Tuliposides H – J et composants bioactifs du bulbe d'Amana Edulis
Mar 20, 2023
Abstrait:
Trois nouveaux côtés de tulipe H–J (1–3) et 11 composés connus ont été obtenus à partir des extraits méthanoliques des bulbes d'Amana edulis pour la première fois. Leurs structures ont été élucidées par les données spectroscopiques RMN, MS et IR, la rotation optique et la méthode de Mosher. Les propriétés de mélanogénèse de tous les isolats ont été évaluées dans des cellules de mélanome B16. Par conséquent, le citrate de tributyle (9) avait une activité anti-mélanogénèse mais était cytotoxique vis-à-vis de B16. ( plus )-acide pyroglutamique (4), ( plus )-butyl 5-oxo pyrrolidine-2-carboxylate (6), (–)-3-hydroxy-2-méthyl butyrolactone (10 ) et le 5- (hydroxyméthyl)furfural (12) ont augmenté la production de mélanine et les activités de la tyrosinase. Ces composants actifs pourraient être étudiés plus avant en tant que candidats contre le mélanome et le vitiligo pour les maladies de la peau ou le blanchiment/l'hypopigmentation des cheveux.
Dans la recherche sur le blanchiment, nous avons constaté que Cistanche a également un effet blanchissant
Tout d'abord, Cistanche est riche en polysaccharides et en flavonoïdes. Ces composés agissent comme des antioxydants et peuvent aider le corps à piéger les radicaux libres, ralentissant le vieillissement de la peau et améliorant ainsi le teint.
Deuxièmement, Cistanche contient également une variété d'acides aminés, de minéraux et de vitamines, qui sont très bénéfiques pour la réparation et la régénération de la peau. Cistanche peut favoriser le métabolisme des cellules de la peau, améliorer la capacité d'auto-réparation de la peau et redonner à la peau une couleur saine.
Enfin, Cistanche contient également des acides organiques et des substances alcalines, et ces ingrédients ont également un certain effet sur le conditionnement et le métabolisme des cuticules de la peau. Ces substances peuvent équilibrer efficacement le pH de la peau, améliorer l'épaisseur de la couche cornée et rendre la peau plus translucide et délicate.
1. Introduction
Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker appartient à la famille des Liliacées et est une plante médicinale populaire utilisée pour traiter les maladies cancéreuses [1,2]. Cependant, peu d'études phytochimiques et biologiques de cette espèce ont été rapportées à ce jour.
Par exemple, des extraits d'EtOH à 95 % et 50 % pourraient induire l'apoptose dans les cellules de carcinome humain gastrique (SGC7901) [1] et hépatome (BEL7404, HepG2 et Huh7) [2], respectivement. Les polysaccharides préparés à partir d'A. edulis ont des propriétés anti-oxydantes, notamment DPPH, OH− et ABTS plus des activités de piégeage [3–5]. Dans la recherche de nouveaux agents issus de produits naturels pour les troubles cutanés, nous avons constaté que les extraits de MeOH des bulbes d'A. edulis présentent un potentiel de régulation de la mélanogénèse qui n'a pas encore été exploré. Lorsqu'elle est exposée au rayonnement ultraviolet de la lumière solaire ou à des produits chimiques nocifs et à des facteurs pathogènes, la mélanogenèse modérée peut protéger notre peau de la génération d'espèces réactives de l'oxygène dans les kératinocytes et les mélanocytes [6]. La tyrosinase est une enzyme importante dans la mélanogenèse pour produire plus de mélanine pour nous défendre contre les conditions dangereuses susmentionnées [7].
Par conséquent, les composants actifs d'A. edulis méritent d'être autorisés pour d'autres applications médicales. Dans cette enquête, trois nouveaux côtés de tulipe H – J (1–3) et 11 composés connus (4–14) (Figure 1) ont été isolés de A. edulis et identifiés structurellement par RMN, MS et données spectroscopiques IR, rotation optique , ou réaction d'ester de Mosher. Le composé 9 pourrait diminuer la teneur en mélanine mais être cytotoxique envers les cellules de mélanome B16. Les composés 4, 6, 10 et 12 ont augmenté la production de mélanine et les activités tyrosinase. Dans l'ensemble, ces travaux ont prouvé qu'A. edulis et ses composants actifs pouvaient être de nouveaux agents pour les maladies liées à la mélanine, telles que le mélanome et l'hypopigmentation (vitiligo cutané ou blanchiment des cheveux).
2. Résultats et discussion
2.1. Élucidations de la structure des isolats 1 à 3
L'extrait de MeOH (TEM) des bulbes d'A. edulis a été divisé en fractions EtOAc-soluble (TEE), n-BuOH-soluble (TEB) et HO-soluble (TEW) fractions séparément. La fraction. l'action des extraits de TEE et de TEB a donné de nouveaux glycosides isoprénoïdes 1-3 et des composés connus 4-14 (Figure 1). De plus, les principaux composants de l'extrait de TEW étaient des glucides.
Le HRESIMS (spectrométrie de masse à ionisation par électrospray haute résolution) de 1 a montré un ion (M - H- à m/z 351,1652, indiquant une formule moléculaire de CsH2gOg (calculée pour C;5HoOg; 351,1655) et deux degrés d'insaturation. Le spectre IR ont montré des absorptions pour les fonctionnalités hydroxyle (3376 cm-l) et carbonyle (1725 cm-l) Quinze signaux de carbone, dont deux méthyles, cinq méthylènes, sept méthines et un carbone quaternaire, ont été observés dans la RMN unidimensionnelle (1D) spectres de 1 (tableau 1). Le carbone quaternaire a été identifié comme un carbone carbonyle basé sur le déplacement chimique 6c 176,6. Les spectres RMN 1D et HSOC (cohérence quantique unique hétéronucléaire) affichaient un anomérique (0/8c : 4,27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4,9), cinq oxymétholone (0h/8c : 3,21(t, J { {34}}.0 Hz)/75,1, 3,28 (chevauchement)/71,6, 3,28 (chevauchement)/78.0, 3,35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 et 3,89 (td, I=7.0, 2,5 Hz)/73,6) et trois oxyméthylène (6,/6c : 3,57 (dd, J {{64} }.5, 7.0 Hz)4.01 (jj, je {{70}}.5, 2,5 Hz)/73,1, 3,66 (jj, je { {78}}.0, 5,0 Hz), 3,85 (brd, I=12.0 Hz)/62,7 et 4,10 (2H, t, J=7.5 Hz)/65,5). Les corrélations HMBC (corrélation de liaisons multiples hétéronucléaires) (Figure 2) du composé 1 au niveau des protons méthine H-2 (8 2.67, quint avec C-1 (6 176. 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) avec C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) avec C-4, et les protons de méthyle H-5 (8 1.14 , d) avec C-1/C-2/C-3 a suggéré que les fragments méthyle et hydroxyle étaient positionnés respectivement en C-2 et C-3 les protons de méthylène à H,-1" (8 4.10, t) et H-4 (6 3.57dd ; 4.01, dd) ont présenté 3 interactions avec C{{ 142}} et C-1' (8 104.9), respectivement, dans le spectre HMBC (Figure 2) prenant en charge les affectations du groupe n-butyle à C-1 et un bêta -glucose (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) à C-4 8].
La figure 2 montre les principales corrélations COSY et HMBC observées pour 1. Les configurations relatives à C-2 et C-3 (3-hydroxy-2-moitié méthyle) de 1 pourraient être déterminées anti -forme par la valeur 3 JH2-H3 de 7.0 Hz (anti-forme : 7.0 Hz ; forme syn : 4.0 Hz) [ 9]. Pour déterminer la configuration absolue, le composé 1 a été traité séparément avec du chlorure de (R)- et (S)- -méthoxy- -(trifluorométhyl)-phénylacétyle [(R)- et (S)-MTPA- Cl] en présence de pyridine-d5 pour obtenir les esters (S)- et (R)-MTPA (1a et 1b), respectivement. Les esters de MTPA ont été générés avec succès à C-3 et C-20/C-30/C-40, comme le montrent les analyses RMN 1H et 1H-1H COSY spectres (1a, H-3, δ 5,82, m ; H-20 , δ 5,70, t, J=9,5 Hz ; H-30 , δ 4,39, t, J=9,5 Hz ; H-40 , δ 5,76, t, J=9,5 Hz ; 1b, H-3, δ 5,81, m ; H{{64 }} , δ 5,56, t, J=9,5 Hz ; H-30 , δ 4,12, t, J=9,5 Hz ; H-40 , δ 5,66, t, J=9.5 Hz). Les différences entre les déplacements chimiques RMN 1H pour 1a et 1b (valeurs ∆ indiquées sur la figure 3) ont conduit à l'attribution des configurations S et R à C-3 et C-2, respectivement. Par conséquent, le composé 1 a été élucidé sous forme de butyl 4- -D-glucopyranose-(S)-3-hydroxy-(R)-2-butanoate de méthyle et nommé côté tulipe H.
Le composé 2, côté tulipe I, a donné la formule moléculaire, C15H28O8, établie par HRESIMS (m/z 359,1686 [M plus Na] plus, calculé pour 359,1682). Les spectres RMN 1D de 2 étaient également similaires à ceux de 1, à l'exception du fait que les déplacements chimiques du signal méthylène δH 1,65 (sext, J=7.0 Hz) et 1,96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34,6 ont été identifiés au lieu d'un méthine à C-3 de 1 (tableau 1). Sur la base des données COSY et HMBC (Figure 2), il a été postulé que le composé 2 était composé d'un isoprénoïde, d'un glucose et des groupes n-butyle également. Les corrélations HMBC 3 J de H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) avec C-1 (δ 178.5) et H-10 (δ 4.19, d, J=8.0 Hz/δC 104.4) avec C-4 (δ 68.4) suggèrent que le groupe n-butyle et un -glucose fraction [8] étaient connectés à C-1 et C-4, respectivement (Figure 2). Les corrélations clés HMBC et COSY sont présentées à la Figure 2. La configuration R de H3-5 à Le C-2 de 2 a été déterminé par hydrolyse acide de 2 pour offrir le composé de tulipaline correspondant, 3-methyldihydrofuran-2(3H)-one (Figure S28) [8] avec une rotation optique positive valeur ([ ] 23 D plus 18,7, CH2Cl2) (R : [ ] 25 D plus 14,7, CHCl3) [10]. La structure du composé 2 a été identifiée comme butyl 4- -D-glucopyranose-(R){{ 81}}butanoate de méthyle.
La formule moléculaire de 3 a été déduite comme C11H20O8 en raison de l'apparition d'un ion [M plus Na] plus à m/z 303,1049 (calculé pour 303,1050) dans le HRESIMS. Onze signaux carbonés, dont un méthyle (δ 17,6), trois méthylènes (δ 34,7, 62,8 et 68,6), six méthines (δ 37,6, 71,6, 75,1, 77,9, 78,0 et 104,4) et un carbone quaternaire (δ 180,6) , ont été observées dans les spectres RMN 1D de 3 (tableau 1). Le carbone quaternaire a été identifié comme un carbone carbonyle sur la base du déplacement chimique du carbone à δ 180,6. De plus, le composé 3 a montré des données spectroscopiques similaires à celles du 2, à l'exception des signaux de n-butyle. Dans le spectre HMBC (Figure S15), le proton anomérique à δ 4,23 (d, J=8.0 Hz) présentait une interaction de 3 J avec C-4 (δ 68,6) conduisant au -glucose situé à C-4. Les connexions clés HMBC et COSY sont illustrées à la figure 2. Le composé 3 n'a pas été isolé en quantité suffisante pour déterminer la configuration absolue en C-2. Enfin, le côté tulipe J (3), l'acide 4- -D-glucopyranose-(R)-2-méthyl butanoïque, a été identifié en raison des élucidations structurelles susmentionnées de 1 et 2 dans cette étude.
Les composés 1 à 3 sont des côtés de tulipe, une sorte de produit spécialisé composé d'4-hydroxy2-acide méthylène butanoïque (HMBA) et/ou (3S)-3,4-dihydroxy Groupes -2-acide méthylène butanoïque (DHMBA) acylés aux positions C-1 et/ou C-6 d'un -D-glucose (Glc) que l'on trouve principalement dans le genre Tulipa [8,11] . Jusqu'à présent, les analogues du côté tulipe, y compris le 1-côté tulipe A, le 6-côté tulipe A, le 1-côté tulipe B, le 6-côté tulipe B et les côtés tulipe D–G , ont été isolés de Tulipa [8,11]. Cependant, la structure du côté C de la tulipe n'a pas été rapportée et pourrait être absente de la littérature précédente [11]. Les tulipalines, telles que la tulipaline A et la (–)-tulipaline B, sont les parties aglycones des côtés de la tulipe, qui lactones spontanément après avoir libéré des groupes HMBA et/ou DHMBA par les enzymes de conversion du côté de la tulipe [8,11]. Dans cette étude, les composés 1 à 3 nommés côtés tulipe H – J appartiennent aux côtés tulipe, mais leurs doubles liaisons en C-2 ont été réduites et les groupes -D-glucose ont été attachés à C-4 (oxyméthylène ), au lieu de C-1 (fonctionnalité O-acyle) dans HMBA ou DHMBA (Figure 1). De plus, le composé 10 (2S, 3S) est la tulipaline mais n'a pas pu être métabolisé à partir de 1 (2R, 3S) en raison des différentes configurations en C-2. Les biosynthèses possibles des côtés 1 à 3 de la tulipe sont illustrées à la figure S29 [8,11].
En outre, 11 composés connus, dont trois analogues d'acide pyroglutamique (4–6), trois dérivés d'acide citrique (7–9), deux furanone (10–11), un furane (12) et deux stéroïdes (13–14) ont été isolé d'A. edulis pour la première fois. Les composés 1–9 et 10–14 ont été obtenus à partir des fractions brutes TEB et TEE, respectivement. Ils ont été identifiés comme étant l'acide (plus)-pyroglutamique (4) [12], (plus)-méthyl 5-oxo pyrrolidine-2-carboxylate (5) [12], ( plus )-butyl {{23 }}oxo pyrrolidine-2-carboxylate (6) [12], 1-citrate de butyle (7) [13], 1,10 -dibutyl 5-citrate de méthyle (8) [ 13], citrate de tributyle (9) [13], (–)-3-hydroxy-2-méthyl butyrolactone (10) [14–16], (–)- méthyl 3-hydroxy{{ 44}}oxotétrahydrofurane-3-carboxylate (11) [17], 5-(hydroxyméthyl)furfural (12) [18], sitostérol (13) [19] et sitostérol-3- -D -glucose (14) [20] à partir des données spectroscopiques et comparées à la littérature.
2.2. Élucidation des composants chimiques de TEW
Les spectres RMN 1H et 13C de TEW, une fraction brute soluble dans l'eau de l'extrait TEM, se sont révélés très similaires à ceux des glucides (figures S16 et S17). Il a été rapporté que les polysaccharides préparés à partir de cette espèce possèdent du rhamnose, du xylose, de l'arabinose, du galactose, du mannose, du glucose et du fructose après analyse des monosaccharides [3,8]. Les données spectroscopiques RMN et le facteur de rétention TLC (chromatographie en couche mince) de TEW par rapport à ceux des étalons de sucre (figures S18 à S23) ont suggéré que le D-glucose et le D-fructose étaient les principaux composants des extraits de TEW.
2.3. Effets des extraits et des isolats sur la mélanogénèse
L'extrait de MeOH (TEM) de cette espèce a été séparé en fractions brutes TEE, TEB et TEW, et les quatre extraits susmentionnés ont été évalués pour les effets de cytotoxicité et de mélanogénèse dans les cellules de mélanome B16 à des concentrations de 12,5 à 200 µg/mL (Figure S24) . TEE a montré une cytotoxicité évidente envers B16 à 200 µg/mL et TEB ainsi que TEW avaient des activités cytotoxiques à des concentrations de 12,5 à 200 µg/mL (Figure S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). Dans le test biologique, l'hormone stimulant les mélanocytes (-MSH) a été utilisée pour activer les cellules B16 afin de synthétiser plus de mélanine, et la TEM pourrait stimuler modérément la mélanogenèse (Figure S24A-2).
La plupart de tous les isolats (figure 1), à l'exception de 13 et 14, ont été testés plus avant pour la régulation des effets de la mélanogénèse à des concentrations de 10 à 40 µM, avec de l'arbutine utilisée comme contrôle positif (figure 4). Comme le montre la figure 4, le composé 9 a inhibé de manière évidente et dose-dépendante la production de mélanine résultant de la cytotoxicité envers les cellules B16 avec une valeur IC50 (concentration inhibitrice demi-maximale) de 81,9 µM (Figure S25). Les isolats 4, 6, 10 et 12 ont augmenté la teneur en mélanine en fonction de la dose jusqu'aux pourcentages maximaux de 11,9 %, 29,8 %, 27,2 % et 17,6 %, respectivement, à 40 µM sans toxicité cellulaire. La tyrosinase joue un rôle clé dans les deux premières étapes de la mélanogénèse [6] ; par conséquent, les effets des composés 4, 6, 10 et 12 sur la tyrosinase intracellulaire ont été davantage évalués. -MSH a augmenté l'activité de la tyrosinase jusqu'à 254,3-305,5 % par rapport au groupe témoin (100 %) (Figure 5 et Tableau S1).
Par conséquent, 4 (14,1–21,9 pour cent), 6 (15,8–21,9 pour cent), 10 (8,5–13,1 pour cent) et 12 (7,5–11,8 pour cent) ont modérément augmenté l'activité de l'enzyme, la tyrosinase, de manière dose-dépendante. à des concentrations de 10 à 40 µM, par rapport au groupe -MSH (Figure 5 et Tableau S1). Un graphique de corrélation entre la teneur en mélanine cellulaire et les effets sur la tyrosinase des composés 4, 6, 10 et 12 est illustré à la figure S26. De plus, pour confirmer les effets induisant la mélanogénèse de 4, 6, 10 et 12, chaque composé a été ajouté dans des cellules B16 sans -MSH co-traité qui a été utilisé comme contrôle positif dans ce test (Figure S27). Par conséquent, les individus 4, 6, 10 et 12 n'ont pas augmenté la production de mélanine seule (Figure S27) comme ceux illustrés à la Figure 4. Il a été suggéré que les quatre composés susmentionnés pourraient simplement améliorer les effets de mélanogénèse de -MSH. En conséquence, des voies de signalisation supplémentaires dans la mélanogenèse, telles que la protéine liée à la tyrosinase -1 (TRP-1), la TRP -2, le facteur de transcription associé à la microphtalmie, le récepteur de la mélanocortine 1, l'adénosine monophosphate cyclique, la protéine kinase A, cAMPresponse element-binding protein, c-Jun N-terminal kinases, extracellular signal-regulated kinase, p38 et phosphoinositide 3-kinase/protéine kinase B [7,21], doivent être testés plus avant et confirmés pour ces composants actifs.
3. Matériels et méthodes
3.1. Procédures expérimentales générales
Les spectres RMN ont été mesurés sur un instrument Bruker Avance Ill 500 MHz (BrukerBillerica, Amérique) pour 1H et 125 MHz pour 13C-NMR. Les valeurs de déplacement chimique (0) étaient en ppm et les constantes de couplage () étaient en Hz avec CD ; OD, CDC1 et/ou D, O ont été utilisés comme solvants. Les rotations optiques ont été obtenues sur un polarimètre JASCO-P-2000 (JASCO, TokyoJapan) (longueur de cellule 10 mm). Les spectres IR ont été enregistrés sur un spectromètre PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Spectrométrie de masse à ionisation basse et haute résolution ESIMSelectrospray) ont été mesurés sur un spectromètre de masse à piège ultra haute capacité Bruker Daltonics EsquireHCT et un spectromètre de masse Orbitrap (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific), respectivement. La CCM a été réalisée sur Kieselgel60 F254 (0,25 mm ; Merck) et/ou RP-18 F254S (0,25 mm ; Merck), plaques enduites puis colorées par pulvérisation avec 5 % (o/u) de soufre acide dans une solution de MeOH et chauffage sur une plaque chauffante. Gel de silice (Silicycle : 70 230 et 230 400 mesh), RP-18 (LiChroprepe 4063 um : Merck. Sephadexn C20 CE épisode 0 pe ouvert w Bre appliqué foSupelcoTM, Bellefonte) et MCI CHP20P (Chromatographie sur colonne SupelcoT. Une pompe Shimadzu LC-20AT et un Shimadzu RID-10Un détecteur d'indice de réfraction (Shimadzu Inc, Kyoto, Japon), ainsi qu'un Cosmosil 5C18-MS-II ( Une colonne de 250 x 10 mm de diamètre intérieur, 5 um) à un débit de 2,0 mL/min a été utilisée pour la HPLC. Des réactifs à base de sucre, notamment du D-glucose (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, France) et du D-fructose (TCI, Tokyoapan) ont été utilisés. utilisé pour l'analyse de la fraction brute soluble dans l'eau (TEW).
3.2. Matériel végétal
Des bulbes secs d'A. edulis (anciennement T. edulis) ont été achetés dans une pharmacie de médecine traditionnelle chinoise à Taichung, Taiwan, en septembre 2018 et identifiés par l'auteur, le professeur Chang. Un spécimen de référence (TE201809) a été déposé au Chinese Medicine Research and Development Center, CMUH Taiwan.
3.3. Extraction et isolement
Les bulbes d'A. edulis (5,0 kg) ont été extraits huit fois avec du MeOH (8,0 L chacun) à température ambiante pour obtenir un extrait brut. L'extrait de MeOH (TEM, 525.0 g) a été partagé trois fois entre l'acétate d'éthyle (EtOAc) et H2O (1500 :1500, v/v) pour donner un EtOAc -fraction soluble (TEE, 45,0 g) et une phase aqueuse, qui a ensuite été partagée avec n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3), puis séparée en n-BuOH soluble (TEB, 53,6 g ) et fractions solubles dans H2O (TEW, 410,0 g).
Le TEE a été soumis à une chromatographie sur colonne ouverte sur un gel de silice ({{0}}.063–0.200 mm, colonne : 7 × 26 cm, diamètre × longueur), en utilisant des gradients d'hexane–EtOAc–MeOH (3{{20}} :1 :0 ; 1 :1 :0 ; { {67}} :0 : 1, v/v/v) et a donné 14 sous-fractions (TEE1–TEE14). Le précipité 14 (249,0 mg ; rendement d'isolement : 0.{{100}}0498 %) obtenu à partir de la sous-fraction TEE12 (2,2 g) a été filtré et lavé avec du MeOH. TEE9 (3,6 g) a été fractionné en sept sous-fractions (TEE9-1 à 9-7) par du gel de silice (colonne : 5 × 24 cm ; CH2Cl2–MeOH, 7 : 1 ; 1 : 1 ; 0 : 1 , v/v), avec la sous-fraction TEE9-4 (1,1 g), puis soumis à une chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 (colonne : 5 × 54 cm ; CH2Cl2–MeOH, 1:1 à 0 : 1, v/v), pour donner sept sous-fractions (TEE9-4-1 à 9-4-7). TEE9- 4-5 et TEE9-4-6 ont été combinés (total 551,7 mg) et purifiés à plusieurs reprises par RP-HPLC (MeOH–H2O, 45 :55 ; 20 :80, v/v) pour donner 12 (21,0 mg ; tR=13 min ; rendement d'isolement : 0,00042 %) et une liqueur mère (131,2 mg), qui a ensuite été soumise à une RP-HPLC (MeOH–H2O ; 10:90, v/v) pour donner les composés 10 ( 35,5 mg ; tR=13 min ; rendement d'isolement : 0,00071 %) et 11 (1,2 mg ; tR=15 min ; rendement d'isolement : 0,000024 %). La fraction TEE6 (2,7 g) a été isolée par Sephadex LH-20 (colonne : 2,5 × 45 cm ; CH2Cl2–MeOH, 1:1 ; 0:1, v/v) pour obtenir 13 (6,8 mg ; rendement d'isolement : 0,000136 %).
Le TEB a été chromatographié sur une colonne Diaion HP{{0}} (6 × 60 cm ; H2O–MeOH– acétone, 100 :{{15} } :0 ; 25:75 :0 ; 50:5{{20}} :0 ; 75:25 :{{41 }} ; 0 :10{{70}} :{{90}} ; {{1{{105} }0}} :0 :100, v/v/v) pour donner six sous-fractions (TEB1–TEB6). La sous-fraction TEB5 (502.0 mg) a été purifiée par RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) pour obtenir les composés 8 (9,3 mg ; tR {{34} } min ; rendement d'isolement : 0.000186 %) et 9 (144,2 mg ; tR {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} min ; rendement d'isolement : 0,002884 %). La fraction TEB3 (5,5 g) a été soumise à une chromatographie RP-18 (colonne : 7 × 25 cm ; MeOH–H2O, 1:1 ; 1:0, v/v) et la sous-fraction TEB3-6 ( 1,0 g) a ensuite été isolé par Sephadex LH-20 (colonne : 5 × 54 cm ; MeOH) pour obtenir sept sous-fractions (TEB3-6-1 à 3-6-7). Le TEB3-6-4 (377,1 mg) a été séparé par chromatographie sur gel MCI (colonne : 2,5 × 23 cm ; H2O–MeOH, 100 :0 ; 80 :20 ; 60 :40 ; 40 :60 ; 20 :80 ; 0 : 100, v/v) pour donner sept sous-fractions (TEB3-6-4-1 à 3-6-4-7). Le TEB3-6-4-4 (38,1 mg) a été purifié par RP-HPLC (MeOH-H2O, 45 :55 dans de l'acide formique à 0,1 %, v/v) pour donner 1 pur (12,2 mg ; tR=17 min ; rendement d'isolement : 0,000244 %). De plus, TEB 3-6-4-6 (31,0 mg) a été réalisée avec RP-HPLC (MeOH – H2O, 40:60 dans 0,1 % d'acide formique, v/v) pour donner 6 (7,1 mg ; tR=28 min ; rendement d'isolement : 0,000142 %). Le TEB3-6-5 (410,7 mg) a été isolé par chromatographie sur gel MCI (colonne : 2,5 × 23 cm ; H2O–MeOH, 100 :0 ; 80 :20 ; 60 :40 ; 50 :50 ; 40 :60 ; 30 : 70 ; 20:80 ; 0:100, v/v) pour donner huit sous-fractions (TEB3-6-5-1 à 3-6-5-8). La TEB3-6-5-3 (75,1 mg) a été purifiée par chromatographie sur gel MCI (colonne : 1 × 20 cm ; H2O–MeOH, 80 :20 ; 70 :30 ; 0 :100, v/v) pour donner les composés 4 (59,3 mg ; rendement d'isolement : 0,001186 %) et 5 (10,2 mg ; rendement d'isolement : 0,000204 %). La sous-fraction TEB3-6-5-4 (97,0 mg) a été purifiée par RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 dans de l'acide formique à 0,1 %, v/v) pour obtenir 7 (46,4 mg ; tR=18 min ; rendement d'isolement : 0,000928 %). Le TEB3-10 (925,4 mg) a été chromatographié sur une chromatographie sur gel MCI (colonne : 2,5 × 28 cm ; H2O–MeOH, 100 :0 ; 80 :20 ; 60 :40 ; 50 :50 ; 40 :60 ; 30 :70 ; 10 :90 ; 0 :100, v/v) pour donner huit sous-fractions (TEB3-10-1 à 3-10-8) et 2 pures (393,4 mg ; rendement d'isolement : 0,007868 %). Le composé 3 (6,3 mg ; tR=8 min ; rendement d'isolement : 0,000126 %) a été obtenu à partir de TEB3-10-2 (20,9 mg) par purification par RP-HPLC (MeOH-H2O, 30:70 dans 0,1 % de formique acide, v/v).
3.3.1. Tuliposide H (1)
[ ] 23 D -23,1 (c 0.12, MeOH) ; IR (pur) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, 1041 (C–O– C), 926, 900, 632, 521 cm-1 ; Données spectroscopiques RMN 1H et 13C, voir tableau 1 ; HRESIMS m/z 351,1652 [M - H] - (calculé pour C15H27O9, 351,1655).
3.3.2. Tuliposide I (2)
[ ] 23 D -25,8 (c 0.2, MeOH) ; IR (pur) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1077, 1036 (C–O– C), 897, 736, 625, 517 cm-1 ; Données spectroscopiques RMN 1H et 13C, voir tableau 1 ; HRESIMS m/z 359,1686 [M plus Na] plus (calculé pour C15H28O8Na, 359,1682).
3.3.3. Tuliposide J (3)
[ ] 23 D plus 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (pur) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1182, 1120 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm-1 ; Données spectroscopiques RMN 1H et 13C, voir tableau 1 ; HRESIMS m/z 303,1049 [M plus Na] plus (calculé pour C11H2008Na, 303,1050).
3.4. (R)- et (S)-MTPA Dérivés de 1
La préparation du dérivé ester de (S)-MTPA de 1 a été réalisée par une procédure d'ester de Mosher pratique [22, 23]. Le composé 1 (3,4 mg, 0.01 mmole) a été transféré dans un tube RMN propre puis séché complètement sous vide avant d'être rempli d'azote. De plus, le C5D5N ({{20}}.5 mL) et le chlorure de (R)-(−)- -méthoxy- -(trifluorométhyl)-phényl-acétyle (chlorure de MTPA, 12,2 mg, 0,05 mmole) ont été ajoutés immédiatement dans le tube RMN scellé qui a ensuite été agité avec précaution pour mélanger l'échantillon et le chlorure de MTPA. Les spectres 1H RMN et 1H-1H COSY du mélange après 24 h de réaction à température ambiante ont été enregistrés. L'ester de (R)-MTPA de 1 a également été préparé de manière similaire par le procédé mentionné ci-dessus. Composé 1 : RMN 1H (C5D5N, 500 MHz) δ 0,78 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,28 (H3-5, d), 1,52 ( H-200, quint), 3,08 (H-2, quint), 3,95 (H-50, m), 4,03 (H-4a, dd), 4,05 (H -20, chevauchement), 4,15 (H-100, t), 4,23 (H-30, chevauchement), 4,23 (H-40, chevauchement), 4,36 (H{{ 68}}a, dd), 4,39 (H-3, chevauchement), 4,43 (H-4b, dd), 4,53 (H-60b, d) et 4,95 (H -10, d).
3.4.1. (S)-MTPA Ester de 1 (1a)
RMN 1H (C5D5N, 500 MHz) δ 0,77 (H-400, t), 1,17 (H-300, sext), 1,21 (H3-5, d) , 1,37 (H-200, quint), 3,18 (H-2, quint), 3,92 (H-100, t), 3,97 (H-4a, dd), 4,33 (H-50 , m), 4,39 (H-30 , t), 4,49 (H-4b, brd), 4,64 (H-60a, dd), 4,96 (H-10 , d), 5,05 (H-60b, d), 5,70 (H-20 , t), 5,76 (H-40 , t) et 5,82 (H-3, m).
3.4.2. (R)-MTPA Ester de 1 (1b)
RMN 1H (C5D5N, 500 MHz) δ 0,79 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,30 (H3-5, d) , 1,50 (H-200, quint), 3,33 (H-2, quint), 3,60 (H-50 , m), 3,94 (H-4a, dd), 4.11 (H-100, t), 4.12 (H-30 , t), 4.13 (H-60a, dd), 4.50 (H-4b, brd), 4,70 (H-10 , d), 4,85 (H-60b, d), 5,56 (H-20 , t), 5,66 (H-40 , t) et 5,81 (H-3, m).
3.5. Hydrolyse acide du Tuliposide I (2)
L'isolat 2 (78,6 mg) a été hydrolysé dans du HCl 1 M (1,5 mL) à 100 ◦C pendant 2 h [8]. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été extrait avec du CH2Cl2 (2,0 mL × 3) pour offrir l'analogue de la tulipaline, le 3-méthyldihydrofurane-2(3H)-one (11,1 mg). [ ] 23 D plus 18,7 (c 1,1, CH2Cl2); RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 1,30 (3H, d, J=7.0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (Figure S28) ; ESIMS m/z 101,06 [M plus H] plus .
3.6. Culture de cellules
Les cellules de mélanome murin B16 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; GIBCO Invitrogen corporation, New York, NY, États-Unis) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine à 37 heures. ◦C dans un incubateur à 5 % de CO2.
3.7. Mesure de la viabilité des cellules B16
La cytotoxicité des cellules B16 pour les composés testés a été mesurée par MTT avec un protocole décrit précédemment avec de légères modifications [6]. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96-puits (1 × 103 cellules/puits) et cultivées pendant 24 h avant d'être traitées avec des composés pendant 72 h supplémentaires. Après cela, le milieu a été retiré, 100 µL de réactif MTT (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (à la concentration finale de 0,5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits puis incubés à 37 ◦C pendant 1 h. Le cristal de formazan a été dissous dans 100 µL de DMSO et la densité optique a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Allemagne) à 570 nm.
3.8. Mesure de la teneur en mélanine dans les cellules B16
La teneur en mélanine des cellules B16 a été dosée selon une méthode précédemment décrite avec de légères modifications [6]. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5 × 103 cellules/puits dans des plaques 24-puits pendant 24 h. Le milieu a été remplacé par un milieu de culture frais de 500 µL contenant 0,5 µM -MSH avec ou sans composés pendant 72 h. L'arbutine (1 mM) a été utilisée comme contrôle positif. Après cela, le milieu a été retiré et lavé avec du PBS (pH 6,8) deux fois. Les cellules ont été récoltées par NaOH (200 µL, 2 N) puis chauffées à 85 ◦C pendant 30 min. Après refroidissement à température ambiante et centrifugation, l'absorbance a été mesurée à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
3.9. Activité tyrosinase intracellulaire
Le dosage de l'activité de la tyrosinase intracellulaire a été effectué par une méthode légèrement modifiée, qui a été rapportée précédemment [6]. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 24-puits à une densité de 5 × 103 cellules/puits pendant 24 h. Les cellules ont été traitées dans du DMEM contenant 0,5 µM de -MSH avec ou sans composés pendant 72 h. Après élimination du milieu, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS froid (pH 6,8). Les cellules ont été lysées avec 100 µL de tampon de lyse (1 % de triton X-100 dans du PBS) et congelées à -80 ◦C pendant 15 min.
Ensuite, les lysats cellulaires ont été centrifugés à 13 200 × g à 4 ◦C pendant 30 min pour obtenir le surnageant. La teneur en protéines totales du surnageant a été quantifiée par dosage des protéines BCA. Ensuite, chaque lysat quantifié (30 µg/90 µL) a été mélangé avec 10 µL de L-DOPA (15 mM) dans une plaque à puits 96- puis incubé à 37 ◦C pendant 1 h, et l'absorbance a été mesurée à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
4. Conclusions
Au total, 14 composés purs, dont trois nouveaux glycosides isoprénoïdes et des côtés de tulipe H – J (1–3), ont été isolés d'A. edulis. Le dérivé d'acide citrique 9, le citrate de tributyle, avait une activité anti-mélanogénèse significative, mais a montré une cytotoxicité envers les cellules de mélanome B16 qui pourraient être étudiées plus avant pour des médicaments anti-mélanome. Alors que les analogues d'acide pyroglutamique 4 et 6, la furanone 10 et le furane 12 avaient une teneur en mélanine accrue en fonction de la dose et une tyrosinase activée qui pourrait être étudiée plus avant pour la maladie cutanée du vitiligo ou des agents anti-blanchiment et anti-hypopigmentation pour les cheveux. Cependant, des mécanismes in vitro et/ou des études in vivo doivent être étudiés plus en détail pour vérifier l'efficacité des composants actifs.
Matériel supplémentaire :
Les éléments suivants sont disponibles en ligne. de TEW, Figure S23 : Analyse TLC de TEW, Figure S24 : Cytotoxicité et régulation des effets de mélanogénèse de TEM, TEE, TEB et TEW, Figure S25 : Données de cytotoxicité des composés 1 à 12, Figure S26 : Un graphique de corrélation entre les teneur en mélanine cellulaire et les effets sur la tyrosinase des composés 4, 6, 10 et 12, Figure S27 : Effets sur la mélanogénèse des composés 4, 6, 10 et 12 seuls sans -MSH, Figure S28 : Données spectrales RMN et rotation optique du produit obtenu à partir de l'hydrolyse acide du composé 2, Figure S29 : Biosynthèse possible des composés 1 à 3, Tableau S1 : Effets de l'activité tyrosinase des composés 4, 6, 10 et 12.
Contributions d'auteur:
Conceptualisation, C.-LL; identification du matériel végétal, Y.-SC; conduite d'isolement et de purification, C.-LL et Z.-AG ; conduite des bioessais, Y.-LJ ; toute analyse spectrale et détermination de structure, C.-LL et C.-JC ; rédaction de l'ébauche originale de préparation, C.-LL Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
Financement:
Cette recherche a été financée par le ministère des Sciences et de la Technologie (MOST 108-2320-B039-035-) et la China Medical University (CMU108-MF-84), à Taïwan. L'APC a été financé par le "Centre de recherche en médecine chinoise, Université médicale de Chine" du programme du centre de recherche sur les zones en vedette dans le cadre du projet de germination de l'enseignement supérieur du ministère de l'Éducation (MOE) de Taïwan (CMRC-CHM{{5} }).
Déclaration du comité d'examen institutionnel :
N'est pas applicable.
Déclaration de consentement éclairé :
N'est pas applicable.
Déclaration de disponibilité des données :
N'est pas applicable.
Remerciements :
Ce travail a été soutenu financièrement par le ministère des Sciences et de la Technologie (MOST 108-2320-B-039-035-) et la China Medical University (CMU108-MF-84), Taiwan, ainsi que le "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" du programme The Featured Areas Research Center dans le cadre du projet Higher Education Sprout du ministère de l'Éducation (MOE) de Taïwan (CMRC-CHM-1) attribué à C .-LL
Les conflits d'intérêts:
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Disponibilité de l'échantillon :
Des échantillons des composés 1 à 14 sont disponibles auprès des auteurs.
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1 Département de cosméceutique, Université médicale de Chine, Taichung 406040, Taïwan.
2 Centre de recherche et de développement en médecine chinoise, Hôpital universitaire médical de Chine, Taichung 40402, Taïwan.
3 Centre de recherche en médecine chinoise, Université médicale de Chine, Taichung 40402, Taïwan.
4 Département des sciences pharmaceutiques chinoises et des ressources de médecine chinoise, Université médicale de Chine, Taichung 40402, Taïwan.
5 Institut universitaire de médecine intégrée, Université médicale de Chine, Taichung 40402, Taïwan.
6 Laboratoire principal de protéomique, Département de recherche médicale, Hôpital universitaire médical de Chine, Taichung 40402, Taïwan.
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