Les cellules rénales adhérentes et en suspension de bébé hamster ont un répertoire de cytosquelette et de récepteurs de surface différent

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Veronika Aneth¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Bière Martin¹, Michael EschbaumerID^1*

Résumé

Culture de cellules animales, avec des cellules individuelles poussant danssuspension, idéalement dans un environnement chimiquement défini, est un pilier de la production biopharmaceutique. L'environnement synthétique manque de facteurs de croissance exogènes et nécessite généralement un processus d'adaptation chronophage pour sélectionner des clones cellulaires qui prolifèrent danssuspensionà un nombre élevé de cellules. Les mécanismes moléculaires qui facilitent l'adaptation et qui se déroulent à l'intérieur de la cellule sont largement inconnus. En particulier pour les lignées cellulaires qui sont utilisées pour la production d'antigènes viraux telles que les cellules de rein de bébé hamster (BHK), la restriction de la croissance virale par l'évolution de caractéristiques cellulaires indésirables est hautement indésirable. La comparaison entre les cellules BHK en croissance adhérente et les cellules en suspension avec différentssusceptibilitéau virus de la fièvre aphteuse a révélé des différences dans l'expression des récepteurs cellulaires tels que les intégrines et les héparanes sulfates et dans l'organisation du cytosquelette d'actine. Analyses et croissance du transcriptomecinétiqueont démontré la diversité des lignées cellulaires BHK et confirmé l'importance de clones de cellules parentales bien caractérisés et d'un dépistage conscient pour s'assurer que les caractéristiques cellulaires essentielles ne se perdent pas pendant l'adaptation.

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1. Introduction

La technologie de culture de cellules animales a d'abord été utilisée pour la production d'antigènes viraux dans la production de vaccins, mais plus récemment, les plates-formes de production de bactéries ou de levures pour les protéines recombinantes ont également été remplacées par des systèmes cellulaires de mammifères [1, 2]. Les cellules de rein de bébé hamster (BHK), dérivées du hamster doré syrien (Mesocricetus auratus), sont importantes dans les deux contextes. À l'origine, les cellules BHK étaient une lignée cellulaire de mammifère à croissance adhérente et dépendante de l'ancrage avec un schéma de croissance des fibroblastes dans des conditions de culture cellulaire standard, y compris le sérum bovin fœtal (FBS) [3, 4]. L'adaptation des cellules BHK adhérentes àsuspensionla croissance dans des milieux sans sérum combinée à des conditions de culture à grande échelle est une réussite pour la production de protéines recombinantes (par exemple, le facteur VIII) avec des rendements élevés [1, 2]. De plus, les cellules BHK sont sensibles à un large éventail de virus, y compris le virus de la fièvre aphteuse (FMD) [5]. Pour répondre à la demande croissante de vaccins contre la fièvre aphteuse dans de nombreuses régions du monde, de grandes quantités d'antigènes doivent être produites à moindre coût, ce qui est réalisable en augmentant les densités cellulaires viables du côté cellulaire et en diminuant les coûts grâce à la simplification du traitement en amont et en aval. de l'antigène côté production [6]. Les milieux sans composants animaux (ACFM) réduisent le risque de contamination par des agents adventices et simplifient en outre le processus lorsqu'aucun sérum ne doit être supplémenté [6, 7]. Cependant, l'adaptation des cellules à croître en suspension sans sérum et en ACFM est un processus long et graduel [6, 8]. Les cellules BHK atteignent facilement des densités cellulaires de 3,5 × 106 cellules/mL en suspension mais l'adaptation comporte toujours le risque de faire évoluer des propriétés cellulaires indésirables par rapport à la population de départ, ce qui peut entraîner de mauvaises performances de croissance, des rendements cellulaires insuffisants ou des actifs tumorigènes. [5, 7]. À leur tour, les modifications des cellules peuvent entraîner des variantes virales inattendues au cours du processus d'adaptation culturelle. En particulier pour la production d'antigènes vaccinaux, une modification des caractéristiques et de l'antigénicité du virus est hautement indésirable. Les cellules BHK diffèrent déjà par leur sensibilité et leur capacité à propager certaines souches virales du FMDV [9]. De toute évidence, le passage d'une croissance fibroblastique dépendante de l'ancrage via l'agrégation et la formation de sphéroïdes à des cellules se développant indépendamment en suspension s'accompagnera de modifications importantes de la cellule elle-même [4, 6]. La perte de signalisation des intégrines due à l'interruption du contact matrice-cellule extracellulaire entraîne des modifications de l'expression des protéines membranaires et de l'organisation du cytosquelette d'actine qui est un récepteur important de la signalisation médiée par les intégrines [6, 10]. Dans le même temps, ces intégrines jouent un rôle important dans l'infection par le FMDV car elles sont le récepteur du FMDV chez l'hôte naturel et le récepteur primaire en culture cellulaire [11].

Une compréhension plus approfondie des différences cellulaires entre les cellules HK à croissance adhérente et les cellules danssuspensionouvrira de nouvelles possibilités pour l'ingénierie cellulaire et simplifiera la sélection de clones cellulaires appropriés pour la production d'antigènes vaccinaux.

Dans cette étude, des cellules BHK en croissance adhérente et des cellules adaptées à l'ACFMsuspensionLes cellules BHK ont été examinées en ce qui concerne l'expression de récepteurs cellulaires tels que les intégrines et les héparanes sulfates (HS), leur capacité à présenter des protéines à la surface cellulaire et l'organisation du squelette d'actine cellulaire. Les analyses du transcriptome et la cinétique de croissance renseignent sur la diversité des lignées cellulaires BHK testées.

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2. Matériels et méthodes

2.1 Lignées cellulaires et culture cellulaire

Les principales lignées cellulaires utilisées étaient deux dérivés adhérents du clone 13 de BHK-21 (de l'American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, détenus sous les noms CCLV-RIE 164 et 179 dans la Collection of Cell Lines in Veterinary Medicine , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Allemagne ; en bref : BHK164 ou BHK179) et lesuspensionlignées cellulaires BHK21C13-2P (BHK-2P) fournies par la Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées (ECACC ; 84111301) et BHK-InVitrus (BHK-InV, également appelée « lignée #8 » comme dans notre publication précédente [12] ; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

Pour la cinétique de croissance, les lignées cellulaires suivantes ont été utilisées en plus : BHK-2P maintenu soit dans le milieu essentiel minimal de Glasgow (GMEM) avec 10 % de FBS (« lignée n° 2 ») ou adapté à l'ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) dans deux processus différents (lignes #4 et #5), plus quatre autressuspensionlignées cellulaires : BHK21C13 adaptées à la croissancesuspensionpar le retrait progressif du sérum (lignée #3), du BHK21-C (lignée #6), du BHK21-Hektor (lignée #7) et du BHK de production (lignée #9) [12]. Toutes ces cellules ont été fournies par Merck KGaA.

Toutes les cellules BHK-21 utilisées dans l'étude sont finalement dérivées de la lignée cellulaire BHK-21 clone 13 de Macpherson et Stoker [13]. Le terme "lignée cellulaire" est utilisé au sens large ; les onze lignées BHK-21 décrites dans la présente étude ne sont pas toutes des lignées cellulaires vraiment distinctes plutôt que des dérivés cultivés dans des conditions différentes. Pour une référence plus facile, la numérotation des lignes est cohérente avec la numérotation de notre publication précédente [12].

La lignée cellulaire #1 de la publication précédente n'a pas été incluse dans la présente étude et ce numéro n'est donc pas utilisé. Au lieu de cela, toute référence aux cellules BHK-2P qui ne mentionnent pas les numéros de ligne #2, #4 ou #5 est au principalsuspensionlignée cellulaire BHK21C13-2P (ECACC84111301) présentée au début de cette section.

Les lignées cellulaires adhérentes CHO-K1 (ATCCCCL-61, détenues sous le nom de CCLV-RIE 134) et CHO677 (CRL 2244, détenues sous le nom de CCLV-RIE 1524) ainsi que IB-RS Des cellules -2 (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2, détenues sous le nom de CCLV-RIE 103) et des cellules rénales bovines Madin-Darby (en abrégé : MDBK, détenues sous le nom de CCLV-RIE261) ont été utilisées comme témoins dans des expériences de cytométrie en flux.

Les conditions de culture étaient de 37 °C, 5 % de CO2, et poursuspensioncellules à 320 tr/min dans des bioréacteurs TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suisse) à 80 % d'humidité relative. Toutes les lignées cellulaires adhérentes ont été cultivées dans du milieu minimum essentiel de Eagle (MEM) additionné de sels de Hanks et Earle (Sigma-Aldrich) avec 10 % de FBS. Toutes les lignées cellulaires en suspension ont été adaptées pour croître dans le milieu Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA) à l'exception de la lignée cellulaire #2, qui a été cultivée comme décrit ci-dessus.

Les mesures de densité et de viabilité cellulaires ont été effectuées à l'aide de bleu trypan (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) et d'un compteur de cellules automatique (modèle TC20, Bio-Rad).

2.2 Analyse de la courbe de croissance des cellules en suspension

Les analyses des courbes de croissance ont été effectuées sous forme d'expériences par lots, réalisées en double, deux fois individuellement, avec une densité d'ensemencement de 0.6×106 cellules/mL. La densité cellulaire viable (VCD) et la viabilité en pourcentage ont été mesurées quotidiennement jusqu'à six jours après l'inoculation cellulaire.

Les calculs spécifiques à la cellule ont été effectués selon les équations données par [14] :

X : VCD (par ml) ; t : instants d'échantillonnage (heure) ; n et n-1 : deux points d'échantillonnage consécutifs.

Numéro de division cellulaire (cd):

2.3 Cytométrie en flux

Des analyses de cytométrie en flux ont été effectuées à l'aide de l'instrument de cytométrie en flux FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, Royaume-Uni). Les débris cellulaires ont été bloqués sur la base des modèles de diffusion vers l'avant et sur les côtés. Pour la coloration à l'actine, l'intensité de fluorescence médiane dans le canal Alexa 488 a été mesurée directement. Pour toutes les taches d'anticorps, le pourcentage de cellules Alexa 488 ou PE-positives a été déterminé avec une porte d'intervalle dont la limite inférieure a été définie sur la base d'un contrôle d'isotype. Toutes les expériences ont été réalisées trois fois indépendamment.

2.3.1 Coloration par anticorps des récepteurs de surface cellulaire.

surface. Les cellules MDBK ont servi de contrôle positif pour l'expression de v 3, les cellules IB-RS-2 ont servi de contrôle positif pour l'expression de v 8 et les cellules CHO-K1 ont servi de contrôle positif pour l'expression de HS . Les cellules CHO677 n'expriment aucune des intégrines testées ni HS et ont donc servi de contrôle négatif dans toutes les expériences. Les anticorps suivants ont été utilisés : pour v 3, clone LM609 conjugué à la PE (dilution 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA) ; pour v 8, anticorps primaire 11E8, clone 68, souris IgG2a (dilution 1:100) (aimablement fourni par le Dr StephenNishimura) avec anticorps secondaire chèvre anti-souris IgG2a (dilution 1:1000) conjugué avec Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); pour HS, clone 10E4, IgM de souris (dilution 1:200)(Amsbio, Abingdon, Royaume-Uni) avec anticorps secondaire chaîne mu d'IgM de chèvre anti-souris (dilution1:2000) conjugué avec Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) . Un seul anticorps primaire a été utilisé dans chaque expérience.

Les cellules en suspension ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les cellules adhérentes ont été détachées à l'aide d'EDTA 1 0 mM dans du PBS, puis lavées avec du PBS. Après lavage, les cellules ont été filtrées à travers une passoire cellulaire (maille en nylon, diamètre de pores de 70 μm, VWR, Radnor, États-Unis) pour éliminer les amas de cellules et ont été ajustées à 1 × 106 cellules/mL avant 1 μL de LIVE/ Le colorant DEAD FixableViolet pour cellules mortes (Thermo Fisher Scientific) a été ajouté à 1 ml de suspension cellulaire pendant 30 minutes. Cette étape et toutes les étapes suivantes ont été réalisées à l'abri de la lumière et à 4°C. L'anticorps primaire a été incubé pendant 30 minutes et l'anticorps secondaire a été incubé pendant 20 à 30 minutes. Une étape de lavage avec 2 ml de tampon FACS (PBS, 0,1 % d'azide de sodium, 0,1 % de BSA) et une centrifugation à 300 × g, 5 min, 4 °C ont été effectuées après toutes les étapes. Enfin, les cellules colorées ont été remises en suspension dans 300 μL de tampon FACS.

2.3.2 Coloration à l'actine.

L'actine filamenteuse a été colorée à l'aide du réactif Phalloidin-iFluor 488 (ab176753, Abcam), préparé conformément à la fiche technique. Les cellules BHK179, BHK-2P et BHK-InV ont été détachées comme décrit ci-dessus et fixées avec 4 % de formaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante (TA). Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et 1 × 106 cellules fixées ont été perméabilisées avec 0, 1% de Triton X -100 (Sigma-Aldrich) dans du PBS, suivi d'une incubation à température ambiante pendant 3 minutes. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS (centrifugation à 300 × g, 5 min) avant d'ajouter la solution mère de phalloïdine préparée, diluée au 1: 1000 dans du tampon FACS et incubées pendant 20 min à TA. Enfin, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon FACS et ont été remises en suspension dans un tampon FACS de 300 μL. Les cellules colorées ont été analysées directement avec un microscope à fluorescence et utilisées pour l'analyse FACS.

2.3.3 Expériences de transfection.

Les cellules BHK164 et BHK-2P ont été transfectées soit avec EGFP-N1, un plasmide exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) (Clontech), soit dans une autre série d'expériences avec pVSV-G, un plasmide exprimant la protéine G de la protéine vésiculaire virus de la stomatite Indiana (VSV), en utilisant la Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) selon les instructions du fabricant. En bref, 2 ug d'ADN plasmidique et 1,875 μL ou 3,75 μL de lipofectamine diluée dans du milieu Cellvento™ BHK200 ont été mélangés et incubés à température ambiante pendant 20 min pour permettre la formation du complexe. Ensuite, ces mélanges ont été transférés dans des cellules dans des plaques à puits 12- (environ 4 × 105 cellules/mL) et le milieu a été ajouté jusqu'à 200 μL. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 24h.

Pour l'analyse FACS, tout le contenu des puits a été récolté après 24 h. Les cellules transfectées par pEGFP ont été lavées trois fois avec du PBS et remises en suspension dans un tampon FACS de 300 μL. Un duplicata de cellules transfectées par pVSV-G a été perméabilisé avec du PBS avec 0, 1% (v / v) de TritonX -100 pendant 5 min à température ambiante avant la coloration des anticorps, tandis que l'autre est resté non perméabilisé. La coloration des anticorps a été réalisée comme décrit ci-dessus avec du sérum polyclonal de lapin VSV 274/E (dilution 1:500, gracieusement fourni par le Dr Stefan Finke) et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin (H plus L) conjugué avec Alexa Fluor 488 (dilution 1 : 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Analyse statistique

Les données ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism version 07.04 pour Windows (GraphPad Software, La Jolla, États-Unis). Une analyse de variance unidirectionnelle ordinaire a été effectuée avec le post-test le plus chaud de Tukey pour évaluer les différences entre les groupes de traitement. Le seuil de signification statistique a été fixé à une valeur p de 0,001.

2.5 Analyse du transcriptome

2.5.1 Extraction d'ARN, préparation de la bibliothèque et séquençage.

Trois lots indépendants de chacune des lignées cellulaires BHK179 adhérentes et des lignées cellulaires en suspension BHK-2P et BHK-InV ont été utilisés pour l'analyse du transcriptome. En moyenne, 8,3 × 105 cellules BHK179, 1,6 × 107 cellules BHK-2P et 1,4 × 107 cellules BHK-InV ont été lysées dans le réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific). Après addition de 0,2 volume de trichlorométhane au lysat cellulaire, incubation et centrifugation, la phase aqueuse a été recueillie et mélangée avec un volume d'éthanol à 100 %. À partir de là, l'ARN total a été extrait à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) avec digestion à la DNase sur colonne avec le kit de DNase sans RNase (Qiagen) en suivant les instructions du fabricant. Le mélange ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) a été ajouté et utilisé comme contrôle interne pour toutes les étapes suivantes. Ensuite, l'ARNm polyadénylé a été isolé à partir de 1 à 3 ug d'ARN total de haute qualité à l'aide du kit Dynabeads mRNA DIRECT Micro (ThermoFisher Scientific). L'ARNm a ensuite été fragmenté et utilisé pour la synthèse d'ADNc et la préparation de bibliothèques à l'aide du kit de préparation d'échantillons TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina, San Diego, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. Le séquençage a été réalisé au Heinrich-Pette-Institut, Hambourg, en utilisant les équipements NextSeq 500 (2x75 bp) et HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina).

2.5.2 Analyse statistique de l'expression différentielle des gènes.

Un contrôle de la qualité des lectures brutes de chaque bibliothèque de séquençage a été effectué à l'aide de FastQC (version {{0}}.11.9 ; Babraham Institute, Cambridge, Royaume-Uni) en mettant l'accent sur la distribution de la longueur de lecture et la contamination de l'adaptateur avant et après l'adaptateur découpage à l'aide de Trim Galore (version 0.6.4_dev, Babraham Institute) et Cutadapt (version 2.10) [15]. En utilisant Salmon [16], les lectures brutes coupées ont ensuite été quasi-cartographiées sur le génome du hamster doré syrien.

En bref, les références génomiques et de transcription de GCF{{0}}.1_MesAur1.0 ont été obtenues auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et combinées avec des séquences de référence du ERCC spike- dans les contrôles. Un indice de transcriptome sensible au leurre [17] a été construit afin de permettre un alignement sélectif avec Salmon. Pour la quantification, dix répliques bootstrap ont été utilisées et la compensation des biais spécifiques à la séquence, des biais GC et du biais positionnel 5' ou 3' a été activée.

Par la suite, les données de quantification des contrôles ERCC spike-in ont été corrélées à leur concentration théorique, afin de détecter les problèmes lors de la préparation des échantillons.

En outre, les données de quantification spécifiques aux gènes ont été initialement filtrées (uniquement les gènes qui apparaissent dans plus d'un réplicat avec plus de 15 comptes), normalisées à l'aide de la transformation logarithmique régularisée (rlog) et utilisées pour l'analyse exploratoire des données, par exemple avec PCA. Des gènes différentiellement exprimés ont été identifiés et ensuite utilisés pour l'analyse de la voie à l'aide de DESeq2 [18]. Les données d'expression ont été analysées pour les gènes exprimés de manière significativement différentielle entre les paires de lignées cellulaires BHK-2P et BHK179, BHK-InV et BHK-2P, et BHK-InV et BHK179. Par la suite, le changement de pli logarithmique binaire (log2) résultant a été ajusté à l'aide des fonctions "lfcShrink" et "apglm" dans DESeq2 afin de compenser les comptages de lecture faibles ou variables qui peuvent conduire à une surestimation de la variance [19].

Les critères pour un gène exprimé de manière significativement différente ont été définis sur une valeur ajustée maximale de {{0}}.05 et une valeur absolue minimale du changement de facteur log2 réduit de 1. Voie et critères pour un gène exprimé de manière significativement différente ont été fixées à une valeur ajustée maximale de 0,05 et à une valeur absolue minimale du changement de facteur log2 rétréci de 1. L'analyse de la voie et de l'enrichissement a été effectuée à l'aide de la fonction "enrich" dans le profil de cluster (version 3.16.0).

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3. Résultats

3.1 La sensibilité d'une lignée cellulaire au FMDV est indépendante de son taux de croissance individuel et de son nombre de divisions cellulaires

Des expériences par lots avec neuf lignées cellulaires en suspension BHK différentes ont été menées sur une période de six jours et la densité cellulaire viable (VCD) et la viabilité ont été mesurées quotidiennement. Sur la base d'observations antérieures selon lesquelles les lignées cellulaires différaient dans leur sensibilité au sérotype FMDV Asia{{0}} [12], il a été examiné si un métabolisme cellulaire et un taux de croissance élevés étaient liés à une sensibilité réduite à l'infection par ce virus (tableau 1). Deux des trois lignées cellulaires en suspension BHK sensibles sont des cellules à croissance lente avec de petits nombres de division cellulaire (cd) de 0.60 (#3) et 0,70 (#9), tandis que la troisième lignée cellulaire sensible (#8) a le taux de croissance et le cd les plus élevés (μ=0.035, cd=1.62) parmi toutes les lignées cellulaires testées.

Le retrait du sérum et l'adaptation à la croissance dans l'ACFM n'ont pas eu d'effet sur la sensibilité au FMDV dans notre ensemble de lignées cellulaires examinées. La lignée cellulaire #2 est le précurseur à croissance lente et dépendant du sérum des lignées cellulaires BHK-2P, maintenu en suspension avec du GMEM avec du sérum bovin fœtal. Lors de l'adaptation à la croissance dans l'ACFM, les cellules ont été sélectionnées pour un VCD élevé, lié à un taux de croissance et un cd élevés. Comme la principale lignée cellulaire BHK-2P utilisée pour l'étude, les lignées cellulaires #4 et #5 sont également dérivées de la lignée cellulaire #2 mais diffèrent par le mode d'adaptation à l'ACFM. Toutes les lignées cellulaires BHK-2P maintenues dans l'ACFM ont montré un profil de croissance très similaire. La sensibilité au FMDV sérotype Asia-1 n'a été acquise par aucune de ces lignées cellulaires lors de l'adaptation à l'ACFM, probablement parce que la lignée d'origine #2 était déjà résistante. De même, aucun changement de sensibilité n'a été observé pour la lignée cellulaire en suspension #3. Lors d'une croissance adhérente (cf. lignée cellulaire #1 dans [12]), les cellules avaient été sensibles au FMDV Asia-1 et elles ont conservé cette caractéristique lors de l'adaptation à la croissance en suspension. En même temps, elles n'ont pas acquis le profil de croissance rapide des autres cellules en suspension.

3.2 Les cellules en suspension présentent moins de récepteurs primaires mais plus de récepteurs secondaires pour le FMDV à leur surface que les cellules BHK adhérentes

La première étape pour qu'un virus infecte avec succès une cellule est la liaison de la particule virale aux molécules réceptrices à la surface de la cellule. Pour analyser les différences entre les cellules BHK en croissance adhérente et les cellules BHK en suspension, des anticorps contre les récepteurs cellulaires impliqués dans l'interaction de la matrice extracellulaire et connus pour jouer un rôle important dans l'infection par le FMDV ont été testés. Les intégrines v 3 et v 8 ont été examinées en tant que récepteurs cellulaires représentatifs qui reconnaissent le motif de liaison RGD (Arg-Gly-Asp) et interagissent avec les composants sériques et la matrice extracellulaire, mais sont également utilisés par le FMDV comme ses récepteurs primaires naturels. Aucune des lignées cellulaires en suspension testées (BHK-InV et BHK-2P) n'exprime l'intégrine v 3 ou v 8 à la surface cellulaire. Alors que la différence entre le BHK adhérent et le BHK en suspension n'était pas significative pour l'intégrine v 8 (Fig 1b), un pourcentage significativement plus élevé de BHK179 adhérent exprimait l'intégrine v 3 par rapport aux lignées cellulaires en suspension BHK-InV et BHK-2P ( figure 1a).

Des quantités élevées de HS ont été présentées à la surface des deux lignées cellulaires en suspension. L'expression de HS était très divergente entre les cultures répliquées de cellules BHK179 adhérentes. Par rapport aux lignées cellulaires en suspension, moins de cellules dans les cultures BHK179 étaient HS-positives, même si la différence n'était pas significative au niveau de signification prédéterminé (Fig 2).

La coloration et l'analyse microscopique ont révélé de grandes différences dans la disposition du cytosquelette d'actine entre les cellules adhérentes et en suspension (Fig 3). Les filaments d'actine dans les cellules BHK179 adhérentes sont uniformément répartis sur toute la cellule selon un motif réticulaire fin (Fig 3a), tandis que les cellules poussant en suspension avaient une coloration diffuse de l'actine (Fig 3b). Fait intéressant, la quantité d'actine filamenteuse était différente entre les lignées cellulaires en suspension BHK-InV et BHK-2P. L'intensité de fluorescence médiane (MFI) après coloration à la phalloïdine était significativement plus élevée dans les cellules BHK-InV par rapport à BHK -2 P, ce qui indique une teneur en actine filamenteuse plus élevée dans ces cellules (Fig 3c).

3.3 Les cellules en suspension diffèrent par leur efficacité de transfection mais pas par leur capacité à afficher des protéines de surface

En raison des différences de conformation de l'actine entre les cellules adhérentes et en suspension, les cellules ont été examinées en ce qui concerne leur transférabilité et leur capacité à présenter des protéines à leur surface. En général, l'efficacité de la transfection, mesurée par l'expression de l'EGFP, est réduite dans les cellules en suspension (Fig 4a). Lors de l'utilisation d'une faible dose du réactif de transfection, un pourcentage significativement plus élevé de cellules adhérentes exprimait l'EGFP par rapport aux cellules en suspension. Lorsqu'une dose élevée de réactif de transfection a été utilisée, un pourcentage plus élevé de cellules en suspension ont été transfectées avec succès, bien que la différence entre les doses élevées et faibles n'ait pas été significative. Pour répondre à la question de savoir si les cellules en suspension sont encore capables de présenter des protéines telles que des récepteurs cellulaires à leur surface, les cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour la protéine G du VSV (Fig 4b). Une série de cellules a été perméabilisée avant la coloration pour tenir compte de la possibilité que la protéine G soit exprimée mais non affichée sur la surface cellulaire. Il n'y avait pas de différence significative dans la capacité à exprimer et à présenter la protéine VSV G entre les cellules adhérentes et en suspension, ni lors de l'utilisation d'une dose faible ou élevée de réactif de transfection.

3.4 L'analyse du transcriptome révèle des différences dans l'expression des gènes liés à la matrice extracellulaire entre les cellules en suspension

Une analyse du transcriptome a été effectuée pour étudier plus avant les différences entre les cellules BHK en croissance adhérente et les cellules BHK en suspension et pour élucider pourquoi les cellules en suspension diffèrent dans leur sensibilité au FMDV. Une lignée cellulaire BHK adhérente (BHK179) cultivée dans du MEM additionné de FBS ainsi qu'une lignée cellulaire sensible au FMDV à croissance rapide (BHK-InV) et une lignée cellulaire résistante à croissance rapide (BHK-2P), toutes deux adaptés à l'ACFM, ont été choisis pour l'analyse.

Une analyse en composantes principales (ACP) a mis en évidence la relation étroite entre les répliques biologiques des lignées cellulaires individuelles (Fig 5a). Toutes les répliques de la même lignée cellulaire sont situées étroitement ensemble dans la parcelle avec peu d'indication d'effets de lot à lot. La première composante principale (représentant 81 % de la variance dans l'ensemble de données normalisé) a été interprétée comme la différence de transcription entre les cellules poussant en suspension et les cellules poussant en adhérence, tandis que la seconde composante principale (15 % de la variance) représentait la différence entre les les lignées cellulaires en suspension BHK-2P et BHK-InV, éventuellement associées à une sensibilité à l'infection par le FMDV. Ensemble, les deux premières composantes principales ont pu expliquer 96 % de la variance trouvée dans l'ensemble de données, ce qui indique que l'analyse du transcriptome a identifié des différences pertinentes entre les trois lignées cellulaires.

Le plus petit nombre de gènes exprimés de manière différentielle a été trouvé lors de la comparaison de BHK-InV avec BHK-2P (590 régulés à la hausse ; 304 régulés à la baisse). Des nombres similaires ont été observés dans la comparaison de BHK -2 P ou BHK-InV individuellement avec BHK179 (1527 et 1519 régulés à la hausse ; 1308 et 943 régulés à la baisse, respectivement) (Fig 5b). Lorsque les deux lignées cellulaires en suspension (BHK-InV et BHK-2P) ont été combinées et comparées à la lignée cellulaire BHK179 adhérente, 1814 gènes ont été exprimés de manière différentielle. Alors que 411 gènes sont exprimés exclusivement différemment lors de la comparaison de BHK179 avec BHK-InV, près du double (701 gènes) sont exprimés exclusivement différemment entre BHK179 et BHK-2P. Entre les deux lignées cellulaires en suspension, seuls 104 gènes étaient exclusivement exprimés différemment.

Lors de la comparaison de l'ensemble de gènes différentiellement exprimés des lignées cellulaires sensibles au FMDV BHK179 et BHK-InV avec la lignée cellulaire résistante au FMDV BHK-2P, un sous-ensemble de 553 gènes s'est avéré être exprimé différemment dans les deux comparaisons ( figure 5c). Comme ces gènes pourraient être impliqués dans la sensibilité au FMDV, une analyse d'enrichissement du terme GO a été menée et a révélé que bon nombre de ces gènes sont liés aux composants cellulaires de la matrice extracellulaire (ECM), des membranes cellulaires et des jonctions cellule-cellule (Fig 5d) .

Puisque nous avons observé des différences entre les lignées cellulaires liées aux interactions ECM, le transcriptome a été réanalysé en mettant l'accent sur l'expression des intégrines v 1, v 3, v 6, v 8, ainsi que de l'actine, toutes potentiellement pertinentes pour la sensibilité à l'infection par le FMDV. (Fig. 5e). À l'exception d'ACTA2, il n'y avait pas de différence significative dans l'expression des gènes liés à l'actine entre les cellules BHK-InV et BHK-2P au niveau de l'ARNm. Le nombre de gènes normalisés pour tous les gènes liés à l'actine examinés était significativement plus élevé dans la lignée cellulaire adhérente BHK179 que dans les lignées cellulaires en suspension (S1 Fig).

Les trois lignées cellulaires ont exprimé des quantités similaires de transcrits d'ITGAV, codant pour la sous-unité d'intégrine v, mais ont montré une expression différentielle pour les sous-unités d'intégrine. En détail, les lignées cellulaires en suspension BHK-2P et BHK-InV exprimaient significativement moins d'ITGB1, ITGB3 et ITGB6 par rapport à la lignée cellulaire adhérente BHK179. ITGB3 et ITGB8 étaient significativement exprimés de manière différentielle entre les lignées cellulaires en suspension BHK-2P et BHK-InV. Fait intéressant, ITGB8 était le seul gène codant pour la sous-unité d'intégrine qui était fortement surexprimé dans les deux lignées cellulaires sensibles au FMDV BHK179 et BHK-InV par rapport à la lignée cellulaire résistante au FMDV BHK-2P (Fig 5e).

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4. Discussion

L'adaptation des cellules à la croissance en suspension et dans des milieux sans sérum est un processus long et graduel mais nécessaire en biotechnologie pour générer des lignées cellulaires à haut rendement utilisées pour produire des anticorps, des antigènes vaccinaux ou d'autres protéines [1, 8 ]. En effet, ce processus comporte toujours le risque que les cellules acquièrent des propriétés indésirables par rapport au matériau cellulaire d'origine [7]. Dans le cas de la production d'antigènes vaccinaux, la sensibilité de la lignée cellulaire pour le virus cible est d'une importance majeure. Pour le virus de la fièvre aphteuse (FMDV), c'est un phénomène bien connu que certaines lignées cellulaires BHK résistent à l'infection ou perdent leur sensibilité lors de repiquages ​​répétés [20–22]. De plus, les propriétés antigéniques du virus peuvent être variables selon la cellule hôte [9].

Les cellules en suspension se développent indépendamment d'une surface et sont englouties par des milieux nutritifs riches en oxygène, ce qui leur permet de se développer rapidement. La multiplication rapide des cellules est une caractéristique nécessaire pour étendre la culture à de grands volumes facilement et en peu de temps. L'élimination du sérum du milieu est nécessaire pour réduire les coûts, les risques de contamination et pour simplifier les procédés de bas de gamme [23, 24].

L'analyse de croissance par lots de différentes lignées cellulaires en suspension BHK visait à déterminer si la sélection vers une population cellulaire à croissance rapide dans des conditions sans sérum est préjudiciable à la propagation du FMDV. En fait, deux des trois lignées cellulaires sensibles se sont développées lentement, mais leur sensibilité au FMDV s'est avérée indépendante de leur métabolisme de croissance. Il est plus probable que la sensibilité au FMDV soit déjà perdue (ou conservée) lors de l'adaptation initiale à la croissance en suspension. Le détachement des cellules de la surface et le retrait du sérum dans les étapes suivantes d'adaptation à la croissance en suspension entraînent des modifications du niveau d'expression des protéines de surface et des protéines impliquées dans le cytosquelette [7].

Les intégrines sont une famille importante de récepteurs de surface cellulaire qui sont intégrés dans la membrane cellulaire et médient la signalisation de cellule à cellule ainsi qu'une forte connexion entre la cellule et la surface grâce à la liaison des composants de la matrice extracellulaire (ECM) [10, 25 ]. La régulation du cycle cellulaire, l'organisation du cytosquelette et la translocation des molécules réceptrices naissantes vers la membrane cellulaire dépendent des intégrines [25]. Pour de nombreuses intégrines, la liaison de l'ECM, ainsi que la liaison des ligands fournis aux cellules par l'ajout de sérum au milieu de culture, est médiée par le motif RGD [6, 25] et il est susceptible de changer lorsque le la cellule passe de la croissance adhérente à la croissance en suspension. La reconnaissance du motif RGD par les intégrines est également utilisée par le FMDV pour initier l'endocytose médiée par les récepteurs de la particule virale [26]. Le motif RGD dans VP1 du FMDV est hautement conservé [27], et les intégrines v 1, v 3, v 6 et v 8 sont des récepteurs connus utilisés par le FMDV in vivo et in vitro [28–31]. Étant donné que les différences présumées dans le protéome de surface cellulaire entre les cellules adhérentes et en suspension peuvent également être cruciales pour les différences de sensibilité à l'infection par le FMDV, des anticorps se liant à l'intégrine v 3 et v 8 ont été utilisés pour colorer une lignée cellulaire BHK adhérente ainsi qu'un une lignée de cellules BHK en suspension sensible et résistante. Aucune coloration v 6 n'a été réalisée car il a été précédemment montré que cette intégrine n'est pas exprimée à la surface des cellules BHK [32], même si l'ARNm d'ITGB6 est détectable. De même, malgré le niveau élevé d'expression d'ARNm ITGB8 détecté dans les cellules BHK179 et BHK-InV, l'intégrine v 8 ne semble pas être présentée à la surface des cellules BHK en général. L'intégrine v 3 a été trouvée à un degré mineur sur la lignée cellulaire adhérente, mais pas sur les lignées cellulaires en suspension.

Outre les intégrines, la liaison du ligand, les événements d'internalisation et la signalisation intracellulaire peuvent être médiés par les protéoglycanes de sulfate d'héparane (HS) [33] et l'acquisition de HS en tant que récepteur secondaire est souvent observée après des passages répétés de FMDV en culture [34]. La coloration spécifique des anticorps a révélé une HS abondante sur les deux lignées cellulaires en suspension et, dans une moindre mesure, également sur les cellules BHK adhérentes. Des mutations dans le génome du FMDV, entraînant des modifications des protéines de la capside virale pour permettre l'utilisation de HS comme récepteur, sont connues pour atténuer le virus chez l'hôte naturel [35]. La disponibilité de HS pourrait donc être un facteur crucial pour l'antigénicité modifiée de l'indépendance du FMDV de la lignée cellulaire à laquelle le virus a été adapté.

Parce que le détachement cellulaire est lié à des changements dans le mécanisme contractile actine-myosine [7] et que la culture de cellules en suspension apporte des exigences différentes pour la survie, par exemple la résistance à une contrainte de cisaillement élevée due à l'agitation du liquide de culture [6], le squelette d'actine a été d'intérêt majeur dans cette étude. L'analyse microscopique a révélé un réarrangement conformationnel du cytosquelette d'une distribution réticulaire dans les cellules adhérentes en croissance à une structure sphérique dense dans des conditions de suspension. Cela pourrait être un mécanisme d'ajustement à la contrainte de cisaillement élevée mentionnée ci-dessus et est également connu pour se produire dans les cellules CHO dans les mêmes conditions [6]. Mais il convient également de noter que s'il n'y avait pas de différence significative dans l'expression de la plupart des gènes d'actine entre les cellules BHK-InV et BHK -2 P au niveau de l'ARNm, une protéine d'actine filamenteuse significativement plus a été détectée dans le BHK sensible au FMDV. -InV que dans le BHK -2P résistant au FMDV. Cela peut être lié à différentes vitesses de polymérisation de l'actine globulaire en actine filamenteuse.

Au moins dans les cellules adhérentes, l'entrée du FMDV dépend de la dynamique de l'actine. L'entrée virale induit des volants d'actine et une perturbation du réseau de filaments d'actine par la conversion de l'actine filamenteuse en actine globulaire a été décrite au stade précoce de l'infection [36–38]. À en juger par l'effet cytopathique (CPE) observé dans les cellules BHK adhérentes lorsqu'elles sont infectées par le FMDV, le cytosquelette subit des réarrangements intensifs dans bon nombre de ses composants [38]. Un tel CPE n'est pas observé dans les cellules en suspension en raison de leur forme déjà sphérique, mais la teneur élevée en actine peut donner un certain avantage au virus. En raison des différences dans le cytosquelette d'actine, des expériences de transfection ont été menées pour comparer l'efficacité de la transfection entre la suspension et la BHK adhérente et pour déterminer si le cytosquelette dense des cellules en suspension entrave la présentation des protéines à la surface cellulaire. Il est de notoriété publique que les lignées cellulaires en suspension sont très difficiles à transfecter, ce qui est dû à la fixation réduite du complexe de transfection à la membrane cellulaire et par la suite à une absorption réduite de la charge utile d'ADN [39]. Ceci a également été confirmé par nos expériences. Mais bien que l'efficacité de la transfection ait été réduite dans les cellules BHK-2P par rapport à la lignée cellulaire BHK adhérente, il n'y avait aucune différence dans la capacité à afficher la protéine G VSV transfectée sur la surface cellulaire. Une différence dans le pourcentage de cellules colorées a été observée entre les plasmides d'expression pEGFP-N1 et pVSV-G dans les cellules BHK-2P. Cela n'a pas été étudié plus avant, mais cela peut être causé par une limite de détection différente entre la coloration immunofluorescente utilisée pour visualiser le VSV-G et la fluorescence innée de l'EGFP.

Enfin, une analyse du transcriptome a été réalisée pour donner plus d'informations sur les différences transcriptionnelles entre les cellules BHK adhérentes et en suspension d'une part et entre les lignées cellulaires BHK sensibles au FMDV et résistantes au FMDV d'autre part. Nos résultats sont conformes à d'autres études sur les changements transcriptomiques dans les cellules CHO, MDCK ou HEK lors du passage de la croissance adhérente à la croissance en suspension. En général, la plupart des changements sont liés à la structure du cytosquelette, au métabolisme cellulaire et aux interactions des composants de la MEC et sont régulés à la hausse pour les cellules en suspension [7, 40, 41]. Étonnamment, la cellule en suspension BHK-2P résistante au FMDV a montré une régulation négative de ces ensembles de gènes, ce qui pourrait également expliquer les niveaux réduits d'actine dans BHK-2P par rapport aux cellules BHK-InV. Une analyse spécifique de l'expression de la sous-unité d'intégrine a révélé des niveaux similaires de transcrits de la sous-unité V de l'intégrine dans les trois lignées cellulaires. L'expression la plus élevée dans toutes les lignées cellulaires a été trouvée pour la sous-unité 1 de l'intégrine. Il est important de noter que l'intégrine 1 peut former des hétérodimères avec dix chaînes différentes et est exprimée de manière constitutive par la plupart des cellules de mammifères [6, 42]. De même, la sous-unité V est capable de former un hétérodimère avec cinq chaînes différentes, mais 6 et 8 ne sont présentés sur la surface cellulaire qu'en combinaison avec V [42]. Ceci est reflété avec précision par l'abondance observée de transcrits des sous-unités d'intégrine unique. La transcription élevée de 3 dans les cellules adhérentes est également bien corrélée avec le signal plus élevé pour l'intégrine v 3 dans les expériences de coloration d'anticorps. D'autre part, les différences observées dans les niveaux d'ARNm ITGB3 et ITGB8 entre BHK-2P et BHK-InV n'étaient pas reflétées dans la coloration de surface. Nous n'avons pas été en mesure de déterminer si cela était simplement dû à une sensibilité différente entre les méthodes de quantification de l'ARNm et des protéines ou s'il s'agissait d'un blocage post-transcriptionnel de l'expression des protéines ou de la présentation de surface [43]. Dans l'ensemble, les lignées cellulaires en suspension BHK-2P et BHK-InV exprimaient significativement moins d'ARNm ITGB1, ITGB3 et ITGB6 par rapport à la lignée cellulaire adhérente.

5. ConclusionsDans

En conclusion, il est d'une importance cruciale dans la préparation des cellules en suspension d'utiliser un clone de cellule parentale avec des caractéristiques bien connues et de cribler soigneusement la population cellulaire résultante pendant le processus d'adaptation pour s'assurer que la lignée cellulaire conserve les caractéristiques essentielles, dans ce cas , la susceptibilité au FMDV. En outre, des méthodes modernes telles que l'analyse FACS et la transcriptomique doivent être utilisées pour une caractérisation plus poussée des lignées cellulaires de production.

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Remerciements

Nous remercions Patrick Zitzow pour son excellent support technique.

Les contributions de l'auteur

Conceptualisation :Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Analyse formelle :Veronika Dill, Florian Pfaff.

Acquisition de financement :Aline Zimmer, Martin Bière.

Enquête:Veronica Dill.

Méthodologie:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Administration du projet :Martin Beer.Ressources : Aline Zimmer.

Surveillance:Michel Eschbaumer.

Visualisation:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Rédaction – brouillon original :Veronica Dill.

Rédaction – révision et édition :Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, Michael Eschbaumer.

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