Effet avantageux/défavorable de la quercétine sur les membranes des cellules du neuroblastome SK-N-SH Partie 2

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2.2.2. Activité antioxydante de la quercétine

Pour tester l’efficacité de la quercétine dans la protection des membranes contre le stress oxydatif, des expériences ont été réalisées dans lesquelles les modèles lipidiques de la membrane ont été exposés à l’ozone en l’absence (Figure 4a) et la présence de quercétine à une concentration de 6,25 μM (Figure 4b).

Sous l’influence de l’ozone, l’évolution des deux dépendances, c’est-à-dire π=f(A) et Cs-1=f(rn)change. Les isothermes obtenues pour la propagation monocouche sur la sous-phase contenant de l’ozone ont été caractérisées par une pente plus petite et un déplacement vers des valeurs A inférieures. De plus, les valeurs de Cs-1 ont diminué sous l’influence de l’ozone. Ces changements étaient les plus importants à une concentration d’ozone d’environ 0,4 ppm.cintancheUne nouvelle augmentation de la concentration d’ozone n’a pas augmenté les changements dans les caractéristiques des monocouches (encadré de la figure 4a).

Graphique 4. Les isothermes de pression superficielle et le module de compressibilité correspondant (encart) du modèle lipidique des couches de neuroblastome étalées sur la sous-phase contenaient les concentrations indiquées d’ozone dissous dans le tampon. Isothermes:(a)en l’absence d’antioxydants;(b)en présence de quercétine (6,25 μM) ajoutée au tampon contenant de l’ozone.

Lorsque la quercétine à une concentration de 6,25 μM a été introduite dans la sous-phase, l’ozone n’a pas affecté de manière significative l’évolution de l’isotherme r(A); toutefois, les valeurs du module de compression ont changé en présence d’ozone de la même manière que dans le cas de l’absence de quercétine (encadré de la figure 4b).

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Les valeurs numériques des paramètres caractérisant les monocouches déterminées sur la base des isothermes obtenues sont présentées dans le tableau 3.

Tableau 3. Les paramètres de surface des monocouches Alim et Cs-I calculés pour les monocouches du modèle de membrane de neuroblastome étalées sur la sous-phase contenaient les concentrations indiquées d’ozone dissous dans le tampon en l’absence et en présence de quercétine (6,25 uM). Les données représentent la moyenne de trois expériences ± SD. Différentes lettres indiquent des différences significatives (p≤0,05).

En présence d’ozone, une légère réduction de la surface par molécule (Alim) en monocouche densément tassée est observée. La réduction maximale de ce paramètre est de 3,2% par rapport au contrôle (monocouche sur le tampon pur). Le paramètre Cs-I est également réduit, atteignant des valeurs de plateau à des concentrations d’ozone supérieures à 0,6 ppm O.La réduction maximale de ce paramètre atteint 24% par rapport au témoin.

Lorsque la quercétine à une concentration de 6,25 uM est présente dans la sous-phase, les valeurs d’Alim (1-2%) diminuent légèrement, tandis que la réduction de la valeur Cs-1 est d’environ 27%.

La nature de l’Alim change en présence d’ozone et d’ozone en combinaison avec la quercétine ont des cours différents. À une concentration d’ozone d’environ 0,3 ppm, en l’absence de quercétine, l’Aim diminue brusquement à environ 88,3 A2. Il atteint ensuite la valeur minimale du plateau donnant une dépendance caractéristique de la forme en S (Figure 5a, points rouges). En présence de quercétine, il y a une légère diminution monotone lisse d’Alim, atteignant une concentration d’ozone plus élevée un plateau d’environ 93,5 A2 (Figure 5a, points verts).

Graphique 5. La dépendance de la surface par molécule à la concentration d’ozone (a) et la dépendance du module de compression sur la concentration d’ozone (b)pour la membrane du neuroblastome sur la sous-phase: Sans points rouges de quercétine; avec des points vert quercétine. Les lignes ne présentent aucun modèle physique, ont été ajustées mathématiquement et ont été dessinées pour faciliter le suivi des changements de paramètres. Les valeurs du module de compression maximal de la couche changent de la même manière que la concentration d’ozone pour les deux : en l’absence et en présence de quercétine (figure 5b).

3. Discussion

Le mécanisme d’action de la quercétine a été étudié de manière intensive pendant de nombreuses années, mais les résultats des expériences sont souvent contradictoires et indiquent que dans certaines circonstances, ce composé est bénéfique et, dans d’autres, défavorable pour les cellules. L’analyse des études disponibles montre que l’effet de ce composé sur les cellules est lié à deux aspects, à savoir son interaction avec les membranes et son activité antioxydante. Cependant, dans les cellules, il n’est pas possible de distinguer ces deux modes d’action de la quercétine et l’évaluation de la pertinence de ce composé en tant que substance potentielle, par exemple, ayant une activité antitumorale. Pour cette raison, les expériences ont été planifiées de manière à évaluer de manière qualitative et quantitative l’influence de ce composé sur les propriétés mécaniques des membranes, ainsi que son activité antioxydante dans le système modèle, ce qui élimine les effets de l’activité d’autres voies métaboliques.

Sur la base des expériences réalisées, il a été confirmé que même aux concentrations les plus faibles (6,25 uM), la quercétine modifie (comme l’indique l’augmentation d’Alimvalue) les monocouches modèles, imitant la partie lipidique de la membrane des cellules du neuroblastome. Il indique une possibilité d’interaction de la quercétine avec les membranes de ces cellules lorsqu’elles atteignent le cerveau, même à de faibles concentrations. Ceci est particulièrement important pour les cellules nerveuses dont les membranes contiennent des quantités relativement importantes de lipides.

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Le rapport lipide-protéine approximatif pour les cellules nerveuses est de 80:20%, et par exemple, pour la membrane érythrocytaire, ce rapport est de 50:50%[29]. Un tel niveau de lipides dans la membrane des cellules nerveuses est lié au rôle de ces cellules dans la transmission des signaux électriques. Dans le même temps, même des changements subtils dans les propriétés physico-chimiques, telles que la flexibilité et la rigidité, de la membrane cellulaire, peuvent perturber considérablement cette fonction.

Le potentiel d’action est transféré le long de la membrane de la cellule nerveuse grâce au travail des canaux ioniques, puis, grâce à l’action des pompes ioniques, le potentiel de repos est restauré. Le bon fonctionnement de ces protéines (en particulier, déterminé par leur forme) dépend étroitement de l’environnement lipidique. De plus, les modifications des propriétés mécaniques de la membrane peuvent perturber le fonctionnement des canaux dont le mécanisme de contrôle dépend précisément des propriétés mécaniques de la membrane.

Ces thèses sont confirmées par des études qui ont montré que l’effet de la quercétine sur la membrane cellulaire est lié, entre autres, au transport des ions Ca2+ et/ou au métabolisme Ca2+ [30,31]. Ainsi, l’introduction de molécules de quercétine dans l’environnement de la membrane (en particulier des cellules nerveuses) peut avoir des conséquences importantes sur leur fonctionnement.

Pour vérifier si l’action de la quercétine déterminée dans les systèmes modèles joue un rôle bénéfique ou défavorable dans les cellules, les résultats obtenus pour les membranes modèles ont été comparés à l’effet de ce composé sur les cellules de neuroblastome entières. Pour les cellules SK-N-SH, le test MTT a été effectué,Extrait de Cistanche Anti Alzheimerdonner l’information sur la viabilité cellulaire des cellules qui à son tour est directement proportionnelle aux enzymes mitochondriales déshydrogénases.

Les résultats obtenus ont montré que la présence de quercétine à des concentrations de 100 et 200uM augmentait le nombre de cellules viables. Des résultats similaires ont été obtenus par Bao et al. [32], étudiant l’effet de la quercétine sur les cellules PC-12. La fuite de LDH dans l’environnement extracellulaire, qui donne des informations sur la perturbation de la membrane cellulaire, a également été examinée aux mêmes niveaux de quercétine. Les résultats obtenus ont démontré que les membranes des cellules testées n’étaient pas endommagées dans de telles conditions. Boots et coll. [2], étudiant les effets de la quercétine sur les cellules épithéliales pulmonaires, ont observé des résultats similaires. Par conséquent, on peut conclure qu’à ces concentrations, la quercétine a un effet positif sur les cellules, augmentant leur viabilité.

Le deuxième aspect important du mécanisme d’action de la quercétine est lié à ses propriétés antioxydantes. Pour évaluer l’effet associé du polyphénol étudié, des expériences ont été menées dans lesquelles il a été vérifié si la quercétine joue un rôle protecteur dans les cellules exposées au stress oxydatif. Le stress oxydatif a été généré par l’introduction de H, O2 dans l’environnement cellulaire.Cistanche pour améliorer la mémoireComme démontré dans cette étude, le peroxyde d’hydrogène provoque une mortalité cellulaire importante, exprimée en dommages aux mitochondries.

Lorsque les cellules SK-N-SH ont été cultivées pendant 3 h dans un milieu contenant 3 et 5 mM H2O2, la viabilité cellulaire a diminué à environ 44 % de celle des cellules non traitées (test MTT). Les études ont montré que le prétraitement de 24 heures des cellules avec de la quercétine provoque une augmentation du nombre de cellules vivantes par rapport aux cellules traitées par H2O2. Suematsu et coll. [13] ont rapporté des effets similaires.

Nous avons également mesuré le niveau de MDA, qui est un biomarqueur du stress oxydatif en tant que produit final de la peroxydation lipidique[33]. Le prétraitement des cellules avec des concentrations élevées de quercétine, suivi de l’ajout de peroxyde d’hydrogène, a entraîné une légère augmentation de la teneur en MDA par rapport aux cellules exposées à l’HO, seule. Cela peut être dû au fait que la quercétine (à des concentrations plus élevées) peut également subir une activation oxydé-réductrice et faire l’objet d’un cycle redox, générant des espèces d’oxygène réactives intracellulaires [34].

Il n’y a pas eu de changements significatifs dans la destruction membranaire (comme l’indique le taux de LDH inchangé) des cellules traitées avec de la quercétine et de l’H2O2 par rapport au cas où les cellules étaient exposées au stress oxydatif uniquement. Par conséquent, on peut conclure que malgré une augmentation de la peroxydation lipidique (à des concentrations élevées de quercétine), cela n’était pas assez significatif pour détruire les membranes et perturber leur continuité.

Les observations obtenues pour le système natif ont été comparées à celles reçues pour un système modèle où il est possible de contrôler exactement à la fois la concentration de quercétine et le niveau de stress. Il a été vérifié comment la partie lipidique de la membrane du neuroblastome est résistante au stress oxydatif. Des conditions de stress ont été créées en introduisant de l’ozone dans le tampon, dans lequel l’ozone subit des réactions de décomposition formant des radicaux oxydatifs, entre autres des radicaux hydroxyles et des radicaux anions superoxydes [35]. Le mélange obtenu d’espèces réactives de l’oxygène correspond à celles naturellement présentes dans les cellules, en raison du déséquilibre de perturbation du statut redox [36-38].

Sous l’influence du stress, la forme des isothermes a changé, indiquant une diminution significative de la surface par molécule dans la monocouche densément emballée. De tels changements ont eu lieu en raison de l’oxydation des liaisons insaturées dans les chaînes d’acides gras. Cet effet a augmenté avec l’augmentation de la concentration d’ozone à environ 0,3 ppm, puis ce paramètre isotherme est resté au même niveau malgré l’augmentation des ROS. Cela signifie qu’à une concentration d’ozone d’environ 0,3 ppm, tous les acides gras insaturés présents dans la monocouche ont été oxydés (dans le modèle de neuroblastome, la quantité totale d’acides gras insaturés était de 52 %)

Les monocouches oxydées ont une rigidité substantielle,cistanche en chinoisreprésentée par la valeur Cs-1 (plus la valeur de ce paramètre est élevée, plus la rigidité de la couche est grande). En présence de quercétine, même à une faible concentration (6,25 μM), les modifications de la membrane exposée à l’ozone, telles que visualisées par les changements de la valeur Alim, ont été significativement réduites (Figure 5a), ce qui prouve l’activité antioxydante de ce composé. Il convient toutefois de noter que, bien que la quercétine ait récupéré les radicaux, protégeant les acides gras insaturés contre l’oxydation, elle n’a pas inversé les changements de rigidité de la membrane (Figure 5b).

Ainsi, il a été démontré que la quercétine présente une action antioxydante, mais sa simple présence entre les molécules lipidiques influence (détermine) les paramètres du laver, c’est-à-dire que, malgré la protection des chaînes d’acides gras contre l’oxydation, la rigidité de la membrane a diminué de manière significative (valeur Cs-I environ 25% inférieure à celle du témoin).

Ces résultats indiquent que c’est le changement de membrane qui est le principal facteur dans les effets cellulaires résultant de la présence de quercétine. Cependant, les conséquences de ce changement (modification de la signalisation, du transport) varient en fonction du nombre de molécules de polyphénols, de la composition initiale de la membrane et de la fonction de la cellule. Cela explique pourquoi, dans différentes circonstances et dans différentes études, la quercétine montre un effet protecteur, alors que dans d’autres tout le contraire.

Dans une situation de stress oxydatif élevé, l’effet antioxydant aide la cellule en protégeant ses composants contre les dommages. Cependant, si les membranes sont considérablement modifiées en localisant ce composé dans leur environnement, ce qui entraîne la distribution des voies de signalisation ou de transport par une rigidité membranaire modifiée, cela peut entraîner des effets défavorables. Il convient également de rappeler que de nombreux processus dans une cellule se déroulent simultanément, à la fois ceux liés aux membranes et ceux qui génèrent un stress oxydatif. L’effet qui peut être observé et mesuré en déterminant le niveau d’indicateurs spécifiques est toujours total. Par conséquent, il existe des situations dans lesquelles l’effet de la quercétine est perçu comme favorable et défavorable.

4. Matériaux et méthodes

4.1.Matériaux

La composition du modèle de la partie lipidique de la membrane des cellules du neuroblastome a été établie sur la base des travaux des auteurs de [39-41]. Phospholipides: 1-oléoyl-2-palmitoyl-sn-glycérol-3-phosphocholine;1-hexacosanoyl-d4-2-hydroxy-sn-glycérol-3-phosphocholine;1,2-dioleoyl-sn-glycérol-3-phosphocholine; L-α-phosphatidyléthanolamine (cerveau); sphingomyéline (cerveau)-(Avanti Polar Lipids Inc., Albâtre, AL, États-Unis). Le cholestérol a été acheté (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne). Le rapport phospholipides/cholestérol était de 79% à 21%. Le rapport entre les acides gras saturés et insaturés était de 48 % à 52 %.

Les solvants (chloroforme, éthanol) de pureté chimique-Poch (Gliwice, Pologne); eau fraîchement désionisée produite par HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Pologne). Le milieu de culture, le sérum et les antibiotiques ont été achetés auprès de CytoGen GmbH. Les réactifs chimiques utilisés dans les expériences ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich.

4.2.Culture cellulaire

La lignée cellulaire de neuroblastome humain SK-N-SH (The European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC) a été cultivée dans 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco), complété par 0,01 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée, contenant 5 % de CO2.

4.3. Mesure de la viabilité cellulaire (test MTT)

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits à une densité de 1×104 cellules par puits dans un volume de 0,1 mL. Les cellules ont été traitées pendant 24 h avec différentes concentrations de quercétine (3,75-200 μM). Après ce temps, 3 mM et 5 mM de peroxyde d’hydrogène ont été ajoutés pendant 3 h. En raison de l’absence de différences entre les effets des concentrations de HO2 à 3 et de 5 μM, pour les études statistiques, ils ont été traités comme les mêmes traitements et décrits comme un traitement H2O2 3-5 uM.

Après cela, une solution MTT(3-【4,5-diméthylthiazol-2-yl】-2,5 bromure de diphényl tétrazolium) (solution mère stérile de 5 mg/mL) a été ajoutée aux cellules et incubée pendant 2 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO. Ensuite, 0,4 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté à chaque puits et conservé pendant 10 min. Après centrifugation, la densité optique du surnageant a été mesurée à 570 nm à l’aide d’un lecteur de plaques de microlitre (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4.Mem1brane Damage Assay (LDH Assay)

Le dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) a été utilisé comme marqueur de l’ensemble de la membrane cellulaire.

Des cellules d’une quantité de 1 × 10* cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits et incubées en présence de quercétine (3,75-200 μM) pendant 24 h; Ensuite, 3 mM et 5 mM H2O, ont été ajoutés pendant 3 h. Aux tubes contenant 0,5 mL de pyruvate de sodium de 0,75 mM et 10 uL de NADH(140 μM)(chauffés à 37C pendant 10 min), 150 μL de surnageant ont été ajoutés et incubés pendant 30 min à 37 °C. Ensuite, 0,5 mL de 2,4-dinitrophénylhydrazine a été ajouté à l’échantillon, et après 1 h, l’absorbance a été mesurée à 450 nm.

4.5. Détermination de la peroxydation lipidique (concentration de MDA)

La peroxydation lipidique membranaire a été estimée par réaction de l’acide thiobarbiturique (TBA) avec le malondialdéhyde (MDA). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 46 puits contenant de la quercétine et du H, O2 (aux concentrations et aux temps décrits ci×vous ci×) en quantité de 1 104 cellules par puits dans un volume de 0,25 mL. Après traitement, les échantillons ont été prélevés et centrifugés (1000×&,5min). Aux pastilles, 0,5 mL de TCA à 0,5 % a été ajouté, tourbillonné pendant 1 min et lysé par sonication pendant 5 min. Après centrifugation à 10 000 × g pendant 10 min, 0,4 mL de surnageant a été ajouté au 1,25 mL 20% TCA avec 0,5% TBA et chauffé dans un thermobloc sec (100 ° C) pendant 30 min. Après refroidissement, l’absorbance a été mesurée à 532 nm en utilisant le coefficient d’extinction molaire de MDA égal à 155 M-1 cm-1.

4.6.Modèles de membranes

Ozonation de la mémoire tampon. Le tampon phosphate (0,01 M, pH 7,4) a été saturé d’ozone produit par le générateur d’ozone FM 500 (Grekos, Pologne). La concentration d’ozone dans un tampon a été déterminée selon Bader et Hoigne [42].

Isothermes de pression de surface.croissance du pénis cistancheL’auge de Langmuir (KSV, Finlande) a été utilisée pour l’enregistrement de l’isotherme de pression de surface à un taux de compression constant correspondant à une vitesse de barrière de 5 mm/min. La monocouche lipidique a été formée en étalant une quantité définie de solution de chloroforme lipidique à une concentration de 1 mg/mL sur la sous-phase composée d’un tampon phosphaté aqueux de 0,01 M, d’un pH de 7,4 avec ou sans quercétine et avec ou sans ozone. Les tensions superficielles ont été mesurées avec une plaque Pt-Wilhelmy. Les expériences ont été réalisées à 25°C±1°C.

4.7. Analyse statistique

Trois à six analyses indépendantes ont été effectuées pour chaque variante testée et ont fait l’objet d’une moyenne (±SD). Les différences significatives par rapport aux contrôles ont été estimées en exploitant la procédure SAS ANOVA. L’analyse statistique a été effectuée par le test à plages multiples de Duncan, en prenant p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Contributions des auteurs: Conceptualisation, B.K., B.D., et E.R.-S.méthodologie, B.K. B.D.; logiciel, B.K., B.D.validation, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.writing—original draft preparation B.K., B.D., E.R.-S., writing—review and editing, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.visualization, B.K., B.D.supervision, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement:Cette recherche n’a reçu aucun financement externe.

Déclaration de la Commission d’examen institutionnel: Sans objet.

Déclaration de consentement éclairé: Sans objet.

Déclaration de disponibilité des données: Les données sont contenues dans l’article. Conflits d’intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cet article est extrait de Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules