Traitement des calculs rénaux : G. Fruticosus
Mar 22, 2022
Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com
PARTIE Ⅰ : Évaluations de l'efficacité curative des extraits au solvant de G. fruticosus chez des rats mâles Wistar néphrolithiatiques induits expérimentalement
Tilahun Alelign, Tesfaye Sisay Tessema, Asfaw Debella et Beyene Petros
Arrière plan
Urolithiase(des pierresdans les voies urinaires) affecte environ 12 % de la population mondiale à un moment donné de leur vie [1]. D'autres études ont rapporté que la prévalence mondiale decalculs rénauxvarie entre 2 et 20 % [2, 3]. La lithiase urinaire affecte tous les âges, sexes et races [4,5], mais elle survient plus fréquemment chez les hommes que chez les femmes entre 20 et 49 ans [6]. La pathogenèse decalculs rénauxreste incomplètement compris [7] et son traitement reste un défi, bien qu'il existe des modalités de traitement modernes, y compris ESWL [8]. La séquence d'événements qui déclenchentpierrela formation comprend la nucléation, la croissance, l'agrégation et la rétention de cristaux dans les reins [9, 10].
Pierre rénalela formation nécessite une rétention persistante des cristaux dans lereinsaprès l'achèvement du processus de cristallisation [11, 12]. L'interaction des cristaux de COM avec une surface de cellules épithéliales rénales est un événement déclencheur critique dans la néphrolithiase [13]. Les interactions cristal-cellules entraînent le mouvement des cristaux du côté basolatéral des cellules vers la membrane basale [14]. Une étude sur des modèles animaux a également révélé que l'administration de fortes concentrations de cristaux de CaOx ou d'ions oxalate semble être toxique, provoquant des lésions des cellules tubulaires rénales [7]. L'exposition à des niveaux plus élevés de cristaux d'oxalate ou de CaOx induit une lésion des cellules épithéliales, qui est un facteur prédisposant à lapierreformation [15, 16].
Un déséquilibre entreurinairepierreIl a été suggéré que les inhibiteurs et les promoteurs étaient la cause depierreconstitution [17]. Les promoteurs facilitentpierreformation [18], mais les inhibiteurs diminuent l'initiation de la sursaturation, la nucléation, la croissance cristalline et le taux d'agrégation [17]. Cependant, les inhibiteurs fonctionnent de la même manière pour tout le monde ; donc, certaines personnes forment des pierres; tandis que d'autres ne le font pas [19]. Parmi les récurrentspierreexcrétion urinaire d'oxalate était plus élevée, alors que l'excrétion de citrate était plus faible Une étude a également indiqué que l'oxalate peut faciliter la réabsorption du chlorure, du sodium et de l'eau dans les tubules proximaux et activer de multiples voies de signalisation dans les cellules épithéliales rénales [20].
Malgré des améliorations considérables de la thérapie médicale telles que l'utilité de la lithotritie extracorporelle par ondes de choc (ESWL), il n'existe aucun médicament satisfaisant pour traiter les calculs rénaux [21]. Le traitement ESWL est associé à une lésion rénale aiguë due à l'effet traumatique de l'onde de choc et à des infections après traitement [22]. Il en résulte également des résultats incompletspierredédouanement, et incapable d'éviter de nouveauxpierreformations [23], oupierrerécurrences souvent jusqu'à 60 pour cent [24,25]. Après le premier épisode d'unpierre, le taux de récidive est supérieur à 50 % en 10- ans [26,27]. Par conséquent,calcul rénalla récidive est un risque majeur, considéré comme un défi clinique non relevé dans le domaine de l'urologie [28].Pierreles patients en formation sont sujets à ses récidives après le premier traitement chirurgical [29]. Même si les compositions chimiques d'unpierreinfluencent le choix de l'intervention [30], la chirurgie ouverte reste le pilier du traitement [31]. Quelques plantes médicinales étudiées jusqu'à présent contre la lithiase urinaire sont indiquées dans le tableau 1
En Éthiopie, la plupart des patients comptent sur les plantes médicinales traditionnelles comme thérapie alternative pour diverses maladies, y compris la lithiase urinaire. Les plantes médicinales sont abordables, accessibles, efficaces, avec moins d'effets secondaires et sont mieux compatibles avec le corps humain [41], par rapport aux médicaments conventionnels [42]. Dans la présente étude,G. fruticosus(L.) ont été sélectionnés pour examiner leurs effets sur la lithiase urinaire induite expérimentalement. Une étude approfondie de la littérature a été réalisée pour vérifier qu'aucune des parties de plantes médicinales sélectionnées n'a été étudiée jusqu'à présent sur les activités anti-urolithiatiques. À ce jour, il existe également des preuves scientifiques insuffisantes rapportées sur l'activité anti-héro-lithiatique de cette plante médicinale. Par conséquent, l'objectif de l'étude était d'évaluer l'efficacité curative des plantes médicinales chez des rats mâles néphrolithiatiques induits expérimentalement.
Tableau 1 Plantes médicinales possédant des effets anti-urolithiatiques dans des études antérieures
matériaux et méthodes
Identification et collecte de matériel végétal médicinalGomphocarpusfruticosus(G. fruticosus) les feuilles ont été récoltées pendant ses périodes de floraison ou de fructification. LaG. fruticosus(L)Ait.f, connu sous le nom de Tifrena (nom local), a été collecté à Bole Bulbula vers "93 Mazoria" Addis-Abeba en octobre 2018.G. fruticosusL.Ait.f(Asclepiadaceae)(rapporté par un informateur clé) a été réclamé pour le traitement de la lithiase urinaire. Les spécimens de plantes ont été soumis à l'Herbier national, Département de biologie végétale et de gestion de la biodiversité, Université d'Addis-Abeba (AAU) pour authentification taxonomique (TA238), et le numéro de collection correspondant a été donné. Les spécimens ont été déposés à l'Herbier national de l'AUA pour de futures références.
Préparation de l'extrait brut
Les matières végétales ont été soigneusement nettoyées à l'eau du robinet pour éliminer les contaminants et séchées dans un hangar à température ambiante de 2 à 3 semaines au laboratoire de sciences biomédicales, AAU. Les parties de plantes séchées ont été finement réduites en poudre à l'aide d'un broyeur de cuisine (mortier et pilon d'environ 9 pouces de diamètre). Les poudres sont passées au travers d'un tamis de 3 mailles de façon à filtrer une matière solide grossière.
Les extraits ont été préparés selon une procédure similaire à celle souvent utilisée par les guérisseurs traditionnels ou les patients, avec quelques modifications mineures. Les poudres de plantes ont été trempées dans de l'eau distillée, qui a été placée sur un shaker pendant 72h. Le mélange a été filtré sur coton/gaze, puis sur papier filtre Whatman numéro 1 (taille des pores : 1 l μm) pour éliminer les fines particules végétales solides ou les constituants insolubles. Les extraits entiers ont été concentrés à sec à l'aide d'un lyophilisateur en éliminant l'eau distillée. sous pression réduite. Ensuite, les concentrés semi-solides ont été versés dans des boîtes de pétri en verre et laissés sécher complètement dans un bain-marie réglé à 45 degrés. Les extraits secs finaux ont été recueillis et stockés dans des flacons stériles étiquetés recouverts d'un bouchon étanche et conservés dans le congélateur à -20 degré jusqu'à ce qu'il soit utilisé dans les expériences.
Préparations des extractions successives au solvant
Gomphocarpus fruticosusl'extrait mère (aqueux) a été partagé avec des solvants de polarité croissante des solvants non polaires aux solvants polaires, garantissant qu'une plage de polarité plus large de composés pouvait être extraite. Des extractions successives ont été séquentiellement démarrées avec de l'éther de pétrole, suivies de chloroforme, d'acétate d'éthyle, de butanol et d'eau, dans lesquelles ces solvants ont été éliminés et concentrés sous un évaporateur rotatif sous vide. Les matières végétales macérées dans l'eau distillée ont été lyophilisées sous lyophilisateur pour obtenir les résidus en poudre. Les extraits séchés ont été bouchés hermétiquement avec des bouchons et stockés dans des bouteilles en verre et conservés au réfrigérateur à -20 degré C jusqu'à leur utilisation pour l'expérience.
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Produits chimiques et réactifs/médicaments standards
Les produits chimiques et réactifs ou kits utilisés étaient de qualité analytique achetés auprès de diverses sources. L'approvisionnement en éther de pétrole, chloroforme, acétate d'éthyle, butanol et éthanol provenait de Wisteam PLC (Addis-Abeba, Éthiopie), de phosphate monopotassique (anhydre), de phosphate de sodium (dibasique anhydre extra pur), de tampon Tris-HCl (CaHuNO), et le chlorure de sodium (NaCl) ont été achetés auprès de Micron International Trading House PLC (Addis Abeba, Éthiopie). De même, l'isoflurane et le formaldéhyde ont été achetés auprès de Neway Chemicals PLC (Addis Abeba, Éthiopie). Cl) ont été achetés auprès de Pharma PLC (Addis-Abeba, Éthiopie). Les tubes EDTA, les tubes séparateurs de sérum, les tubes capillaires et les lames chirurgicales ont été achetés auprès de Micro Pharma PLC (Addis-Abeba, Éthiopie). De plus, des kits pour les tests de la fonction hépatique et rénale ont été achetés auprès d'un Roshi PLC (Londres, Angleterre). Les kits de dosage colorimétrique de l'oxalate (acide oxalique) et le dosage colorimétrique/fluorimétrique du citrate achetés auprès des kits BioVision Incorporated étaient (Milpitas, USA). La poudre de citrate de potassium a été obtenue auprès du Black Lion Referral Hospital (Addis-Abeba, Éthiopie). Cystone (formulation polyherbal) a été achetée auprès de Mumbi, en Inde. Acide ascorbique, qui a été acheté auprès de Micron International Trading House PLC (Addis-Abeba, Éthiopie).
Solubilisation de l'extrait de plante et des médicaments standard Les extraits de test/médicaments de différentes concentrations ont été dissous à l'aide de véhicules appropriés, qui étaient de l'eau distillée et 3 % de Tween 80. Tous les extraits de plantes et le citrate de potassium ont été dissous dans de l'eau distillée à différentes concentrations. La procédure utilisée pour dissoudre Cystone était similaire aux méthodes de Pha-tak et Hendre [43] et Garimella et al. [44] avec quelques modifications. Les comprimés de Cystone ont été réduits en poudre à l'aide d'un mortier et d'un pilon (taille : 0 0,23 m) et dissous (suspendus) dans de l'eau distillée (900 ul) et 100 ul de Tween 80 à 3 % (c'est-à-dire 750 mg/ml). Ensuite, ils ont été conservés pendant 3 h pour se dissoudre, centrifugés à 1 000 rpm pendant 5 min et filtrés à travers un papier filtre de 0,22 mm de diamètre. Le surnageant clair a été recueilli et utilisé pour la nucléation de l'oxalate de calcium et les tests d'agrégation. Les extraits ont été recueillis à l'aide de tubes Falcon ( 45 ml), étanche à l'air et stocké au réfrigérateur jusqu'à l'utilisation expérimentale. Les extraits de test et les médicaments standard ont été préparés quotidiennement et peu de temps avant les administrations de test à la dose de 200 mg/kg d'extraits, 750 mg/kg de Cystone et 2,5 g/kg de citrate de potassium. Le volume de dosage de la substance d'essai était de 2 ml/100 g de poids corporel. De l'eau déionisée a été utilisée pour préparer tous les extraits/médicaments et ceux-ci ont été préparés quotidiennement avant les administrations d'essai.
Investigations pharmacologiques urolithiatiques in vivo
Animaux cibles : des rats Wistar albinos mâles adultes en bonne santé du même groupe d'âge entre 8 et 10 semaines et pesant (220-280 g) ont été utilisés, achetés auprès de l'Institut éthiopien de santé publique (EPHI) et élevés au Biomed-ical Laboratoire des sciences animales, AAU. L'expérience a été menée au Laboratoire de sciences biomédicales de l'AUA et de l'EPHI, conformément aux directives standard internationalement acceptées pour l'utilisation des animaux dans la recherche scientifique. Avant de commencer l'expérience, les rats ont été acclimatés aux conditions de laboratoire standard (6 rats par cages en polypropylène) pendant 7 jours. Ils ont été conservés dans un environnement contrôlé de température (27 ± 2 degrés), d'humidité relative (55 ± 5 %) et de lumière (cycles lumière/obscurité de 12 h). Ces rats ont été nourris avec des granulés réguliers (régime standard) et ont reçu de l'eau potable gratuite (ad libitum) pendant 28 jours.
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Induction de la lithiase urinaire
Calculs rénauxont été induits en utilisant de l'éthylène glycol (EG) avec du chlorure d'ammonium (NHCl) administré dans l'eau potable du rat. Dans ce modèle d'hyperoxalurie, 1 % (p/v) de NHACl a été administré avec 0,75 % (v/v)EG pendant les 5 premiers jours pour accélérer la lithiase, après quoi l'approvisionnement en eau a été commuté sur {{4 }}.75 % EG seul pendant les 25 prochains jours [45-47]. L'exposition à ces niveaux de dose était suffisamment tolérable dans les études animales [48]. Les administrations d'EG entraînent une hyperoxalurie, qui à son tour entraîne un dépôt de CaOx dans les reins [49]. Les rats expérimentaux désignés commepierreles groupes curatifs recevaientpierreinduire un traitement pendant 28 jours.
Effets curatifs de la lithiase urinaire
Dans le traitement curatif (dissolution), un total de 54 rats mâles Wistar al-binos ont été divisés au hasard en 9 groupes comprenant 6 individus par groupe avec des poids corporels correspondants. Dans le traitement curatif, la maladie a été induite prioritairement du jour 1 au jour 14. Ensuite, chacun des extraits/médicaments a été administré par voie orale du jour 15 au jour 28 en même temps que les protocoles d'induction de la maladie (EG) pour déterminer les effets curatifs [50, 51] . Au bout de 28 jours, les rats ont été sacrifiés pour des études biochimiques et histopathologiques. La conception expérimentale a été attribuée au groupe I (contrôle normal), au groupe II (contrôle Lithia-tique), au groupe I (K-Cit), au groupe IV (Cystone), au groupe V (G. fruticosusextrait de PET), groupe VI (extrait de G.fruti-costs Chl.), groupe VI(G. fruticosusExtrait d'EtOAc), groupe VIII (extrait de G. fruticosus BuOH) et groupe IX (G. fruticosusaq. fraction). D'autres chercheurs ont également utilisé du citrate de potassium (2,5 g/kg) comme contrôle positif [52, 53]. Le volume de dosage était de 2 ml/100 g de poids corporel. Le groupe témoin a reçu de l'eau distillée une fois par jour tout au long de l'expérience. A la fin du 28ème jour, les rats ont été sacrifiés pour des études biochimiques et histopathologiques.
Collecte d'urine et analyse microscopique
Les profils urinaire, sérique et histologique sont des indicateurs depierreformation ainsi que les récidives. L'abondance et la morphologie des cristaux d'oxalate de calcium formés sous in vivopierreles inductions ont été examinées à l'aide d'un microscope optique (Wagtech Thatcham Berkshire RG194QD, Royaume-Uni, grossissement 40x). Les rats ont été placés dans des cages métaboliques séparées et soumis à une collecte d'urine de 24 heures au jour 28 pour un test curatif [50]. Dans l'analyse de la cristallurie, environ 3 ml des échantillons d'urine frais collectés ont été placés dans un tube en verre et centrifugés à 3000 tr/min pendant 10 min pour éliminer les débris, et les surnageants ont été jetés. Ces sédiments d'urine ont été utilisés pour déterminer la formation de cristaux de CaOx. Environ 10 ul des sédiments tourbillonnés ont été placés sur une lame de verre de microscope (recouverte d'une lamelle) et examinés pour les cristaux de CaOx compte tenu de leur nombre et de leur taille sous un microscope optique (40x). Les cristaux formés à partir de produits chimiques dans l'urine ont été soigneusement examinés à partir d'autres artefacts d'urine. Les photographies des observations microscopiques ont été prises à l'aide d'un appareil photo numérique (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP avec zoom optique 3x, New Jersey, États-Unis) monté manuellement dessus.
Analyse biochimique des urines
A la fin des périodes de traitement respectives, les animaux ont été logés individuellement dans des cages métaboliques, et des échantillons d'urine de 24h (acidifiée et non acidifiée) ont été collectés. L'urine a été acidifiée avec 1 ml de HCL 6N (acide chlorhydrique) et stockée à 4 degrés pendant 5 jours. Ensuite, ceux-ci ont été centrifugés à 3000 rpm pendant 10 min (REMI, R24), et le surnageant d'urine acidifiée a été utilisé pour estimer les excrétions telles que les teneurs en oxalate, calcium, magnésium et phosphate. Dans les échantillons d'urine non acidifiés, tels que le citrate, la créatinine et l'acide urique, et les concentrations totales de protéines ont été analysées à l'aide de kits de diagnostic disponibles dans le commerce par l'analyseur de chimie clinique automatisé. Les concentrations d'oxalate et de citrate ont été analysées à l'aide d'un spectrophotomètre multipuits (lecteur ELISA) conformément au manuel fourni avec les kits. Aux fins de quantification, une courbe d'étalonnage a été préparée en utilisant les kits Oxalate et Citrate comme standard.
Prélèvement et analyse de sérum
Après la fin de la période expérimentale (jour 28), les rats ont été anesthésiés à l'isoflurane et des échantillons de sang de 3 ml ont été prélevés de la veine rétro-orbitaire par ponction capillaire. Le sérum a été séparé après centrifugation à 3000 tr/min, 20 degrés pendant 15 min. Le sérum collecté a été étudié pour des paramètres biochimiques tels que la créatinine, l'azote uréique du sang, l'acide urique, l'urée, le calcium, le magnésium et le phosphate par l'analyseur automatique de chimie clinique (analyseur Cobas 6000, Allemagne) avec les kits de diagnostic respectifs. Les concentrations d'oxalate et de citrate multi-puits déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre (lecteur ELISA) selon le manuel fourni avec les kits. Aux fins de quantification, une courbe d'étalonnage a été préparée en utilisant les kits Oxalate et Citrate comme standard.
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Analyse de l'homogénat de rein
A la fin de la période expérimentale (jour 28), les rats ont été sacrifiés sous anesthésie à l'isoflurane, suivie d'une dislocation cervicale. Ensuite, l'abdomen a été ouvert et les deux reins prélevés sur chaque rat. Les reins isolés ont été soigneusement retirés et nettoyés (lavés/rincés) des tissus étrangers avec une solution saline physiologique glacée (0.15 M NaCl). Les reins gauches de chaque animal ont été conservés dans du formol neutre tamponné à 10 % et utilisés pour des études histologiques. Les reins droits ont été coupés en deux moitiés égales à l'aide d'une lame et une moitié séchée à 80 degrés dans un four à air chaud. La méthode utilisée était similaire à Ashok et al. [35] avec quelques modifications, dans lequel un poids fixe de 200 mg (29 pour cent) du poids moyen total du rein (0,67 g) a été encore chauffé séparément dans 10 ml d'acide chlorhydrique 1N (1 pour cent HCl), qui a été placé dans un bain d'eau bouillante à 100 degrés C pendant 30 min. Ensuite, il a été finement coupé en morceaux à l'aide d'une lame, écrasé par un pilon et un mortier, et encore homogénéisé pendant 10 min à l'aide d'Ultra-Sonicator. L'homogénat a été centrifugé à 3000 tr/min pendant 15 minutes et le surnageant a été récupéré à l'aide de cryotubes marqués. Enfin, les surnageants ont été utilisés pour les estimations des teneurs en calcium, oxalate et phosphate avec des kits biochimiques disponibles dans le commerce (BioVision PLC, USA), selon le protocole du fabricant [54,55].
Examens histopathologiques
Des examens histopathologiques ont été effectués pour les tissus rénaux des rats expérimentaux. Tous les rats ont été sacrifiés sans cruauté sous anesthésie à l'isoflurane à la fin du 28e jour (études curatives de la lithiase urinaire). Les morceaux de tissu ont été prélevés sur les reins et analysés pour les potentiels curatifs urolithiatiques des extraits de plantes. Les tissus ont été fixés par une solution de formol neutre tamponnée à 10 %, puis inclus dans de la cire de paraffine. Les sections (5 μm d'épaisseur) ont été coupées à l'aide d'un microtome rotatif 4060E (Allemagne), montées sur des lames de verre et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour étudier les changements histopathologiques [34]. Tous les champs de la morphologie des tissus ont été examinés au microscope optique (grossissement 100x) (Wagtech Thatcham, Berkshire, RG19 4QD, Royaume-Uni), et les photomicrographies ont été capturées à l'aide d'un appareil photo numérique monté manuellement (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP avec zoom optique 3x, New Jersey, États-Unis) pour plus de références.
Dépôts de cristaux d'oxalate de calcium
Dans les reins, les dépôts de cristaux ont été déterminés à l'aide de dosages semi-quantitatifs, qui est une méthode de notation microscopique [46, 56]. Le micromètre à filaire du microscope (0.1 mm)oculaire (10x, champ large de 23,3 mm, Olympus Optics OSM 212422, fabriqué au Japon) a été utilisé. C'est-à-dire que les dépôts de cristaux dans les tissus rénaux ont été comptés à l'aide d'un microscope optique. Les degrés de gravité des dépôts de cristaux ont été attribués comme 0=<1 crystal(no="" crystal="" deposition),1="1-10,2=11-30," 3="31-50," 4="51-75" and="" 5="">75 comptes de cristaux, en prenant les valeurs moyennes [46].
Lors du comptage des dépôts de cristaux de CaOx, une section sagittale de chaque échantillon rénal a été divisée en quatre régions de taille égale par deux lignes virtuelles, et des lectures d'une moyenne de 4 champs microscopiques ont été rapportées [57, 58]. Un champ de 100x a ensuite été aléatoirement sélectionnés dans chaque région et les gisements de CaOx ont été comptés. L'image de l'une des quatre régions sous un microscope optique a été capturée au hasard [58] à l'aide d'un appareil photo numérique monté manuellement sur le microscope.
analyses statistiques
Les données ont été analysées à l'aide du logiciel Graph Pad Prism version 6 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie de comparaisons de test de Dunnett post-hoc a été effectuée lorsque cela était nécessaire pour comparer les groupes traités et non traités. Les valeurs des données ont été exprimées en moyenne ± écart-type (SD). Valeurs de P<0.05 was="" considered="" statistically="">
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