Dysfonctionnement de l'ARN d'élément transposable dans les sphéroïdes mutants du cancer du poumon 3D KRAS (G12C)

ABSTRAIT

Le mutant KRAS régule l'expression de l'ARN de l'élément transposable (TE) et du gène stimulé par l'interféron (ISG), mais il reste difficile de savoir si diverses mutations du KRAS affectent différents ARN TE dans tout le génome. Nous avons analysé les transcriptomes de sphéroïdes 3D du cancer du poumon humain qui hébergent des mutations KRAS (G12C) pour déterminer le paysage des ARN TE régulés par le mutant KRAS (G12C). Nous avons constaté que la signalisation KRAS (G12C) est nécessaire pour l'expression des ARN TE dérivés de LINE et LTR qui sont distincts des ARN TE précédemment démontrés comme étant régulés par le mutant KRAS (G12D) ou KRAS (G12V). De plus, l'inhibition de KRAS (G12C) régule spécifiquement positivement les ARN TE dérivés du SINE de la plus jeune sous-famille Alu, AluY. Nos résultats révèlent que la dérégulation de l'ARN TE dans les cellules cancéreuses du poumon induites par KRAS dépend de la mutation, tout en mettant également en évidence un sous-ensemble de jeunes ARN TE dérivés d'Alu qui sont activés de manière coordonnée avec les gènes de l'immunité innée lors de l'inhibition de KRAS (G12C).

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INTRODUCTION

Les ARN d'éléments transposables (TE) sont dérégulés de manière récurrente dans le contexte du cancer 1. Dans les cellules mutantes du cancer du poumon KRAS, les gènes KRAB à doigt de zinc (KZNF) sont largement régulés négativement, conduisant à une régulation positive aberrante des ARN TE dérivés de LINE, SINE et Éléments LTR 2,3. En plus des ARN TE, les ARN longs non codants (ARNlnc) sont également régulés de manière coordonnée avec les gènes de signalisation RAS 4, et leurs modèles d'expression sont modifiés de la même manière dans de nombreux cancers 5-8. Pour les ARN TE, leur régulation positive dans le cancer induit un état de mimétisme viral, conduisant à l'activation intrinsèque de gènes de l'immunité innée tels que les gènes stimulés par l'interféron (ISG) 3,9,10. En particulier, la famille Alu des SINE constitue une source prédominante d’ARN TE immunogènes 11, induits par des changements épigénétiques provoqués par des inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase (DNMTi) ou par une inhibition du KZNF médiée par KRAS mutant 3,9,10.

Pour étudier comment une mutation courante de KRAS affecte le paysage de l'ARN TE dans les cellules cancéreuses du poumon, nous avons caractérisé les transcriptomes de sphéroïdes 3D du cancer du poumon qui hébergent des mutations KRAS (G12C) en présence ou en l'absence de l'inhibiteur 12 mutant de KRAS (G12C). que la signalisation KRAS (G12C) est requise pour l'expression des ARN TE dérivés de LINE et LTR, tandis que l'inhibition de KRAS (G12C) régule spécifiquement à la hausse à la fois les ARN TE dérivés de SINE et un sous-ensemble de gènes liés à l'interféron (IFN). Nos résultats révèlent l'interaction complexe entre la signalisation KRAS mutante et la dérégulation de TE dans les cellules cancéreuses du poumon, où un ensemble défini de jeunes éléments AluY est régulé positivement de manière dépendante de la mutation.

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RÉSULTATS

L'inhibition de KRAS (G12C) modifie le transcriptome codant et non codant

Pour déterminer comment la signalisation oncogène KRAS (G12C) régule le transcriptome codant et non codant, nous avons effectué un séquençage d'ARN (RNA-seq) sur des sphéroïdes de cancer du poumon KRAS (G12C) mutants 3D. Pour l’ARN-seq, nous avons utilisé un protocole complet avec des identifiants moléculaires uniques (UMI) de 5’ pour permettre un comptage précis de l’ARN tout en atténuant les biais d’amplification PCR 13 (Figure 1A). Nous avons comparé les transcriptomes des sphéroïdes du cancer du poumon H358 traités avec l'inhibiteur de KRAS (G12C) ARS -1620 (ARS) aux sphéroïdes témoins (traités au DMSO) (Figure S1A) et avons constaté que le traitement par l'ARS réduisait considérablement les niveaux d'ERK phosphorylé. (p-ERK) (Figure S1B), indiquant que le traitement ARS inhibait la signalisation KRAS (G12C) en aval. La suppression de la signalisation KRAS (G12C) par le traitement ARS a également été mise en évidence par des réductions de la taille des sphéroïdes et de la viabilité cellulaire (Figures S1C et S1D).

Au niveau de l'ARN, nous avons évalué les abondances relatives de différents biotypes et superfamilles TE dans les sphéroïdes de cancer du poumon 3D traités par ARS ou DMSO, ce qui a révélé des changements dynamiques dans la composition de l'ARN TE lors de l'inhibition de KRAS (G12C) (Figure 1B). Alors que nous avons détecté seulement 32 % des gènes codant pour des protéines annotés GENCODE et 15 % des gènes lncRNA, 92-96 % des superfamilles TE (92 % LTR, 95 % SINE, 96 % LINE) étaient représentées dans notre étiqueté UMI. Données de séquençage d'ARN, révélant une large dérégulation des ARN TE dans le transcriptome piloté par KRAS (G12C). Jusqu'à un quart de toutes les molécules d'ARN détectées dans les sphéroïdes du cancer du poumon traités par ARS provenaient de TE, ce qui indique que les ARN de TE représentent une partie importante de la production transcriptionnelle des cellules mutantes du cancer du poumon KRAS (G12C).

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Nous avons ensuite déterminé les gènes exprimés de manière significativement différentielle entre les sphéroïdes de cancer du poumon 3D traités par ARS et DMSO afin d'identifier les processus biologiques régulés par la signalisation oncogène KRAS (G12C). Les sphéroïdes du cancer du poumon avec une signalisation KRAS (G12C) intacte étaient enrichis de manière significative en gènes impliqués dans le point de contrôle G2M, les cibles E2F, les cibles MYC et le fuseau mitotique (Figure 1C). Cependant, lors de l'inhibition de KRAS (G12C), les sphéroïdes du cancer du poumon exprimaient des niveaux significativement plus élevés de gènes impliqués dans la phosphorylation par oxydation, le complément et les réponses IFN alpha et gamma (Figure 1C), fournissant ainsi des preuves supplémentaires de l'implication de la signalisation KRAS dans la régulation. des gènes liés à l'IFN 2,3.

L'inhibition de KRAS (G12C) induit de manière coordonnée des ISG et de jeunes éléments AluY

Pour élucider davantage la régulation positive intrinsèque des ISG lors de l'inhibition de KRAS (G12C), nous avons identifié quels gènes et TE étaient exprimés de manière significativement différentielle dans chaque ensemble de gènes et superfamille TE, respectivement. Parmi les gènes de réponse à l'IFN alpha et à l'IFN gamma, le gène le plus fortement induit lors de l'inhibition de KRAS (G12C) dans les sphéroïdes du cancer du poumon était RTP4 (Figure 2A), une protéine de transport du récepteur qui régule négativement la signalisation TBK1 14. De plus, le complexe CMH de classe I le gène bêta-2-microglobuline (B2M), qui est inactivé de manière récurrente dans le cancer du poumon 15, a également été régulé positivement de manière significative dans les deux ensembles de gènes liés à l'IFN dans les sphéroïdes du cancer du poumon traités par ARS (Figure 2A).

Compte tenu du rôle direct de la signalisation oncogène KRAS dans la régulation 3 de l'ARN TE, nous avons étudié quelles sous-familles d'ARN TE dépendaient du mutant KRAS (G12C). Dans les sphéroïdes du cancer du poumon avec signalisation KRAS (G12C) intacte, nous avons constaté que les sous-familles LINE L1M6B et L1PA12 étaient fortement exprimées et dépendantes de KRAS (G12C), comme en témoigne leur régulation négative dans les sphéroïdes du cancer du poumon traités par ARS (Figure 2B). De plus, alors qu'une seule sous-famille d'ADN MER44D dépendait de la signalisation KRAS(G12C), plus d'une douzaine de sous-familles LTR étaient régulées par le mutant KRAS(G12C), notamment MLT1A0-int, LTR51, MER50B. , et LTR1B0 (Figure 2B). En revanche, les sous-familles SINE étaient toutes significativement régulées positivement lors de l'inhibition de KRAS (G12C) et induites de manière coordonnée avec des gènes ISG spécifiques (Figure 2A) dans les sphéroïdes du cancer du poumon. Ces ARN SINE TE étaient tous dérivés de la sous-famille AluY (Figure 2B), ce qui indique que l'inhibition de KRAS (G12C) dérégule un sous-ensemble spécifique de jeunes éléments AluY.

L'inhibition de KRAS (G12C) régule à la baisse les longs ARN non codants

Pour élucider davantage les effets de l'inhibition de KRAS (G12C) sur le transcriptome, nous avons examiné tous les ARNnc exprimés de manière significativement différentielle dans les sphéroïdes du cancer du poumon traités avec un contrôle ARS ou DMSO. Nous avons constaté qu'un grand nombre d'ARNnc dépendaient de la signalisation KRAS (G12C) pour leur expression, car nombre de ces ARNnc étaient significativement régulés négativement lors de l'inhibition de KRAS (G12C) (Figure 3A). Trois de ces ARNnc régulés négativement, AC114546.3, NCMAP-DT et AC073575.2, n'ont aucune fonction connue mais se chevauchent dans une orientation antisens par rapport aux gènes codants ZNF770, RCAN3 et ERP29, respectivement. En tant que classe d'ARN non codants, nous avons observé une large régulation négative des lncARN lors du traitement par ARS dans les sphéroïdes du cancer du poumon (Figure 3B), indiquant que de nombreux lncARN dépendent de la signalisation KRAS (G12C) pour leur expression.

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DISCUSSION

Nous montrons ici que la signalisation oncogène KRAS (G12C) est nécessaire à l'expression de superfamilles TE spécifiques, à savoir les éléments LINE et LTR, ainsi qu'un sous-ensemble d'ARNnc, démontrant ainsi comment la signalisation RAS régule le transcriptome non codant 2-4. Nous avons également utilisé un modèle sphéroïde 3D du cancer du poumon pour nos expériences sur les inhibiteurs de KRAS (G12C), car il a été démontré que les modèles 3D récapitulent plus fidèlement la réponse médicamenteuse in vivo par rapport aux modèles de culture 2D 16. De plus, notre application d'un modèle complet basé sur l'UMI La technique 13 de séquençage d'ARN de longueur nous a permis de capturer plus précisément la composition et la dynamique de l'ARN TE dans nos sphéroïdes de cancer du poumon en supprimant les doublons de PCR dans nos données de séquençage d'ARN.

Nos résultats concordent avec les études précédentes sur l'inhibition de KRAS (G12C), dans lesquelles les gènes de réponse à l'IFN alpha et gamma étaient régulés positivement dans les cellules de cancer du poumon H358 traitées par ARS 17. Sur la base des propriétés immunogènes connues des ARN dérivés de l'Alu 11, nos résultats suggèrent que la régulation positive spécifique des jeunes éléments AluY lors de l'inhibition de KRAS (G12C) est au moins en partie responsable de la forte régulation positive des ISG dans les sphéroïdes du cancer du poumon traités par ARS. Notamment, l'enrichissement significatif des gènes liés à l'IFN en réponse au traitement par un inhibiteur de KRAS (G12C) n'inclut pas la régulation positive supplémentaire des ISG des capteurs d'ARN tels que MDA -5, RIG-I ou PKR, qui sont initialement régulés positivement dans cellules pulmonaires en réponse à la signalisation oncogène KRAS 2,3.

Nous avons précédemment montré que la signalisation KRAS mutante à elle seule est suffisante pour induire une régulation positive de l'ARN TE dans les cellules pulmonaires humaines transformées in vitro 2,3, et nos résultats décrits ici étendent ces observations aux cellules cancéreuses du poumon présentant une mutation KRAS activatrice différente. Les mutations KRAS (G12D) ou KRAS (G12V) induisent toutes deux une régulation positive significative de la sous-famille LTR12C dans les cellules pulmonaires transformées 3, mais nous n'avons pas constaté d'enrichissement significatif en ARN TE dérivés de LTR12C dans nos sphéroïdes de cancer du poumon KRAS (G12C). Au lieu de cela, nous avons constaté une régulation positive de LTR51, LTR1B0, LTR14B et LTR28B, suggérant que diverses mutations de gain de fonction dans KRAS régulent différents aspects du transcriptome de l'ARN TE.

Nos travaux fournissent une évaluation complète de la manière dont le transcriptome d'ARN non codant/TE répond dynamiquement à l'inhibition de KRAS (G12C). Des études futures pourraient fournir de nouvelles informations sur les rôles potentiels des ARN non codants/TE dans les mécanismes de résistance aux inhibiteurs de KRAS (G12C). De plus, les ARN TE sécrétés par les cellules cancéreuses lors de l'inhibition de KRAS peuvent servir de biomarqueurs d'ARN extracellulaires 2,3,5,18,19 de réponse et/ou de résistance aux thérapies par inhibiteurs de KRAS 20.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Lignées cellulaires

Les lignées cellulaires de cancer du poumon H358 contenant la mutation KRAS (G12C) ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Sigma) à 37 degrés, 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Toutes les lignées cellulaires ont été testées négatives pour les mycoplasmes. Les lignées cellulaires ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC).

Tests de viabilité cellulaire

Pour les tests de viabilité sphéroïde, 10 000 cellules/puits ont été ensemencées dans des plaques de puits 96-à fond rond à faible adhérence et incubées à 37 degrés, 5 % de CO2 pendant 24 heures. Ensuite, de l'ARS- 1620 ou du DMSO dilué en série ont été ajoutés aux cellules et les plaques ont été incubées dans des conditions de culture standard pendant 72 heures, les milieux ARS et DMSO frais étant remplacés quotidiennement. La viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide d'un kit de test de viabilité cellulaire luminescente Cell Titer-Glo® (Promega) conformément au protocole du fabricant. Le signal de luminescence des échantillons traités par ARS a été normalisé au contrôle DMSO. La luminescence a été mesurée sur un appareil moléculaire SpectraMax iD3.

Isolement de l'ARN

L'ARN en vrac total a été isolé d'environ 100 sphéroïdes H358 (par condition) à l'aide du kit Quick-RNA Mini-Prep (Zymogen) conformément au protocole du fabricant. L'ARN a été quantifié via le spectrophotomètre NanoDrop-8000.

Préparation de la bibliothèque d'ARN-seq

Un protocole Smart-seq3 13 adapté a été utilisé pour générer des bibliothèques d'ARN-seq à partir de l'ARN total afin de compter et d'évaluer les molécules d'ARN complètes. En bref, 1 0 ng d'ARN total a été soumis à une transcription inverse à l'aide d'une amorce oligoDT à code-barres (125 nM), suivie d'un changement de modèle avec un oligo de commutateur de modèle à code-barres (125 nM). Ces oligoséquences ont servi d'amorces pour l'amplification PCR. Le kit Nextera HT (Illumina) a été utilisé pour convertir des bibliothèques d'ADNc en bibliothèques de séquençage avec l'ajout d'une amorce spécifique à l'UMI pour amplifier les extrémités d'ADNc contenant des codes-barres moléculaires comme décrit dans le protocole Smart-seq3. La qualité de l'ADNc et de la bibliothèque a été évaluée à l'aide d'une puce à haute sensibilité d'ADN de bioanalyseur Agilent et quantifiée à l'aide du test d'ADN à haute sensibilité sur le Qubit 3.0.

Western blot

Environ 100 sphéroïdes H358 (par condition) ont été isolés après un traitement ARS ou DMSO. Les sphéroïdes ont ensuite été incubés sur de la glace dans un tampon RIPA complété par un inhibiteur de protéase pendant 15 minutes. Les lysats ont ensuite été centrifugés à 10,000 RCF pendant 10 minutes. Le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube pour une préparation ultérieure de l'échantillon SDS-PAGE dans un tampon Laemmli, bouilli pendant 5 minutes à 95 °C pour une concentration finale de 1 mg/ml. SDS PAGE a été réalisée pour séparer les protéines par taille, suivie d'un transfert ultérieur sur une membrane PVDF. Les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires p-ERK (CST) et HSP90 (CST) pendant une nuit à 4 ° C. Les anticorps secondaires (Abcam) ont ensuite été incubés sur des membranes lavées trois fois au TBST dans un tampon de blocage pour une imagerie ultérieure.

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Déduplication UMI

Les lectures d'éclairage d'extrémité appariées ont été découpées par adaptateur à l'aide de FastP 21 avec les paramètres par défaut. Les UMI ont été extraites de la lecture et déplacées vers le nom de lecture à l'aide de l'extrait umi_tools_du package UMI-tools 22 avec le modèle de code-barres défini sur "NNNNNNNN". Les lectures supprimées de l'UMI ont été alignées sur HG38 à l'aide de l'aligneur STAR avec l'ensemble d'annotations GENCODE v38. Les lectures alignées ont été dédupliquées à l'aide de « déduplication des outils UMI » avec les paramètres par défaut.

Analyse de séquençage d'ARN

Tous les fichiers fastq ont été découpés avec Trimmomatic 2 (0.38) 23 et les fichiers découpés résultants ont été évalués avec FastQC 24 puis traités avec le pipeline analytique suivant : Salmon (1.3.0) : pseudo-alignement de l'ARN. -seq lit effectué avec Salmon 25 en utilisant les arguments suivants : {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 en utilisant un index créé à partir du fichier fasta du transcriptome GENCODE version 35 utilisant des séquences leurres pour permettre un alignement sélectif. Un index supplémentaire, compatible TE, a été créé de la même manière, mais complété par des séquences générées à partir de la piste UCSC Repeat Masker. DESeq2 (1.32.0) : la sortie Salmon a été importée dans un objet DESeq à l'aide de tximport 26 et une analyse d'expression différentielle a été effectuée avec les arguments standard 27. Tous les résultats ont été filtrés pour avoir padj < 0,05. Lorsque les données de décompte ont été utilisées, elles ont été normalisées sur tous les échantillons à l'aide de DESeq.

Analyse d'enrichissement des ensembles de gènes

Les gènes différentiellement exprimés ont été classés en fonction des valeurs réduites de log2FoldChange générées par DESeq2. Les ensembles de gènes ont été acquis à l'aide du package R msigdbr (7.4.1) et filtrés pour contenir uniquement les ensembles de gènes ayant le statut « Hallmark ». Le package R fgsea (1.18.0) a été utilisé pour générer des estimations d'enrichissement des ensembles de gènes qui ont été filtrées en résultats avec des valeurs p ajustées < 0,05.

LES RÉFÉRENCES

1. Burns, KH (2017). Éléments transposables dans le cancer. Nat Rév Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.

2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et coll. (2020). Reprogrammation épigénomique d'ARN non codants répétitifs et de gènes stimulés par l'IFN par le mutant KRAS. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.

3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L. ., et coll. (2022). Le mutant KRAS régule l'ARN des éléments transposables et l'immunité innée via les gènes à doigt de zinc KRAB. Rapports cellulaires 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.

4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB et Wold, BJ (2015). L’analyse du transcriptome unicellulaire révèle des changements dynamiques dans l’expression de lncRNA au cours de la reprogrammation. Cellule Cellule souche 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. Reggiardo, RE, Maroli, SV et Kim, DH (2022). Biomarqueurs LncRNA de l’inflammation et du cancer. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.

6. Schmitt, AM et Chang, HY (2016). ARN longs non codants dans les voies du cancer. Cellule cancéreuse 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

7. Rinn, JL et Chang, HY (2020). ARN longs non codants : modalités moléculaires des fonctions de l'organisme. Annuel Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.

8. Slack, FJ et Chinnaiyan, AM (2019). Le rôle des ARN non codants en oncologie. Cellule 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.

9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A. et coll. (2015). L'inhibition de la méthylation de l'ADN provoque une réponse à l'interféron dans le cancer via l'ARNdb, y compris les rétrovirus endogènes. Cellule 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.

10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J. et coll. (2015). Les agents déméthylants de l'ADN ciblent les cellules du cancer colorectal en induisant un mimétisme viral par des transcriptions endogènes. Cellule 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.

11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S. ., et coll. (2020). La thérapie épigénétique induit la transcription des SINE inversés et la dépendance à ADAR1. Nature 588, 169-173. 10,1038/s41586-020-2844-1.

12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA et Shokat, KM (2013). Les inhibiteurs de K-Ras (G12C) contrôlent de manière allostérique l'affinité du GTP et les interactions effectrices. Nature 503, 548- 551. 10.1038/nature12796.

13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR et Sandberg, R. (2020). Comptage d’ARN unicellulaire à résolution allélique et isoforme à l’aide de Smart-seq3. Nat Biotechnologie 38, 708-714. 10,1038/s41587-020- 0497-0.

14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK et al. (2020). RTP4 inhibe la réponse à l'IFN-I et améliore le paludisme cérébral expérimental et la neuropathologie. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.

15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G., et al. (2017). Le profilage génomique des xénogreffes dérivées de patients pour le cancer du poumon identifie l'inactivation de B2M altérant l'immunoreconnaissance. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.

16. Sen, C., Freund, D. et Gomperts, BN (2022). Modèles tridimensionnels du poumon : passé, présent et futur : une mini revue. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P., et al. (2022). L'inhibition thérapeutique de KRAS (G12C) entraîne une immunité antitumorale efficace médiée par l'interféron dans les cancers du poumon immunogènes. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.

18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U. et Kim, DH (2022). Signatures d'ARN extracellulaires de cellules d'adénocarcinome pulmonaire KRAS (G12C) mutantes. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.

19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF et Demirci, U. (2021). Vers l'isolement et la détection des exosomes à base microfluidique pour la thérapie tumorale. Nano aujourd'hui 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F. et Malek, S. (2021). Thérapies ciblées RAS. Nat Rev Drug Découverte. 10,1038/s41573-021-00220-6.

21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. et Gu, J. (2018). fastp : un préprocesseur FASTQ tout-en-un ultra-rapide. Bioinformatique 34, je884-i890. 10.1093/bioinformatique/bty560.

22. Smith, T., Heger, A. et Sudbery, I. (2017). Outils UMI : modélisation des erreurs de séquençage dans les identifiants moléculaires uniques pour améliorer la précision de la quantification. Génome Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.

23. Bolger, AM, Lohse, M. et Usadel, B. (2014). Trimmomatic : un trimmer flexible pour les données de séquence Illumina. Bioinformatique 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatique/btu170.

24. Brown, J., Pirrung, M. et McCue, LA (2017). Tableau de bord FQC : intègre les résultats FastQC dans un outil de contrôle qualité FASTQ basé sur le Web, interactif et extensible. Bioinformatique. 10.1093/bioinformatique/btx373.

25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA et Kingsford, C. (2017). Salmon fournit une quantification rapide et sensible aux biais de l’expression de la transcription. Méthodes Nat 14, 417-419. 10.1038/nméth.4197.

26. Soneson, C., Love, MI et Robinson, MD (2015). Analyses différentielles pour RNA-seq : les estimations au niveau de la transcription améliorent les inférences au niveau des gènes. F1000Research.7563.2.

27. Love, MI, Huber, W. et Anders, S. (2014). Estimation modérée du changement de pli et de la dispersion pour les données RNA-seq avec DESeq2. Génome Biol 15, 550. 10,1186/s13059-014- 0550-8.

REMERCIEMENTS

Nous remercions les membres du Kim Lab pour leurs discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des fonds de la Baskin School of Engineering (au DHK). DC a été soutenu par une bourse de recherche prédoctorale du programme de recherche sur les maladies liées au tabac (T30DT0997), RER a été soutenu par une bourse de transition F99/K00 NIDDK KUH prédoctorale à postdoctorale des National Institutes of Health (1F99DK{ {7}}), et VP a reçu une bourse de recherche prédoctorale du programme de recherche sur les maladies liées au tabac (T32DT4904).

CONTRIBUTIONS D'AUTEUR

DHK a conceptualisé la recherche, DC et DHK ont conçu la recherche, DC, JL et GM ont réalisé des expériences, RER et VP ont analysé les données, et DC et DHK ont rédigé l'article avec la contribution des auteurs.

LES FIGURES

Figure 1. L'inhibition de KRAS (G12C) modifie le transcriptome A codant et non codant. Schéma expérimental. B. Répartition des comptes attribués aux superfamilles de codage GENCODE, lncRNA et TE/répétition dans les bibliothèques de séquençage d'ARN sphéroïdes de cancer du poumon traitées par ARS (ars) ou DMSO (dmso), où chaque colonne représente une réplique biologique. C. Résultats significatifs de l'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes observés dans les sphéroïdes de cancer du poumon traités au DMSO (droite, NES positif) ou traités par ARS (gauche, NES négatif) en utilisant des gènes différentiellement exprimés classés par score d'enrichissement normalisé (NES).

Figure 2. L'inhibition de KRAS (G12C) induit de manière coordonnée des ISG et des jeunes éléments AluY

A. Graphiques volcaniques illustrant une expression différentielle significative observée dans des ensembles de gènes clés entre les sphéroïdes de cancer du poumon traités au DMSO (à droite, changement de pli positif) ou traités par ARS (à gauche, changement de pli négatif). B. Graphiques volcaniques illustrant une expression différentielle significative observée dans les superfamilles TE entre les sphéroïdes de cancer du poumon traités au DMSO (à droite, changement de pli positif) ou traités par ARS (à gauche, changement de pli négatif).

Figure 3. L'inhibition de KRAS (G12C) régule à la baisse les longs ARN non codants

A. Graphique volcanique de l'expression différentielle significative des ARN codant pour les protéines GENCODE et des ARNlnc entre les sphéroïdes de cancer du poumon traités au DMSO (à droite, changement de pli positif) ou traités à l'ARS (à gauche, changement de pli négatif). B. Diagramme en boîte de l'expression différentielle significative des ARN codant pour les protéines GENCODE et des ARNlnc entre les sphéroïdes de cancer du poumon traités au DMSO (en haut, changement de pli positif) ou traités par ARS (en bas, changement de pli négatif) (Wilcoxon).

FIGURE SUPPLÉMENTAIRE

Figure S1.

A. Sphéroïdes de cancer du poumon H358 3D traités avec ARS ou DMSO. B. Western blot pour p-ERK et HSP90 à l’aide de sphéroïdes de cancer du poumon H358 3D traités avec ARS ou DMSO. C. Mesures de diamètre (en micromètres) (tracé de gauche) et viabilité cellulaire (viabilité des cellules luminescentes Cell Titer-Glo® en unités de fluorescence relatives) (tracé de droite) de sphéroïdes de cancer du poumon H358 3D traités avec ARS ou DMSO après 3 ou 5 jours de traitement (500 nM ARS-1620 ou DMSO). D. Mesures de diamètre (en micromètres) de sphéroïdes de cancer du poumon H358 3D traités avec différentes concentrations d'ARS-1620 (nM) pendant 7 jours.