2.6. Expression de Caspase-3 et Caspase-6

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages causés par les anions des radicaux libres thymine.

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Les souris TgAPP ont montré une augmentation de l'expression du gène caspase{{0}} (Figure 8C1, H1), qui était significative et supérieure à 30 % par rapport à l'hippocampe des souris WT (Figure 8H1 ; p < 0,05). En ce qui concerne l'expression de la caspase -6, aucune différence n'a été observée entre les souris transgéniques et non transgéniques (figure 8C2, H2).

Les traitements à la quercétine et à la rutine ont permis de réduire les niveaux d'ARNm de caspase{{0}} dans l'hippocampe de manière statistiquement significative (Figure 8H1 ; p <0.05), avec des pourcentages d'inhibition d'environ 17 %. et 27 pour cent pour les souris femelles et mâles, respectivement. Dans le cortex cérébral, des différences significatives n'ont été observées que dans le traitement à la rutine chez les mâles (Figure 8C1 ; p < 0,05).

À propos de la caspase-6, les traitements à la quercétine et à la rutine n'ont exercé aucun effet statistiquement significatif sur le cortex ou l'hippocampe (Figure 8C2, H2), bien que dans ce dernier cas, la Caspase-6 chez les hommes TgAPP ait tendance à diminuer (Figure 8H2).

2.7. Marqueurs d'inflammation

Les résultats obtenus pour l'expression génique des médiateurs inflammatoires IL-1, TNF- et IFN- sont présentés à la figure 9.

Dans le TgAPP, il y a eu une augmentation significative de l'expression du gène IL{{0}} d'environ 20 % dans le cortex et l'hippocampe chez les deux sexes par rapport aux souris WT (Figure 9C1, H1 ; p < 0,05). En ce qui concerne le TNF-, bien que des taux d'ARNm plus élevés soient montrés dans la TgAPP, ils ne sont pas statistiquement significatifs chez les souris WT (Figure 9C2, H2). En ce qui concerne l'IFN-, il y a eu une augmentation d'environ 30 % de son expression chez les mâles, ce qui n'était statistiquement significatif que dans le cortex (Figure 9C3 ; p < 0,05).

Les traitements à la quercétine et à la rutine, chez les femelles et les mâles, ont pu diminuer l'expression de l'IL{{0}} dans le cortex cérébral et l'hippocampe par rapport aux souris TgAPP témoins (Figure 9C1, H1 ; p <{8 }}.05), obtenant des valeurs similaires à celles des souris WT, et particulièrement inférieures dans l'hippocampe des souris mâles (Figure 9H1 ; p < 0,05).

L'effet global des deux traitements flavonoïdes sur l'expression de IL{{0}} n'a pas été observé avec TNF- ni avec INF- . Ainsi, les mâles TgAPP, lors du traitement à la quercétine, ont subi une diminution significative du TNF- hippocampique (Figure 9H2; p <0.05) et de l'expression corticale de l'IFN- (Figure 9C3; p <0, 05).

2.8. Évaluation des neurones en dégénérescence et de leurs projections

Aucun signe caractéristique de neurodégénérescence n'a été observé à l'âge auquel les souris TgAPP transgéniques ont été testées, par rapport aux souris WT, et les traitements à la quercétine et à la rutine n'ont montré aucun changement pendant 4 semaines par rapport à la TgAPP (Figure S1, Données supplémentaires).

2.9. Expression des récepteurs ionotropes du glutamate

Aucune différence significative n'a été trouvée dans l'expression des récepteurs, en comparant les valeurs obtenues pour les souris TgAPP témoins avec celles obtenues pour les souris WT. Il n'y avait pas non plus d'effets notables sur l'expression de ces récepteurs ionotropes en présence d'un traitement à la quercétine ou à la rutine (tableau S5, données supplémentaires).

3. Débat

Le but de notre présente étude était d'évaluer l'impact de deux flavonoïdes, la quercétine et la rutine, aux premiers stades de la pathogenèse de la MA, quel que soit leur effet sur la neurodégénérescence et/ou la fonction cognitive. Le cortex et l'hippocampe étaient les zones du cerveau analysées, car ce sont les structures cérébrales les plus touchées dans la MA. Il faut tenir compte du fait que la quercétine et la rutine ont été administrées par le biais d'un régime alimentaire formulé contenant l'un ou l'autre des deux flavonoïdes, pour imiter, dans un modèle animal AD, l'apport d'un régime alimentaire humain sain, contenant un ingrédient actif.

En particulier, le transgène APPswe chez la souris C57B6 a exercé un impact significatif sur le rapport GSH/GSSG, les niveaux de MDA, la capacité enzymatique antioxydante, l'expression de l'APP, l'activité de BACE1 et l'expression de la caspase-3 et de l'IL-1. Alors que les mutations APP chez l'homme entraînent généralement une MA typique, elles sont principalement liées à une pathologie uniquement amyloïde chez les souris transgéniques APP et il n'y a pas de neurodégénérescence notable [14,15], car aucun signe caractéristique n'a été observé chez nos souris transgéniques TgAPP, contrairement à les souris WT (données supplémentaires, figure S1). La contre-coloration au 40 -6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) des neurones de l'hippocampe nous a permis d'observer la morphologie nucléaire, car ce composé est un colorant fluorescent pour les acides nucléiques. Nous n'avons pas observé de noyaux fragmentés ou lobulaires, typiquement apoptotiques ; nous n'avons pas non plus observé de différences remarquables entre les coupes histologiques d'hippocampe de la lignée transgénique témoin TgAPP concernant les coupes WT ; nous n'avons pas non plus observé de différences entre les traitements à la quercétine et à la rutine concernant les souris témoins TgAPP.

Dans le panel des caractéristiques biochimiques de la MA à analyser, nous nous sommes concentrés principalement sur la détermination du rapport GSH/GSSG sur l'un ou l'autre des deux régimes flavonoïdes, puisque l'épuisement des niveaux de GSH représente l'un des marqueurs biochimiques précoces les plus importants dans la MA [16,17 ] et a été observée au cours de sa pathogenèse et de la progression de la maladie. La mesure des niveaux de GSH dans le cerveau [18] et, plus récemment, les niveaux de GSH dans le sang [19] ont été prometteuses comme marqueurs diagnostiques pour les premiers stades de la MA. De plus, des efforts ont également été faits pour compléter les réserves endogènes de GSH par elles-mêmes ou leurs précurseurs [20-22]. Dans notre étude, une diminution du pouvoir réducteur cellulaire (GSH/GSSG) a été observée chez les souris TgAPP concernant les animaux WT, tant chez les mâles que chez les femelles, et dans les deux régions du cerveau. Dans le cortex et l'hippocampe des souris WT et TgAPP, le rapport GSH/GSSG était plus faible chez les mâles que chez les femelles. Les régimes de quercétine et de rutine ont augmenté de manière significative le rapport GSH/GSSG par rapport aux souris TgAPP non traitées, et cette augmentation était plus prononcée dans l'hippocampe. Les modifications des taux de GSH et de GSSG et du rapport GSH/GSSG lors du traitement à la quercétine ou à la rutine des mâles, concernant l'augmentation du pouvoir redox, étaient plus importantes que chez les femelles. Les résultats de nos déterminations peuvent révéler une base importante sous-jacente aux différences associées au sexe chez les souris Tg2576 dans la sensibilité aux dommages oxydatifs des macromolécules d'une part, puisque le système glutathion est un réducteur polyvalent dans de multiples fonctions biologiques, et dans l'impact de la prévention régimes flavonoïdes dans la restauration de son état physiologique d'autre part. Comme nous le verrons tout au long de cette discussion, nous avons défini l'augmentation du rapport GSH/GSSG comme l'axe principal pouvant expliquer l'ensemble des effets observés chez les souris TgAPP.

Il a récemment été proposé que le rapport GSH / GSSG, plutôt que de fonctionner simplement comme un tampon redox, fonctionnerait plutôt comme un mécanisme de régulation principal, permettant aux protéines d'atteindre leur conformation et fonctionnalité natives en contrôlant étroitement l'équilibre thiol-disulfure du cellulaire. protéome. En bref, le système glutathion apparaît comme essentiel pour préserver un protéome sain, montrant que la perturbation de l'homéostasie redox du glutathion (c'est-à-dire génétiquement ou pharmacologiquement) augmente l'agrégation des protéines en raison de perturbations de l'efficacité de l'autophagie [23]. Par conséquent, les stratégies visant à maintenir l'homéostasie redox du glutathion peuvent avoir un potentiel thérapeutique dans les maladies associées à l'agrégation des protéines, telles que la MA. La machinerie de dégradation ubiquitine-protéasome, qui est impliquée dans la pathogenèse de la MA, est étroitement liée à la préservation du protéome. Le protéasome dégrade sélectivement plusieurs substrats qui sont essentiels au maintien de l'homéostasie neuronale, y compris le catabolisme des protéines oxydées et agrégées. BACE1 subit une ubiquitination, et il a été démontré que le blocage de la voie ubiquitine-protéasome inhibe la dégradation de BACE1 et conduit par conséquent à une production accrue d'activité enzymatique de BACE1, plus de produit de clivage C99 et des augmentations à la fois de A 1-40 et A { {8}} dans les cellules neuronales et non neuronales [10]. Nos études précédentes ont montré que les flavonoïdes, la quercétine et la rutine, affectent diverses voies de signalisation et réseaux moléculaires associés à la modulation de la fonction du protéasome dans les cellules de neuroblastome [9]. De plus, il a été démontré que les neurones supplémentés en glutathion réduit (GSH) récupéraient l'activité du protéasome et réduisaient la formation d'agrégats [11] puisque la fonction du protéasome est régulée par le statut redox [24]. Par conséquent, l'augmentation du rapport GSH/GSSG subie par les animaux lors d'un régime de quercétine ou de rutine est cohérente avec la modulation du protéasome par la quercétine et la rutine, démontrée ex vivo précédemment.

Comme mentionné précédemment, le déséquilibre redox conduit à des protéines hautement modifiées par oxydation qui ont tendance à s'accumuler et à créer des agrégats entraînant une altération du protéasome [25]. Ainsi, étant donné le rôle crucial du stress oxydatif dans la pathogenèse de la MA, des biomarqueurs du stress oxydatif, notamment la peroxydation lipidique (niveaux de MDA) et les enzymes antioxydantes, ont été évalués dans le cortex et l'hippocampe chez les souris TgAPP et WT. SOD, CAT, GR et GPx sont les enzymes antioxydantes les plus importantes qui agissent contre les radicaux libres d'oxygène et régulent le métabolisme des radicaux libres dans le corps et jouent un rôle dans le système de piégeage des radicaux libres, protégeant les cellules du corps de la peroxydation lipidique. . Dans notre étude, en conséquence de la surexpression de l'APP, une diminution généralisée des activités enzymatiques antioxydantes a été observée chez les souris TgAPP par rapport aux souris WT, étant statistiquement significative pour CAT. Conformément aux niveaux réduits de GSH, la peroxydation lipidique a été significativement augmentée chez les souris TgAPP. Alors que la source du stress oxydatif dans la MA humaine est très complexe et multifactorielle, la pathologie amyloïde développée chez la souris semble suffisante pour initier le processus pathologique conduisant à l'augmentation du stress oxydatif dans le cerveau [26]. Les animaux traités avec la rutine ont présenté une augmentation de l'activité CAT dans le cortex et de l'activité GR dans l'hippocampe, tant chez les mâles que chez les femelles. Seuls les animaux traités avec la rutine ont présenté des changements dans l'expression génique de CAT et GR dans le cortex et l'hippocampe chez les mâles et les femelles et GPx dans l'hippocampe des souris femelles. Dans ce contexte, il a été démontré que plusieurs composés naturels affectent la diaphonie entre le protéasome et la régulation redox. Plus précisément, la quercétine est un activateur Nrf2 connu [27] qui présente des propriétés antioxydantes par la stimulation de la fonction du protéasome, favorisant une résistance accrue au stress oxydatif et conférant une longévité cellulaire accrue [28].

L'expression tissulaire spécifique de BACE1 est essentielle pour le traitement normal de l'APP, et son expression dérégulée peut jouer un rôle dans la pathogenèse de la MA. BACE1 est principalement exprimé dans les neurones de l'hippocampe, le cortex et la couche granulaire cérébelleuse [10]. Il convient de noter que des études antérieures ont montré que les souris transgéniques APP mutantes suédoises présentaient des taux cérébraux significativement augmentés de A à l'état d'équilibre [29], ce qui suggère que BACE1 joue un rôle essentiel dans la voie amyloïdogénique dans la pathogenèse de la MA et constitue une bonne cible thérapeutique. pour le traitement de la MA. Dans notre étude, nous avons observé une réduction significative de l'activité de BACE1 lors des traitements à la quercétine et à la rutine, ce qui pourrait contribuer à la diminution du dépôt d'A chez la souris. Nous soutenons que plus qu'uniquement en tant qu'inhibiteurs BACE1 de l'enzyme, la quercétine et la rutine pourraient exercer une réduction de l'activité BACE1 liée à une augmentation du rapport GSH/GSSG, sur la base de l'hypothèse d'une amélioration de la récupération de l'activité du protéasome. En ce sens, on sait que le ciblage des inhibiteurs de BACE1 vers le site de clivage de APPswe (mutation suédoise) se produit avant qu'il n'atteigne la membrane plasmique, tandis que APPwt (type sauvage) est traité dans un endosome précoce provenant de la surface cellulaire. Par conséquent, BACE1 qui clive APPwt est parfois lié à l'inhibiteur de BACE1 à la surface de la cellule avant le traitement de l'APP, cependant, l'enzyme qui traite APPswe ne l'est pas [30]. C'est pour cette raison que la localisation aberrante du traitement APPswe pourrait réduire considérablement la puissance de la quercétine et de la rutine en tant qu'inhibiteurs de BACE1. Ainsi, nous sommes plus enclins à soutenir que la diminution de l'activité BACE dans ce modèle in vivo n'est pas tant due à l'inhibition de l'enzyme mais à l'augmentation du rapport GSH/GSSG. Dans tous les cas, l'activité réduite de BACE1 pourrait être interprétée comme une tentative putative de réduire la production d'amyloïde chez les souris TgAPP. Quant à l'effet le plus remarquable de la quercétine et de la rutine dans l'hippocampe sur l'atténuation de l'activité de BACE1, il convient de noter que le cortex a une densité de neurones significativement plus élevée que l'hippocampe [31], et une altération sélective du protéasome dans le phénotype pathologique de la MA rend le cortex plus vulnérable et atteint que l'hippocampe [32].

Après avoir déterminé l'effet des traitements sur l'activité de l'enzyme BACE1, nous nous sommes intéressés à évaluer son expression. Curieusement, aucune différence significative dans l'expression de BACE1 n'a été trouvée entre les souris TgAPP par rapport aux souris WT, et aucun changement notable n'a été observé avec le traitement à la quercétine ou à la rutine. Il semble donc que l'augmentation de l'activité de l'enzyme BACE1 ne soit pas associée à une augmentation de l'expression. Dans ce contexte, il est remarquable qu'Apelt et al. [14] ont trouvé une augmentation de l'activité corticale de BACE1 chez des souris Tg2576 âgées de 9 à 13 mois alors que le niveau d'expression de la protéine BACE1 et de l'ARNm ne changeait pas avec l'âge. En outre, des preuves ont été trouvées soutenant que l'amyloïde fibrillaire A 1–42., plutôt que l'amyloïde soluble A 1–42, peut réguler à la hausse l'expression de la protéine BACE1, et donc de petites modifications du rapport des isoformes amyloïdes peuvent moduler les conformations des agrégats amyloïdes et les dommages cellulaires [ 33]. Ainsi, l'absence de changement dans l'expression de BACE1 lors d'une augmentation de son activité que nous avons trouvée peut expliquer la prévalence de l'amyloïde soluble A 1–42 par rapport à l'isoforme amyloïde fibrillaire A 1–42 dans notre modèle de souris TgAPP.

Suite à la détermination de l'expression génique des enzymes impliquées dans le traitement de l'APP, nous avons évalué l'effet de la quercétine et de la rutine sur l'enzyme -sécrétase impliquée dans le traitement non amyloïdogène de l'APP. Nous nous sommes concentrés sur ADAM10 car il s'agit de l'isoforme constitutive physiologiquement la plus importante de la -sécrétase. ADAM10 contrecarre la génération de plaques A oligomères neurotoxiques via le clivage de l'APP dans le domaine A pour produire des fragments sAPP et C-terminaux (-CTF) [34,35]. Bien que les changements dans l'expression d'ADAM10 trouvés dans notre étude ne soient pas statistiquement significatifs, une légère diminution de l'expression d'ADAM10 a été observée chez les souris TgAPP par rapport aux souris WT. De manière prédominante, le traitement à la rutine a montré une tendance à augmenter l'expression du gène ADAM10 dans les deux zones cérébrales étudiées. Postine et al. [36] ont montré que la régulation à la hausse de l'ADAM10 de type sauvage dans l'hippocampe d'un modèle de souris AD médiait la sécrétion de sAPP, conduisant à l'inhibition de la génération de plaques A. L'effet de la quercétine a été étudié dans un modèle de rat AD induit par le chlorure d'aluminium montrant une amélioration significative de la -sécrétase (ADAM10 et ADAM17) dans l'hippocampe par rapport à ceux non traités. Cela indique que la quercétine possède le potentiel d'augmenter la voie non amyloïdogène par l'activation des gènes de la -sécrétase [37]. Les données précliniques renforcent l'hypothèse selon laquelle l'amélioration des niveaux de sAPP dans le cerveau est une stratégie potentielle pour améliorer les symptômes liés à la MA et atténuer les déficits synaptiques. ADAM10 et BACE1 sont en compétition pour le clivage APP, donc la potentialisation de l'activité ADAM10 pourrait inhiber la génération d'amyloïde neurotoxique. De plus, sAPP peut empêcher l'activation de la voie de signalisation du stress JNK, conduisant à l'activation de l'activité de phosphorylation induite par NF-κB, ce qui conduit à la dégradation du protéasome [38]. Par conséquent, la formation et l'accumulation d'agrégats de protéines liées à la maladie sont considérablement réduites et l'activité du protéasome cellulaire est améliorée, fournissant ainsi la preuve d'une fonction de sAPP dans la régulation de la protéostase [39]. De plus, il a été démontré que la sAPP régule spécifiquement à la hausse la synthèse des récepteurs AMPA du glutamate et son trafic [40]. Dans notre étude, nous avons exploré si la légère augmentation de l'expression d'ADAM10 lors du traitement à la rutine exerce une certaine influence sur la transmission synaptique glutamatergique. Comme indiqué dans la section Données supplémentaires, aucun effet significatif sur l'expression de ce récepteur ionotrope n'a été observé sur les régimes de quercétine et de rutine, peut-être en raison d'une faible augmentation de l'expression d'ADAM10, qui n'est pas suffisante pour la régulation à la hausse du récepteur AMPA (Données supplémentaires , figure S2 et tableau S5).

Il faut tenir compte du fait que des études in vitro ont montré une grande variété de substrats ADAM10 [41], et par conséquent, des effets indésirables obtenus par un ciblage ADAM10-non spécifique pourraient être trouvés dans la prolifération du cancer, l'adhésion cellulaire, la promotion des précurseurs des lymphocytes T/NK et de l'inflammation, etc. [42]. Pour contourner cette contrainte, notre étude propose une stratégie visant à favoriser plus physiologiquement la libération de sAPP. Cette approche pourrait être basée sur un apport à long terme d'un ingrédient actif (quercétine ou rutine), qui est consommé par le biais d'une alimentation humaine saine. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour savoir si l'augmentation d'ADAM10 est dose-dépendante des flavonoïdes et si les effets bénéfiques potentiels l'emportent sur les effets secondaires putatifs.

En ce qui concerne l'expression d'APPswe, bien que l'insertion du transgène APP humain dans le génome de la souris garantisse que APPswe est surexprimé dès la naissance, il a été rapporté que les niveaux d'ARNm et de protéines hippocampiques d'APP montrent des fluctuations importantes au cours du développement animal, étant maximaux lorsque les souris sont asymptomatique (1- mois) et diminue lorsque la symptomatologie complète apparaît [43]. Malgré ce problème, l'expression de l'APP à la fois dans le cortex et l'hippocampe était significativement plus élevée par rapport à celle des souris WT dans notre étude. Un traitement supplémentaire avec de la quercétine ou de la rutine a pu réduire considérablement cette expression chez les souris mâles et femelles, dans les deux régions du cerveau. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par Augustin et al. [44] qui ont étudié un extrait standardisé de Ginkgo biloba (Egb761), riche en flavonols tels que la quercétine, chez des souris femelles TgAPP âgées de 4- mois, et ont constaté une diminution des taux d'ARNm et de protéines APP. Compte tenu du fait que la régulation à la hausse de la traduction de l'APP chez les souris Tg2576 se produit dans les stades prodromiques et symptomatiques précoces [45], il est probable que la restauration de la traduction de l'APP par la quercétine ou la rutine ait pu avoir lieu chez nos souris TgAPP et, probablement, dans un stade précoce. stade symptomatique, entraînant une réduction des niveaux corticaux et hippocampiques de l'APP, de l'activité BACE1 et de l'activation de la caspase-3.

De plus, il a été rapporté ailleurs que chez les souris Tg2576 (en l'absence de perte neuronale), il y a une augmentation de l'activation de la caspase -3 dans l'hippocampe [46], comme cela a été constaté dans notre étude, au début des troubles de la mémoire , ainsi qu'une réduction des épines dendritiques avant le dépôt d'amyloïde extracellulaire [46]. Il existe des preuves à l'appui des rôles non apoptotiques des caspases dans le système nerveux sans mort neuronale [47], et l'activité de la caspase -3 a été localisée dans les épines dendritiques où elle peut élever les niveaux de calcineurine. À son tour, on pense que la déphosphorylation de la sous-unité GluR1 des récepteurs de type AMPA, déclenchée par la calcineurine, entraîne un dysfonctionnement post-synaptique. Nos valeurs d'expression de la caspase-3, conséquence de la transgenèse, sont en accord avec celles obtenues par d'autres chercheurs qui ont rapporté une augmentation de l'expression de la caspase-3 au niveau des épines dendritiques dans l'hippocampe des souris TgAPP [48]. Étant donné que l'APP contient trois sites de clivage distincts pour la caspase-3 dans sa séquence d'acides aminés, dont deux sont situés au niveau du domaine extracellulaire et un dans la partie C-terminale intracellulaire de la queue de l'APP [49], l'hydrolyse de l'APP par la caspase-3 peut altérer le traitement protéolytique de l'APP en faveur de la voie amyloïdogénique [50], conduisant à la libération d'un peptide cytotoxique dérivé du C-terminal de 31 acides aminés de long (C31), pour exemple [51]. Cela suggère que, puisque la caspase -3 peut médier l'amplification de la libération de fragments toxiques de l'APP, la diminution de l'expression de la caspase -3 par la quercétine ou la rutine peut permettre la clairance des protéines agrégées. De plus, comme mentionné précédemment, nous avons exploré l'influence de l'augmentation et de la diminution de l'expression de la caspase-3 dans la transmission synaptique glutamatergique, sur la base de la capacité de la caspase activée par la calcineurine-3 à déphosphoryler la sous-unité GluR1 des récepteurs AMPA au niveau postsynaptique. Ces modifications moléculaires altèrent la transmission synaptique glutamatergique et la plasticité neuronale au niveau des épines dendritiques de l'hippocampe [48]. Théoriquement, l'inhibition pharmacologique de l'activité caspase-3 chez les souris TgAPP pourrait sauver les phénotypes de type AD d'un mécanisme qui entraîne une défaillance synaptique. Cependant, malgré l'augmentation de l'expression de la caspase -3 chez notre souris TgAPP, nous n'avons trouvé aucune différence significative dans l'expression du récepteur AMPA par rapport à celle des souris WT, comme mentionné précédemment. Il se peut que les modifications de l'expression de la caspase -3 ne soient pas suffisamment importantes pour produire des modifications significatives de l'expression du récepteur AMPA (Données supplémentaires, Figure S2 et Tableau S5).

En ce qui concerne les valeurs d'expression de la caspase-6, aucune différence significative n'a été trouvée entre les souris TgAPP et WT. L'activation de la caspase -6 a été identifiée comme un médiateur important du stress neuronal qui clive d'importantes protéines du cytosquelette (Tau et -tubuline), perturbant ainsi la dégradation ubiquitine-protéasome des protéines mal repliées, et plusieurs densités post-synaptiques régulant l'actine protéines [52]. L'expression inchangée de la caspase -6 dans notre étude concorde avec l'absence de signes caractéristiques de neurodégénérescence à l'âge auquel ces souris transgéniques ont été évaluées, par rapport aux souris WT (Données supplémentaires, Figure S1).

Une augmentation marquée des médiateurs neuro-inflammatoires a été observée chez les patients atteints de MA, principalement autour des plaques séniles [53–55]. Les astrocytes sont le principal fournisseur de GSH pour la microglie et les neurones. Au cours de l'inflammation chronique et du stress oxydatif, les astrocytes libèrent des médiateurs inflammatoires toxiques et des radicaux libres, accélérant l'activation de la microglie et la neurodégénérescence [56]. Il convient de noter que la diminution du glutathion intracellulaire est liée à l'activation des voies inflammatoires, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-κB, dans la microglie humaine et les astrocytes [57]. À cet égard, nous avons décidé de quantifier les niveaux d'IL-1, d'IFN- et de TNF- dans notre modèle animal et de déterminer l'effet de la quercétine et de la rutine sur eux. Comme on le sait, l'inflammation favorise le traitement défectueux du peptide A et de l'APP, favorisant l'agrégation du peptide A et modifiant à son tour la réactivité A [58]. Ainsi, dans notre étude, nous avons observé que les souris TgAPP avaient des taux d'ARNm accrus des médiateurs pro-inflammatoires IL -1 , TNF- et IFN- , par rapport aux souris WT, montrant que la surexpression d'APPs pourrait induire des cascades neuro-inflammatoires déclenchant une série de voies moléculaires dans la glie et les neurones, qui activeraient la réponse inflammatoire. La quercétine et la rutine ont pu atténuer l'expression du gène IL-1 chez les hommes et les femmes et dans les zones cérébrales étudiées. Plusieurs preuves soutiennent l'effet anti-inflammatoire exercé par la quercétine au niveau du SNC, car elle pourrait inhiber l'activation de facteurs de transcription tels que le facteur nucléaire-kappa B (NF-κB) [59], impliqué dans l'induction d'iNOS, et par conséquent, diminuez la libération de médiateurs tels que IL-1 , TNF- et IFN- [60]. En ce qui concerne l'impact du GSH sur la réponse inflammatoire, il convient de noter que le GSH est impliqué dans le maintien de niveaux optimaux de cytokines de telle sorte que l'expression de cytokines pro-inflammatoires (TNF- , IL-1 et IL -6) sont augmentés en raison de la déplétion en GSH, tandis que l'expression des cytokines anti-inflammatoires (c'est-à-dire IL-10) est restée inchangée. Cette altération de l'homéostasie du GSH se produit en raison d'une régulation positive des voies de signalisation NF-κB et JNK qui pourraient être la voie apoptotique possible vers la mort des cellules neuronales [61]. Dans notre étude, la régulation à la baisse de NF-κB par la quercétine et la rutine pourrait être un mécanisme plausible pour récupérer l'homéostasie GSH/GSSG et donc la cause de l'équilibre entre les cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Enfin, puisque le promoteur BACE1 a un site de liaison NF-κB, l'activation induite par l'inflammation de NF-κB facilite la régulation à la hausse de l'expression de BACE1 et augmente par la suite la production d'A [62]. Ainsi, si une régulation négative de NF-κB se produit lors de régimes de quercétine et de rutine, l'activité de BACE1 diminuerait en raison de la régulation de la libération de cytokines pro-inflammatoires et non anti-inflammatoires.

4. Matériel et méthodes

4.1. Animaux d'expérimentation

Une souris transgénique (Tg2576, B6 ; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) qui exprime la double mutation suédoise de la protéine précurseur amyloïde humaine (hAPP) a été utilisée comme modèle animal de la MA expérimentale [14]. La souris est une lignée hétérozygote knock-in qui exprime l'isoforme humaine A PP695 avec la double mutation suédoise (K670N/M671L ; Lys670→Asn et Met671→Leu) sous le contrôle du promoteur de la protéine prion du hamster [63]. En conséquence, cette souris présente des niveaux de protéine précurseur de l'amyloïde humaine (A PP), six fois supérieurs à ceux d'une souris. De plus, cette souris montre des niveaux plus élevés d'A 40 et d'A 42. Les dépôts d'A commencent à l'âge de 9 mois [63]. Dans l'hippocampe et le cortex Tg2576, l'expression du transgène APPswe est principalement neuronale [64].

Comme contrôle négatif, des souris de type sauvage (WT) de la même colonie [65, 66] ont été utilisées. La colonie de souris Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) a été développée dans notre laboratoire à partir de mâles hétérozygotes Tg2576 et de femelles de type sauvage. Les parents transgéniques ont été donnés par le Dr Diana Frechilla de la Division des neurosciences du Centre de recherche médicale appliquée de l'Université de Navarre (Pampelune, Espagne) [67].

Les animaux ont été logés dans des cages ventilées individuellement et maintenus à 22–24 ◦C sur un cycle 12-h lumière/obscurité dans une humidité de 50–60 %. Les protocoles pour les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Complutense de Madrid et étaient pleinement conformes à la directive européenne 2010/63/sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et à la législation espagnole sur le bien-être animal ( Décret royal 53/2013, 1er février 2013).

4.2. Analyses de génotypage de souris

La transgénicité a été déterminée dans les 30 jours suivant la naissance par biopsie de la queue. Des analyses de génotypage des animaux ont été réalisées par PCR. Considérant que Tg2576 (TgAPP) est une lignée hétérozygote, le gène d'insertion (PrP, de la protéine prion) a été utilisé comme témoin de réaction positif. L'ADN génomique a été extrait des queues de souris digérées avec la protéinase K (0.1 µg/µL) dans un tampon NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 % de gélatine, 0,45 % de NP-40 et 0,4 % de Tween 20) à 56 °C pendant 3 h et agité. Les fragments d'ADN ont été précipités avec de l'isopropanol et lavés avec de l'éthanol à 70 %. Les précipités d'ADN ont été dissous dans 30 µL de tampon TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). La pureté et la concentration d'ADN ont été déterminées à 260 et 280 nm.

Les gènes PrP et APP ont été amplifiés par PCR. Les séquences d'amorces utilisées pour cribler les souris transgéniques étaient les suivantes : PrP sens : CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG ; PrP inverse : GTGGATACCCCTCCCCCAGCCTAGACC ; APP inverse : CCAGATTCCTGAAGTGAAGATGGATG. Les étapes de la réaction PCR ont été les suivantes : dénaturation à 94 ◦C pendant 90 s, 39 cycles à 60 ◦C pendant 60 s et 72 ◦C pendant 90 s, puis extension finale à 72 ◦C pendant 7 min.

Dans tous les cas, des témoins négatifs (sans moisissure ADN) et des témoins positifs du gène APP ont été considérés. Les produits de PCR obtenus ont été séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose à 1,5 % dans un tampon 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) à 70 V (tension constante), puis imagés par coloration avec Gel Red (Millipore).

4.3. Traitements pour animaux

Des souris TgAPP et des compagnons de portée de type sauvage, tous deux âgés de 6 à 7 semaines avec un poids corporel initial de 16,2 ± 0,8 g, ont été randomisés dans les quatre groupes suivants (n=8/groupe) : ( a) TgAPP non traitée ; (b) TgAPP traitée à la quercétine; (c) TgAPP traitée à la rutine ; et (d) type sauvage non traité. Puisque les souris mâles et femelles ont été étudiées, deux ensembles de groupes ont été établis. A l'âge de 45 semaines, les souris ont commencé à être traitées avec de la quercétine ou de la rutine pendant 4 semaines.

La quercétine (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavone) et l'hydrate de rutine (quercétine-3-O-rutinoside hydraté) étaient supérieurs ou égaux à 95 % purs et achetés chez Sigma-Aldrich. Chacun des flavonoïdes a été incorporé dans un régime standard (Harlan Ibérica, Barcelone, Espagne) à une concentration de 200 ppm, correspondant à un apport de 30 mg de flavonoïde/kg de poids corporel/jour. Les souris non traitées ont reçu exclusivement le régime standard non supplémenté. Les régimes et l'eau ont été fournis pour une consommation ad libitum.

4.4. Préparation des tissus cérébraux pour les analyses biochimiques et histologiques

À la fin du traitement, les souris ont été mises à jeun toute la nuit, elles ont été euthanasiées par dislocation cervicale et le cerveau entier a été rapidement retiré. Le cerveau a été rincé dans une solution saline à 4 ◦C et la membrane arachnoïdienne a été soigneusement retirée. Ensuite, l'hippocampe et le cortex ont été isolés. Les échantillons ont été immédiatement stockés à -80 ◦C jusqu'à leur utilisation ultérieure.

Les cerveaux entiers de certains animaux ont été utilisés pour l'obtention de coupes histologiques, pour lesquelles, une fois euthanasiés par dislocation cervicale, les cerveaux ont été congelés par immersion dans l'isopentane à -80 ◦C. Immédiatement après, des coupes coronales du cerveau (30 µm d'épaisseur) ont été réalisées du bulbe olfactif au cervelet, espacées de 120 µm dans un cryostat (Leica CM1850, Nussloch, Allemagne). L'ensemble de la procédure a été réalisée à -20 ◦C. Les coupes histologiques ont été collectées sur des lames et conservées à -80 ° C jusqu'à l'analyse (voir méthodes supplémentaires).

4.5. Glutathion

Pour les tests de glutathion, des échantillons de cortex cérébral et d'hippocampe ont été homogénéisés dans un tampon d'extinction redox-5 % d'acide trichlorure acétique (RQB-5 % de TCA) (précédemment barboté avec du N2 pendant 15 min sur de la glace) à une concentration de 25 mg/mL (p/v). Les échantillons ont été remis en suspension par sonication pendant 10 s, puis centrifugés à 12,000× g pendant 10 min à 4 ◦C, et les surnageants ont été collectés.

Ensuite, dans le surnageant obtenu, des méthodes spectrofluorimétriques ont été adoptées pour déterminer les niveaux de GSH et de GSSG en utilisant la méthode à l'o-phtalaldéhyde, décrite par Senft et al. [68]. Les valeurs de GSH et de GSSG ont été corrigées pour la réaction spontanée en l'absence d'échantillon biologique. Dans les deux cas, les surnageants ont été incubés pendant 30 min à température ambiante et ensuite, la fluorescence a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Bade-Wurtemberg, Allemagne), avec le filtre d'excitation réglé à 360 nm (bande passante 5 nm) et le filtre d'émission fixé à 460 nm (bande passante 5 nm). La concentration de GSH et de GSSG dans chaque échantillon a été interpolée à partir des normes connues de GSH. Les concentrations de GSH et de GSSG ont été exprimées en nmol de GSH/mg de protéine, ce qui a permis le calcul du rapport redox du glutathion GSH/GSSG.

Les pastilles restantes ont été vortexées jusqu'à dissolution complète dans 240 µL de NaOH 0,1 M pour mesurer la concentration en protéines par la méthode de l'acide bicinchoninique (BCA), en utilisant l'albumine de sérum bovin comme étalon.

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