Zerumbone, un sesquiterpène de gingembre tropical de Zingiber Officinale Roscoe, atténue la mélanogénèse induite par la MSH dans les cellules B16F10 Partie 1

Abstrait:Zerumbone (ZER), un constituant actif de la famille des Zingibéracées, s'est avéré présenter plusieurs activités biologiques, telles qu'anti-inflammatoire, anti-allergique, antimicrobienne et anticancéreuse ; cependant, il n'a pas été étudié pour ses propriétés anti-mélanogènes. Dans la présente étude, nous démontrons que ZER et Zingiber sont des extraits officinaux (ZO) qui atténuent considérablement l'accumulation de mélanine dans les cellules mélanogènes B16F10 de souris stimulées par l'hormone stimulatrice des mélanocytes (-MSH). De plus, pour élucider le mécanisme moléculaire par lequel ZER supprime l'accumulation de mélanine, nous avons analysé l'expression du facteur de transcription associé à la mélanogénèse, le facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF) et ses gènes cibles, tels que la tyrosinase, la protéine 1 liée à la tyrosinase ( TYRP1) et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TYRP2), dans les cellules B16F10 qui sont stimulées par -MSH. Ici, nous avons constaté que ZER inhibe l'expression médiée par MITF des gènes mélanogènes lors de la stimulation -MSH. De plus, les cellules traitées avec différentes concentrations de zerumbone et de ZO ont montré une augmentation de la phosphorylation des kinases régulées par le signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), qui sont impliquées dans le mécanisme de dégradation du MITF. L'inhibition pharmacologique de ERK1/2 à l'aide de U0126 a suffisamment inversé l'effet anti-mélanogène de ZER, suggérant qu'une phosphorylation accrue de ERK1/2 est nécessaire pour son activité anti-mélanogène. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les extraits ZER et ZO peuvent être utilisés comme ingrédients actifs dans les cosmétiques blanchissant la peau en raison de leur effet anti-mélanogène.

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Mots clés:zérumbone ; Zingiber officinale Roscoe; mélanogénèse; MITF ; ERK1/2

1. Introduction

La mélanogénèse, la production de mélanine par les mélanocytes épidermiques, est stimulée par l'hormone de stimulation des mélanocytes (-MSH) qui est sécrétée par les kératinocytes lors de l'exposition aux rayons ultraviolets (UV) [1,2]. Le facteur de cellules souches (SCF) est un autre facteur mélanogénique qui contrôle strictement la migration, la prolifération et la différenciation des mélanocytes pour le maintien de la mélanogénèse cutanée postnatale [3]. Le facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF), qui est un facteur de transcription mélanogénique, est activé par la voie de signalisation de l'AMPc-PKA-CREB (protéine de liaison de l'élément de réponse de l'élément de réponse A-AMPc de l'adénosine monophosphate cyclique) lors de la stimulation -MSH via le récepteur de la mélanocortine 1 (MC1R) dans les membranes cytoplasmiques des mélanocytes épidermiques [4]. Plusieurs produits chimiques, tels que la forskoline et l'IBMX (3-isobutyl-1-méthylxanthine), sont connus pour activer la voie de signalisation cAMP-PKA-CREB, conduisant à l'induction de la mélanogénèse [5]. Plusieurs études ont révélé que l'activation soutenue des kinases régulées extracellulaires 1 et 2 (ERK1/2), impliquées dans le mécanisme moléculaire de l'oncogenèse, favorise la phosphorylation du MITF au niveau de Ser73 et sa dégradation ultérieure via la protéolyse dépendante de l'ubiquitine [6,7 ]. En effet, il a été rapporté que U0126, un inhibiteur sélectif de la voie ERK1/2, augmente l'expression de MITF et l'activité de la tyrosinase, conduisant à la production de mélanine [6]. Le MITF stabilisé et activé augmente l'expression des gènes mélanogènes, tels que la tyrosinase, la protéine 1 liée à la tyrosinase (TYRP1) et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TYRP2). La transformation de la tyrosine en 3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), qui est l'étape initiale de la mélanogénèse, est catalysée par la tyrosinase. Les protéines liées à la tyrosinase (TRP) catalysent d'autres réactions d'oxydation et de tautomérisation [8]. Après synthèse de mélanine, la mélanine mature est transportée des mélanocytes épidermiques vers le cytoplasme des kératinocytes basaux pour protéger les cellules des rayons UV [2].

Une mélanogenèse anormalement accrue provoque plusieurs types de troubles cutanés, tels que le cancer de la peau, le chloasma et les taches de rousseur [4] ; ainsi, des petites molécules ou des produits naturels qui ciblent soit l'activité catalytique de la tyrosinase, soit des régulateurs des voies de signalisation de la mélanogénèse, dont ERK1/2, ou la transcription médiée par MITF des gènes mélanogènes, ont été identifiés comme principes actifs à exploiter dans la cosmétique industrie. Plusieurs petites molécules, telles que l'acide kojique, l'arbutine et la niacinamide, sont largement utilisées comme ingrédients cosmétiques en raison de leurs activités anti-mélanogènes. Cependant, des rapports ont montré que l'acide kojique provoque de multiples effets secondaires, notamment la cytotoxicité, la dermatite, le cancer de la peau et le carcinome hépatocellulaire, en raison de son activité génotoxique [9]. Bien que l'arbutine, isolée de la busserole, ait été utilisée pour traiter les troubles d'hyperpigmentation, son utilisation en tant qu'ingrédient cosmétique a récemment été restreinte en raison de ses nombreux effets secondaires [9]. Il a été rapporté que le niacinamide a une activité anti-mélanogénique et cette activité est réalisée en inhibant le transfert des mélanosomes des mélanocytes aux kératinocytes environnants [10]. Ainsi, il a été généralement utilisé comme composé de blanchiment de la peau dans l'industrie cosmétique. Pour surmonter les limites des agents de blanchiment de la peau établis qui ont plusieurs effets secondaires, il est important de développer des ingrédients de blanchiment de la peau sûrs dérivés de sources naturelles. Par exemple, la -thujaplicine, le linderanolide B, le 4-butyl résorcinol et la plumbagine ont été identifiés comme des composés anti-mélanogènes en raison de leurs effets inhibiteurs de la tyrosinase [4,11]. La nobilétine, la withaférine A, le sésamol et la chaetocine présentent des propriétés anti-mélanogènes en modulant les intermédiaires de signalisation dans la voie de la mélanogénèse [11].

Le Zerumbone (ZER) est un produit naturel, qui est isolé des huiles essentielles volatiles de plantes appartenant à la famille des Zingiberaceae, comme le Zingiber zerumbet Smith et le Zingiber officinal Roscoe [12]. Plusieurs études ont montré que le ZER possède un large éventail d'activités biologiques, notamment des activités antimicrobiennes, antioxydantes, antidiabétiques, anticancéreuses, anti-inflammatoires, antiallergéniques et anti-angiogéniques [12]. Fait intéressant, il a été démontré que ZER exerce un effet protecteur contre les dommages oxydatifs induits par les ultraviolets A (UVA) dans les kératinocytes cutanés, en raison de sa capacité à piéger les espèces réactives de l'oxygène (ROS) via l'activation du facteur nucléaire E {{8} }facteur lié-2 (Nrf2) [1,13]. Cela suggère que le ZER peut être utilisé comme additif fonctionnel dans les cosmétiques pour les soins de la peau. Cependant, le mécanisme détaillé des propriétés anti-mélanogéniques de l'action ZER reste à étudier.

Dans la présente étude, les effets inhibiteurs de l'extrait officinal ZER et Zingiber (ZO) sur la mélanogénèse stimulée par la MSH et leurs mécanismes sous-jacents ont été étudiés. Ici, nous montrons que ZER supprime de manière significative la mélanogénèse induite par la MSH en régulant à la hausse la phosphorylation de ERK1/2 et en inhibant l'expression médiée par MITF des gènes mélanogènes.

2. Résultats

2.1. Zerumbone (ZER) supprime la mélanogénèse induite par la MSH dans les cellules de mélanome de souris B16F10

Pour étudier l'effet anti-mélanogénique du zerumbone (ZER), nous avons initialement évalué sa cytotoxicité dans les cellules B16F10 et HaCaT. La structure chimique de ZER est illustrée à la figure 1A. Il a été observé que ZER à des concentrations supérieures à 20 µM présentait un fort effet cytotoxique, alors qu'à celles inférieures à 20 µM, ZER ne présentait pas de cytotoxicité dans les deux lignées cellulaires (figure 1B). Ensuite, nous avons étudié les effets inhibiteurs de ZER sur l'accumulation et la sécrétion de mélanine induite par l'hormone de stimulation des mélanocytes (-MSH) dans les cellules B16F10. Il a été démontré que ZER supprime fortement l'accumulation intracellulaire de mélanine induite par la MSH et sa sécrétion dans le milieu de culture (figure 1C, D). De plus, nous avons constaté que le ZER atténue la mélanogénèse plus efficacement que l'arbutine 1 mM ou l'acide kojique 0,2 mM, les constituants actifs bien connus des cosmétiques blanchissants pour la peau (Figure 1D). Pour déterminer si le ZER est suffisant pour supprimer la mélanogenèse dans les cellules humaines, nous avons utilisé des cellules de mélanome humain G361 productrices de mélanine. Comme le montre la figure 1E, ZER diminue de manière significative la teneur en mélanine extra- et intracellulaire induite par le facteur de cellules souches (SCF). Ces résultats confirment l'activité anti-mélanogénique de ZER dans les cellules mélanogènes de souris B16F10 et humaines G361.

2.2. Zerumbone supprime l'expression génique du facteur de transcription de la mélanogénèse, du MITF et de ses gènes cibles dans les cellules de mélanome humain G361 

Il a été rapporté que l'endothéline -1 et la signalisation SCF jouaient un rôle essentiel dans la mélanogenèse des mélanocytes humains et de plusieurs sous-types de mélanome [3, 14–16]. Dans cette étude, nous avons constaté que ZER supprime la mélanogenèse lors de stimuli mélanogènes, -MSH et SCF, dans des cellules de mélanome B16F10 de souris et humaines G361 (Figure 1).

Ainsi, nous avons mesuré les altérations des niveaux d'expression des gènes et des protéines liés à la mélanogénèse lors de la stimulation du SCF dans les cellules de mélanome humain G361. Nous avons constaté que ZER atténue l'expression de la protéine MITF et de la tyrosinase induite par le SCF 2 à 4 h et 24 à 48 h après la stimulation du SCF, respectivement (figure 2A). En outre, l'expression génique des gènes liés à la mélanogénèse, tels que le MITF, la tyrosinase et la protéine 1 liée à la tyrosinase (TYRP1) a été supprimée dans les cellules G361 traitées au ZER (figure 2B, C). Ces résultats ont révélé le temps de pointe pour l'expression des gènes liés à la mélanogénèse lors de la stimulation du SCF ; L'induction maximale de l'ARNm du MITF a été observée en 1 à 2 h, et les niveaux d'ARNm de la tyrosinase et de la TYRP1 ont atteint leur maximum 24 à 48 h après la stimulation du SCF.

2.3. Zerumbone supprime l'expression des gènes mélanogènes et des enzymes dans les cellules B16F10 de souris

Pour étudier le mécanisme moléculaire par lequel ZER supprime la mélanogénèse, nous avons mesuré l'expression génique du facteur de transcription de la mélanogénèse, MITF, et de ses gènes cibles, tels que la protéine 1 liée à la tyrosinase (TYRP1), la tyrosinase et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TYRP2) en l'absence ou en présence de ZER. Étant donné que le temps de pointe pour l'expression des gènes liés à la mélanogénèse lors de la stimulation par SCF et -MSH est connu pour les cellules de mélanome humain G361 (Figure 2) et B16F10 de souris [4], respectivement, nous avons en outre mesuré l'expression de MITF, tyrosinase, TYRP1 et TYRP2 dans des cellules de mélanome B16F10 de souris traitées par ZER après 2 h ou 48 h d'incubation avec -MSH. La figure 3A montre que ZER est suffisant pour atténuer l'expression de MITF, TYRP1, TYRP2 et tyrosinase induite par MSH dans les cellules B16F10. De même, les niveaux d'expression des protéines MITF, tyrosinase et TYRP2 ont diminué lors du traitement ZER. La phosphorylation médiée par la protéine kinase A (PKA) de CREB est une voie de signalisation majeure augmentant le MITF au niveau transcriptionnel lors de la stimulation par -MSH [4]. Ainsi, ici, nous avons analysé si une diminution de la phosphorylation de CREB par ZER pouvait médier la suppression de MITF. Nous avons constaté que la phosphorylation de CREB induite par MSH n'était pas affectée par le traitement ZER, ce qui suggère que ZER supprime l'expression de MITF induite par MSH indépendamment de l'axe de la voie de signalisation PKA-CREB (figure 3B). Parce que la tyrosinase est une enzyme limitante, qui régule la synthèse de la mélanine [2,4,11], nous avons analysé plus en détail les niveaux de protéine de tyrosinase intracellulaire et son activité enzymatique lors du traitement à l'arbutine, à l'acide kojique et au ZER. La figure 3C montre que ZER réduit suffisamment les niveaux de protéine tyrosinase induits par MSH dans les cellules B16F10. De plus, la figure 3D révèle que le ZER 10 µM supprime plus efficacement l'oxydation de la L-DOPA que les inhibiteurs de la tyrosinase, l'arbutine et l'acide kojique, ce qui suggère que l'oxydation de la L-DOPA en dopaquinone par l'activité enzymatique de la tyrosinase est supprimée dans les cellules traitées au ZER . Ces résultats démontrent que ZER atténue la mélanogénèse médiée par la MSH en supprimant l'expression génique de MITF, un facteur de transcription associé à la mélanogénèse, et ses gènes cibles.

2.4. L'effet anti-mélanogénique de Zerumbone passe par la phosphorylation de ERK1/2

L'activation de la protéine kinase B (AKT) et des kinases régulées par le signal extracellulaire (ERK1/2) par des facteurs de croissance ou des stimuli mélanogènes est connue pour supprimer la mélanogénèse par la diminution de l'expression de MITF et de ses gènes cibles [11]. La phosphorylation de MITF au niveau de Ser73 et Ser409 en réponse à la voie de signalisation ERK1/2 favorise sa dégradation dépendante du protéasome [17,18]. Par conséquent, nous avons cherché à savoir si ZER régule la phosphorylation de ERK1/2 dans les cellules de mélanome humain B16F10 de souris et G361. Une phosphorylation accrue de ERK1/2 (p-ERK1/2) mais pas de ERK1/2 total (T-ERK1/2) a été observée lors du traitement ZER de manière dépendante du temps et de la dose (Figure 4A, B). Fait intéressant, il a été observé que la phosphorylation de ERK1/2 augmentait rapidement dans les 10 à 30 min et 1 à 2 h après le traitement ZER dans les cellules de mélanome B16F10 de souris et humaines G361 (figure 4A). Cependant, la phosphorylation de AKT et MEK n'a pas été observée lors du traitement ZER, ce qui suggère que la phosphorylation de ERK1/2 induite par ZER peut supprimer MITF (figure 4B). Étant donné que la phosphorylation de ERK1 / 2 favorise la phosphorylation et la dégradation du protéasome de MITF [17, 18], nous avons recherché si l'inhibiteur du protéasome empêche la réduction de MITF par ZER. La suppression de MITF par ZER n'a pas été observée en présence de MG132, confirmant que ZER diminue l'expression de MITF par dégradation protéasomique (figure 4C). Ensuite, nous avons étudié si ZER phosphoryle MITF à Ser73, qui est le résidu cible de ERK1/2. Pour détecter le MITF phosphorylé, les cellules ont été exposées à -MSH et MG132. Ici, nous avons constaté que le MITF phosphorylé (Ser73) était significativement augmenté par ZER en présence de -MSH et MG132 (Figure 4D). U0126, un inhibiteur sélectif de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) [19], a aboli la phosphorylation du MITF induite par ZER (Figure 4D). De plus, les niveaux totaux de protéines MITF dans les lysats de cellules entières (WCL) n'ont pas été modifiés par ZER et U0126 en présence de MG132 (figure 4D). Ces résultats indiquent que la phosphorylation et la dégradation du protéasome médiées par ERK1/2- MITF (Ser73) sont un mécanisme essentiel dans la suppression de MITF médiée par ZER. En outre, la figure 4E montre que U0126 a restauré de manière significative les niveaux de protéine MITF réduits dans les cellules traitées au ZER. De manière cohérente, la diminution de la teneur en mélanine intracellulaire par ZER a été restaurée par U0126 à environ 40 % (figure 4F), ce qui suggère que l'activation de ERK1/2 est nécessaire pour l'effet anti-mélanogène de ZER.

2.5. Effet anti-mélanogénique des extraits de Zingiber Offificinale (ZO)

Le ZER est un phytochimique dérivé de plusieurs espèces végétales de la famille des Zingiberaceae, comme le Zingiber zerumbet et le Zingiber officinal [12]. Ainsi, nous avons initialement mesuré la viabilité cellulaire en l'absence ou en présence d'extrait ZO dans les cellules B16F10 et HaCaT. La figure 5A montre que la viabilité cellulaire n'a pas été altérée par le traitement de l'extrait de ZO. Nous avons ensuite analysé les effets anti-mélanogènes de l'extrait officinal de Zingiber (ZO). Étant donné que l'expression de MITF et de ses gènes mélanogènes cibles a été diminuée par ZER via la voie de signalisation ERK1 / 2 activée (figures 2 et 3), nous avons vérifié si l'extrait de ZO supprime le MITF induit par MSH et l'expression de ses protéines mélanogènes cibles dans les cellules B16F10. Semblable à l'effet anti-mélanogénique de ZER, le MITF, la tyrosinase et la TYRP2 induits par la MSH ont été significativement diminués par l'extrait de ZO de manière dose-dépendante (figure 5B). Fait intéressant, la phosphorylation de ERK1/2 a également augmenté dans les cellules traitées à l'extrait de ZO (figure 5B). L'expression de MITF et de ses gènes cibles, tels que la tyrosinase, TYRP1 et TYRP2, a été significativement diminuée lors du traitement de l'extrait de ZO à 5 µg/µL (figure 5C). De plus, la teneur en mélanine extracellulaire et intracellulaire a été considérablement réduite à environ 40 % lors du traitement de l'extrait de ZO à 5 µg/µL (figure 5D). De plus, une diminution de l'activité de la tyrosinase a été observée dans les cellules qui ont été traitées avec l'extrait de ZO (figure 5E). Ces résultats suggèrent que l'extrait officinal de Zingiber (ZO) supprime la mélanogénèse en atténuant l'expression du gène mélanogénique médiée par le MITF.

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