Extraction assistée par ultrasons de polysaccharides de Cistanche Tubulosa : optimisation du processus, isolation des fractions, caractérisation structurelle et effets anti-fatigue

 

Abstrait:Cette étude visait à optimiser le processus d’extraction des polysaccharides (CP) de Cistanche tubulosa et à étudier leurs caractéristiques structurelles et leurs effets anti-fatigue. Guidées par des expériences à facteur unique et optimisées à l’aide de la méthodologie de surface de réponse, les conditions optimales étaient une ultrasonication de 20 minutes, un rapport solvant/matériau de 20 : 1 et une puissance ultrasonique de 220 W, produisant 8,55 % de CP. La chromatographie sur colonne de cellulose a ensuite produit une fraction neutre (CPN) et trois fractions acides (CPA-1, CPA-2, CPA-3). Parmi eux, le CPN a montré la récupération la plus élevée (40,3 %), la teneur en glucides la plus élevée (39,5 %) et une forte activité antioxydante comparable au CPA-2 ; par conséquent, CPN a été sélectionné pour une caractérisation approfondie. Les analyses structurelles ont révélé des groupes fonctionnels polysaccharidiques caractéristiques, une prédominance de glucose et de mannose, ainsi que la présence de deux composants ayant des poids moléculaires nettement différents. In vivo, le CPN a prolongé de manière significative le temps de nage en charge chez la souris, a réduit l'urée sanguine et le lactate sériques et a augmenté le glycogène hépatique, confirmant ainsi son activité anti-fatigue. Ces résultats fournissent une base scientifique pour développer les polysaccharides de Cistanche tubulosa en produits fonctionnels antifatigue et en applications commerciales associées.

Mots-clés : Polysaccharides de cistanche tubuleuse; méthodologie des surfaces de réponse ; processus d'extraction; caractérisation structurelle; antifatigue; nouveaux avantages du CP dans les aliments fonctionnels et les nutraceutiques

 

Introduction

Cistanche tubuleuse (Schenk) Wight,une plante homologue médicinale et comestible prisée, connue sous le nom de « ginseng du désert », est utilisée depuis longtemps en Chine [1]. Ses principaux constituants bioactifs comprennent les polysaccharides, les glycosides phényléthanoïdes et les iridoïdes ; parmi ceux-ci, les polysaccharides présentent des fonctions physiologiques importantes, telles que des effets immunomodulateurs [2], antioxydants [3], anti-fatigue [4] et hypoglycémiants [5], montrant de larges perspectives d'application dans les produits pharmaceutiques, les produits de santé et les aliments fonctionnels [6]. Les méthodes traditionnelles d'extraction des polysaccharides (par exemple, immersion dans l'eau chaude et reflux) souffrent souvent de longues durées, d'une faible efficacité, d'une consommation d'énergie élevée et de dommages potentiels à la structure et à l'activité des polysaccharides [7-9]. Au-delà de l’extraction d’eau chaude [10] et du reflux [11], Teng et al. [12] ont comparé l'extraction par ultrasons, par micro-ondes et combinée ultrasons-micro-ondes, trouvant que la méthode synergique ultrasons-micro-ondes offrait le meilleur rendement (11,00 %), 1,28 % supérieur à l'extraction à l'eau chaude, suivie par les micro-ondes et les ultrasons seuls.

La séparation et la purification des polysaccharides visent à obtenir des monosubstances ou des fractions spécifiques de haute pureté, structurellement définies et bioactives à partir de polysaccharides bruts contenant des protéines, des acides nucléiques, des lipides et d'autres impuretés. Ailadan Maimaitiaili [11] a décoloré et déprotéiné les polysaccharides bruts de Cistanche avec une résine macroporeuse AB-8, puis les a séparés par de la cellulose DEAE-650M en utilisant de l'eau désionisée et un gradient de NaCl, obtenant un polysaccharide neutre et cinq polysaccharides acides ; in vitro, la fraction neutre a montré une activité antioxydante supérieure. Actuellement, les études de bioactivité sur les polysaccharides de Cistanche se concentrent principalement sur les effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-âge [13], tandis que les études anti-fatigue sont relativement rares.

En tant que technique d'extraction de produits naturels plus récente, l'extraction assistée par ultrasons (EAU) offre un temps d'extraction court, une efficacité élevée, une simplicité opérationnelle et un chauffage nul ou faible, évitant ainsi la dégradation thermique des composants sensibles à la chaleur et améliorant le rendement et la pureté ; il a été largement utilisé pour les polysaccharides végétaux [14]. Cependant, les conditions d’extraction des polysaccharides (CP) de Cistanche tubulosa aux Émirats arabes unis nécessitent une optimisation supplémentaire pour maximiser l’efficacité. La méthodologie de surface de réponse (RSM), une approche efficace de conception et d'optimisation basée sur la modélisation mathématique, permet l'analyse complète de plusieurs facteurs et de leurs interactions pour déterminer les paramètres optimaux.

Dans cette étude, nous avons utilisé le RSM pour optimiser le processus des EAU pour le CP, séparé et identifié les polysaccharides bruts résultants, comparé les activités antioxydantes in vitro des fractions et, sur la base des effets anti-fatigue évalués par l'activité antioxydante la plus forte in vivo. L'objectif est de fournir un soutien scientifique et technique pour une utilisation à valeur ajoutée des ressources de Cistanche tubulosa et d'accélérer la traduction en produits fonctionnels pour l'industrie du bien-être.

Polysaccharides de Cistanche tubulosa : Avantages

 

 

 

Liste des avantages de Cistanche

 

 

Obtenez une Cistanche tubulosa riche en polysaccharides

 

 

1 Matériels et méthodes

1.1 Matériels et instruments

Cistanche tubulosa was purchased from the Urumqi dried fruit market; polysaccharides were prepared in-house at Xinjiang Agricultural University. Absolute ethanol, acetone, and ether were analytical grade (Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.). DPPH was from Shanghai Ruji Biotechnology Development Co., Ltd. ABTS and shiitake polysaccharide (purity >98 %) provenaient de Solarbio (Pékin).

Équipement principal : broyeur XL‑02A (Yechang Machinery Co., Ltd.) ; Bain-marie numérique à température constante HH‑S (Jiangsu Jintan Medical Instrument Factory) ; Processeur pharmaceutique à ultrasons JBT/C‑YCL400T/3P(D) (Jining Jinbait Special Engineering Machinery Co., Ltd.) ; Unité de filtration sous vide VP50 (Beijing Labtech) ; Évaporateur rotatif RE‑52B (usine d'instruments biochimiques de Shanghai Yarong) ; centrifugeuse 80-1 (Jintan Hengfeng Instrument Factory) ; Spectrophotomètre UV‑2550 (Simadzu, Shanghai).

Animaux : Cinquante souris mâles SPF Kunming, poids corporel 20,00 ± 2,00 g, âgées de 3 à 4 semaines, achetées au Xinjiang Medical University Laboratory Animal Center (licence SYXK‑Xin 2024‑0001).

 

Polysaccharides de Cistanche tubulosa : Avantages

 

 

1.2 Méthodes

1.2.1 Processus d'extraction des polysaccharides

Les tranches de cistanche ont été pulvérisées et passées au tamis de 50 mesh. La poudre a été placée dans un ballon, mélangée avec 8 volumes d'éthanol à 80 %, portée au reflux à 90 degrés pendant 2 h et filtrée. Le résidu a été séché à l'air. De l'eau distillée a été ajoutée au résidu séché et extraite sous ultrasons ; l'extrait a été filtré, le filtrat retenu et le résidu réextrait une fois. Les deux filtrats ont été combinés et concentrés au quart du volume initial. Trois volumes d'éthanol absolu ont été ajoutés au concentré, laissés au repos à 4 degrés pendant 12 h et filtrés sous vide pour recueillir le précipité. Le précipité a été lavé séquentiellement avec de l'éthanol absolu, de l'acétone et de l'éther, séché et pesé pour obtenir du CP brut.

 

Polysaccharides de Cistanche tubulosa : Avantages

 

1.2.2 Expériences à un seul facteur

1.2.2.1 Effet du rapport solvant/matériau sur le rendement en CP

Cinq portions de poudre de Cistanche (4 g chacune) ont été préparées. Le temps d'extraction et la puissance des ultrasons ont été fixés à 20 min et 175 W. Des rapports solvant/matériau de 10 : 1, 15 : 1, 20 : 1, 25 : 1 et 30 : 1 (mL : g) ont été testés pour déterminer leurs effets sur le rendement en CP. Chaque expérience a été réalisée en triple.

 

1.2.2.2 Effet de la puissance ultrasonore sur le rendement du CP

Cinq portions de poudre (4 g chacune) ont été extraites au rapport solvant/matériau optimal déterminé en 1.2.2.1, avec un temps d'extraction fixé à 20 min. Des niveaux de puissance ultrasonique de 125, 150, 175, 200 et 225 W ont été testés. Des expériences en triple ont été réalisées.

 

1.2.2.3 Effet du temps ultrasonore sur le rendement du CP

Cinq portions de poudre (4 g chacune) ont été extraites au rapport solvant/matériau optimal (de 1.2.2.1) et à la puissance ultrasonique optimale (de 1.2.2.2). Des durées ultrasoniques de 10, 15, 20, 25 et 30 minutes ont été testées. Chaque condition a été exécutée en triple.

 

1.2.3 Méthodologie des surfaces de réponse (RSM)

Sur la base de résultats à un seul facteur, une conception Box – Behnken a été utilisée avec le rendement en CP comme réponse et le temps ultrasonique, le rapport solvant/matériau et la puissance ultrasonique comme facteurs. L'optimisation RSM a été réalisée dans Design‑Expert 8 avec une conception à trois facteurs et trois niveaux (voir tableau 1). Les expériences ont été réalisées en triple.

 

Polysaccharides de Cistanche tubulosa : Avantages

 

1.2.4 Détermination de la teneur en polysaccharides

La teneur en polysaccharides a été mesurée par la méthode colorimétrique acide sulfurique-anthrone [15]. L'anthrone (20 g) a été dissoute dans de l'acide sulfurique concentré et complétée à 100 ml pour préparer une solution à 0,2 g/mL. Une quantité appropriée de CP a été dissoute et diluée à 100 ml. Une aliquote de 1 ml a été mélangée avec 5 ml de 0,2 g/mL d'acide anthrone-sulfurique, vortexée, laissée à température ambiante pendant 5 min, chauffée dans un bain-marie à 90 degrés pendant 15 min, refroidie et l'absorbance mesurée à 585 nm. Le glucose a été utilisé pour préparer une courbe standard : Y=0.0081X + 0.0176 (R²=0.9991). L'absorbance de l'échantillon a été remplacée dans la courbe pour calculer la teneur en polysaccharides.

 

1.2.5 Calcul du rendement en polysaccharides

Le rendement en polysaccharide a été calculé selon la formule standard (masse de polysaccharide obtenu par rapport à la masse de matière première), en utilisant la teneur en polysaccharide mesurée.

 

1.2.6 Purification des polysaccharides

Crude CP extract was prepared under the optimized conditions. Following Wang et al. [16], Sevag reagent (chloroform:n‑butanol = 4:1, v/v) was used for deproteinization with vigorous shaking for 10 min, followed by centrifugation; the supernatant was collected and the process repeated three times. Eight volumes of 95% ethanol were added to the filtrate and left at 4 °C for 24 h. After centrifugation (8000 r/min, 10 min), the precipitate was collected and freeze‑dried to obtain crude CP. A 10 mg/mL solution was prepared by dissolving 100 mg crude CP in 10 mL distilled water, centrifuged at 7000 r/min for 10 min to remove insolubles, and filtered through a 0.45 μm membrane. The solution was loaded onto a DEAE‑52 cellulose column and eluted stepwise with distilled water and 0.1, 0.3, and 0.5 mol/L NaCl. Eluates were monitored by anthrone–sulfuric acid assay; fractions with absorbance >1,0 ont été regroupés, concentrés, dialysés, lyophilisés et pesés pour obtenir différentes fractions de polysaccharides. Le rendement (Y) a été calculé comme suit :
Y = (C × V × D) / (m × P)
où C est la concentration en polysaccharide (mg/mL) de la solution cible purifiée, V est le volume (mL), D est le facteur de dilution, m est la masse de CP brut (g) et P est la teneur en polysaccharides du CP brut.

 

1.2.7 Comparaison des activités antioxydantes des fractions

1.2.7.1 Élimination des radicaux DPPH

À la suite de Jiang et al. [17] avec des modifications, une solution de travail de DPPH à 0,2 mmol/L a été fraîchement préparée. Les solutions de fractions à 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1,0 mg/mL (1 ml chacune) ont été chacune mélangées avec 2 ml de DPPH, vortexées et incubées dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min. L'absorbance a été mesurée à 517 nm (Ai). Chaque test a été répété trois fois et la vitamine C (Vc) à des concentrations correspondantes a servi de contrôle positif. Le taux de récupération a été tracé en fonction de la concentration et calculé par :
Récupération DPPH (%)=[1 − (Ai − Aj) / (A0)] × 100
où Ai est A (2 mL DPPH + 1 mL d'échantillon/Vc), Aj est A (2 mL d'éthanol + 1 mL d'échantillon/Vc) et A0 est A (1 mL d'eau + 2 mL DPPH).

 

1.2.7.2 Élimination des radicaux ABTS

À la suite de Xu et al. [18] avec des modifications, 1 ml d'échantillon à 0,2–1,0 mg/mL a été mélangé avec 4 ml de solution ABTS, vortexé et incubé dans l'obscurité pendant 6 min à température ambiante. L'absorbance a été mesurée à 734 nm, en triple. Vc à des concentrations correspondantes était un contrôle positif. Le taux de récupération a été tracé en fonction de la concentration et calculé par :
Récupération ABTS (%)=[1 − (Ai − Aj) / (A0)] × 100
où Ai est A (1 mL d'échantillon/Vc + 4 mL d'ABTS), Aj est A (1 mL d'échantillon/Vc + 4 mL d'eau) et A0 est A (1 mL d'eau + 4 mL d'ABTS).

 

1.2.8 Analyse structurale des fractions polysaccharidiques

1.2.8.1 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

À la suite de Zhang WenChao et al. [19] avec des modifications, 2 mg de polysaccharide prétraité ont été mélangés avec 200 mg de KBr séché, broyés et pressés en pellets. Les spectres ont été collectés entre 400 et 4 000 cm⁻¹ à une résolution de 4 cm⁻¹ avec 32 balayages.

 

1.2.8.2 Détermination du poids moléculaire

Suivant Zhang Jiayuan [20] avec modifications, 5 mg d'échantillon ont été dissous dans 0,05 mol/L de NaCl à 5 ​​mg/mL, centrifugés et filtrés à travers une membrane de 0,22 μm. Le poids moléculaire a été déterminé par HPGPC avec deux colonnes SEC hydrosolubles à base de polymère (8 mm × 300 mm) en série, détecteur : Waters RI ; phase mobile : NaCl 0,05 M ; débit : 0,50 ml/min ; température de la colonne : 40 degrés ; injection : 30 µL. Les courbes d'étalonnage étaient :
Lg Mp–RT : y=−0,1359x + 9.4523 (R²=0.9974)
Lg Mw–RT : y=−0,1375x + 9.5035 (R²=0.9976)
Lg Mn – RT : y=−0,1368x + 9.4749 (R²=0.9971)
Les poids moléculaires ont été calculés en conséquence.

 

1.2.8.3 Composition des monosaccharides

À la suite de Naxin S et al. [21], les échantillons ont été traités et analysés par chromatographie ionique/HPLC. Des standards (5 mg chacun de rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose, acide galacturonique, acide glucuronique, glucosamine HCl, galactosamine HCl ; 10 mg de fucose) ont été dissous et amenés à 10 ml, puis dilués à une série de concentrations. La chromatographie a utilisé un système Thermo U3000 avec une colonne Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ; phase mobile : tampon acétonitrile : phosphate (12 g/L KH2PO4, pH ajusté à 6,8 avec NaOH 2 M)=17 : 83 (v/v), isocratique ; débit 0,8 ml/min ; colonne 30 degrés ; détection 250 nm ; injection 10 µL.

 

1.2.9 Expériences anti-fatigue de fractions polysaccharidiques

1.2.9.1 Regroupement et administration des animaux

Approbation éthique Non. 2023048. Après 3 jours d'acclimatation, 50 souris ont été randomisées en cinq groupes (n=10) : contrôle vierge ; contrôle positif (polysaccharide shiitake 300 mg/kg) ; fraction à faible dose (150 mg/kg) ; fraction à dose moyenne (300 mg/kg) ; fraction à dose élevée (600 mg/kg). Les fractions et les contrôles ont été administrés par gavage pendant 15 jours ; les souris avaient libre accès à la nourriture et à l’eau.

 

1.2.9.2 Test de nage en charge

Cinq heures après le dernier gavage, un poids de plomb égal à 7 % du poids corporel a été attaché à chaque queue de souris. Les souris ont nagé dans un bassin de 60 cm de profondeur à 30 ± 2 degrés. Le temps écoulé entre l'immersion et le moment où la tête est restée immergée pendant 10 s sans refaire surface a été enregistré comme temps de nage exhaustif.

 

1.2.9.3 Azote uréique du sang (BUN)

Après la baignade, le sang a été collecté via le sinus orbitaire dans des tubes héparinés et centrifugé à 3 000 tr/min pendant 10 min. BUN a été mesuré strictement selon les instructions du kit.

 

1.2.9.4 Lactate sanguin

Le sérum (20 μL) a été traité selon les instructions du kit. L'absorbance a été lue à 530 nm (longueur de trajet 1 cm) avec de l'eau bidistillée à zéro et la concentration en lactate calculée.

 

1.2.9.5 Glycogène hépatique

Immédiatement après le prélèvement de sang, les souris ont été euthanasiées par luxation cervicale. Les foies ont été excisés, rincés dans une solution saline, séchés et 80 mg de tissu ont été placés dans un tube contenant 3 volumes d'alcali (pH 8,0). Les échantillons ont été bouillis pendant 20 minutes, refroidis et le glycogène a été quantifié selon les instructions du kit.

 

1.2.10 Analyse des données

Les données ont été analysées à l'aide de SPSS 17.1 et rapportées sous forme de moyenne ± écart-type (X ± S). Une ANOVA unidirectionnelle avec tests d'homogénéité de variance a été utilisée ; P <0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Les chiffres ont été préparés dans Origin 2021 et GraphPad Prism 9.

Points forts de la traduction commerciale et des applications

Nouveau positionnement des avantages : Le polysaccharide neutre optimisé de Cistanche (CPN) a démontré un double effet antioxydant et anti-fatigue : endurance prolongée, réduction du BUN et du lactate, et augmentation des allégations soutenant le glycogène hépatique telles que "soutient l'endurance", "aide à réduire la fatigue induite par l'exercice" et "soutien antioxydant".

Formats de produits : boissons d'endurance prêtes à mélanger, shots de gel, gommes fonctionnelles et capsules. Combinez le CPN avec des électrolytes, des vitamines B et des glucides à faible IG pour les formulations sportives ; ou avec les glycosides phényléthanoïdes traditionnels Cistanche pour des SKU synergiques « énergie + récupération ».

Conseils de traitement : les conditions des Émirats arabes unis (20 min, rapport de solvant 20 : 1, 220 W) sont évolutives et économes en énergie ; Le fractionnement DEAE-52 produit une fraction neutre en plomb (CPN) avec une teneur et une activité en glucides plus élevées, permettant une standardisation cohérente (par exemple, supérieur ou égal à 39 % de glucides, empreinte HPGPC avec Mw bimodal).

Conformité et justification : Utiliser les présents résultats in vivo pour justifier les allégations relatives à la structure/fonction ; développer avec des essais pilotes sur l’homme mesurant le temps jusqu’à l’épuisement, la cinétique du lactate et l’effort perçu. Appliquer les déclarations d’extraction et de solvant en étiquette propre.

Contrôle qualité : adopter les bandes de marqueurs FTIR, les ratios de monosaccharides (glucose/mannose prédominant) et le profil de poids moléculaire HPGPC comme critères de libération. Dosages antioxydants (DPPH/ABTS) pour contrôler l'activité en cours de processus.

 

Affiliations et références des auteurs (source faisant autorité)

DUAN Jihua1, HAN Haixia2,+, ZHAO Wenyan3, JIA Mingxi2, SUN Jingjing2, ZHOU Jixiang2, SONG Suqin4, ZHU Dongliang3*, BAO Xiaowei2*
(1. Xinjiang Sikai Food R&D Center (Co., Ltd.), Changji, Xinjiang 831100 ; 2. Collège des sciences alimentaires et de la pharmacie, Université agricole du Xinjiang, Urumqi 830052, Chine ; 3. Institut de tests pharmaceutiques et d'instruments, Département de logistique de la région militaire du Xinjiang, Xinjiang, Urumqi 830052 ; 4. Station expérimentale complète d'Urumqi, Académie des sciences agricoles du Xinjiang, Xinjiang, Ürumqi 830052)

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