et le nombre de cellules germinales étaient importants, l'épithélium séminifère était bien disposé et les tubules séminifères étaient tous observés avec la formation de spermatozoïdes. Dans le groupe modèle, les tubules séminifères des testicules de souris ont été atrophiés et dégénérés, l'épithélium séminifère a été considérablement aminci, le nombre de couches épithéliales a été réduit, la disposition a été désordonnée et le nombre de spermatozoïdes dans la cavité a été réduit. Par rapport au groupe modèle, la faible dose deGlycoside d'alcool phénéthylique de Cistanche.

Dans le groupe, le nombre de couches épithéliales séminifères des tubules séminifères a augmenté, la disposition de l'épithélium était plus régulière et l'endommagement des tubules séminifères était manifestement amélioré ; la structure des tubules séminifères à haute doseGlycoside phényléthanoïde Cistanchegroupe amélioré de manière plus significative, et le nombre et le nombre de couches épithéliales séminifères ont augmenté de manière significative. Arrangés soigneusement, il y a des spermatozoïdes matures dans les tubules séminifères, et la structure est fondamentalement revenue à la normale. Voir Figure 1 (encadré 6).

3 Débat

Le cyclophosphamide est un médicament antitumoral et immunosuppresseur couramment utilisé, qui interfère principalement avec une variété de fonctions biologiques intracellulaires par l'alkylation de l'ADN. La toxicité reproductive est l'un des principaux effets secondaires du cyclophosphamide [3], qui peut facilement entraîner des dommages à l'ADN des spermatozoïdes et un développement anormal des spermatozoïdes. Des études cliniques [10-11] indiquent que la toxicité reproductive du cyclophosphamide peut provoquer une azoospermie ou une oligospermie. , Conduisant à l'infertilité ou à l'apparition de défauts génétiques ou de malformations chez la progéniture.

Cistanche tubulosaest une plante parasite supérieure vivace de la famille Leiden. C'est un médicament chinois bien connu qui nourrit les reins et le yang, nourrit le sang et nourrit les intestins. C'est un médicament sur ordonnance couramment utilisé pour le traitement traditionnel du dysfonctionnement de la reproduction masculine [12].Glycosides phényléthanoïdessont l'un des composants actifs les plus importants deCistanche[13] et ont un large éventail d'effets pharmacologiques, tels que l'anti-oxydation, l'anti-vieillissement et l'anti-tumorale [14].

Dans cette étude, le cyclophosphamide a été utilisé pour préparer un modèle murin de trouble de la spermatogenèse, et l'effet thérapeutique des glycosides phényléthanoïdes Cistanche sur le trouble de la spermatogenèse causé par le cyclophosphamide a été étudié. Les résultats ont montré que par rapport au groupe normal, la densité de sperme du groupe modèle a diminué, le taux de survie a diminué et le taux de déformation a augmenté. Par rapport au groupe modèle, tous les groupes de doses de glycosides de phénoxyéthanol Cistanche peuvent augmenter efficacement la densité des spermatozoïdes, améliorer la motilité des spermatozoïdes et réduire le taux de déformation des spermatozoïdes. Les résultats ci-dessus indiquent que les glycosides de phénoxyéthanol cistanche peuvent favoriser la spermatogenèse et protéger les testicules endommagés. Les résultats de la morphologie des testicules ont montré qu'après traitement avecGlycoside phényléthanoïde Cistanche, le nombre d'épithéliums séminifères dans les testicules des souris modèles a augmenté de manière significative, les couches étaient distinctes, les cellules spermatogènes étaient disposées proprement, étroitement et régulièrement, et le sperme peut être vu dans la lumière, ce qui suggère queCistanche phényléthanoïdepeut changer Shanhe restaure la structure et la morphologie de l'épithélium séminifère après une lésion reproductive.

La testostérone régule la différenciation des cellules germinales mâles et est une condition nécessaire au développement normal des testicules et à la production normale de spermatozoïdes. Certaines études [15] ont rapporté que l'inactivation sélective des récepteurs aux androgènes dans les cellules de Sertoli du testicule provoquait des troubles du développement des spermatozoïdes et la stérilité masculine. Dans cette étude, le cyclophosphamide a été utilisé pour produire des spermatogènes.

Après le modèle de blessure par obstacle, le niveau de testostérone dans le tissu testiculaire des souris était significativement inférieur à celui du groupe normal. Après l'action des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche, les niveaux de testostérone dans chaque groupe de dose ont augmenté, et le niveau de testostérone dans le groupe à forte dose était significativement plus élevé que celui du groupe à faible dose. Il est suggéré que les glycosides de phénoxyéthanol cistanche peuvent favoriser la spermatogenèse en augmentant le niveau de testostérone dans le tissu testiculaire pour traiter le dysfonctionnement spermatogène, mais le mécanisme de son effet sur la testostérone nécessite des recherches et des discussions supplémentaires.

La testostérone régule la différenciation des cellules germinales mâles et est une condition nécessaire au développement normal des testicules et à la production normale de spermatozoïdes. Certaines études [15] ont rapporté que l'inactivation sélective des récepteurs aux androgènes dans les cellules de Sertoli du testicule provoquait des troubles du développement des spermatozoïdes et la stérilité masculine. Dans cette étude, le cyclophosphamide a été utilisé pour produire des spermatogènes.

Après le modèle de blessure par obstacle, le niveau de testostérone dans le tissu testiculaire des souris était significativement inférieur à celui du groupe normal. Après l'action deGlycosides phényléthanoïdes Cistanche, les niveaux de testostérone dans chaque groupe de dose ont augmenté et le niveau de testostérone dans le groupe à forte dose était significativement plus élevé que celui du groupe à faible dose. Il est suggéré que les glycosides de phénoxyéthanol cistanche peuvent favoriser la spermatogenèse en augmentant le niveau de testostérone dans le tissu testiculaire pour traiter le dysfonctionnement spermatogène, mais le mécanisme de son effet sur la testostérone nécessite des recherches et des discussions supplémentaires.

[références]

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[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Les flavonoïdes totaux d'Epimedium provoquent la minimisation du cyclophosphamide Recherche sur l'effet protecteur de la barrière du sperme né chez le rat [J]. Médecine brevetée chinoise, 2010, 32 (12) : 2052-2055.

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[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. Effet des granules de Shengjing de la médecine chinoise sur la spermatogenèse chez les souris altérées Recherche expérimentale sur les effets thérapeutiques [J]. Journal chinois d'andrologie, 2008, 14 (11) : 1046-1049.

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