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Altérations de la traduction des protéines et des processus cataboliques de l'acide carboxylique dans la maladie rénale diabétique

Jul 05, 2024

Abstrait: Maladie rénale diabétique (DKD)reste la principale cause demaladie rénale terminalemalgré des décennies d'études. Des modifications dans leglomérule et tubules rénauxtous deux contribuent àpathogenèse de la DKDbien que la majorité des efforts d’investigation se soient concentrés sur le glomérule. Nous avons cherché à examiner la signature d'expression différentielle de la DKD humaine dans le glomérule et le tubule proximal et à corroborer nos découvertes dans le modèle murin de diabète db/db. Une analyse de réseau de transcriptogrammes de données RNAseq provenant du glomérule humain microdisséqué au laser (LMD) et du tubule proximal de DKD etnéphrectomie de référenceles échantillons ont révélé des voies enrichies, notamment des récepteurs de type rhodopsine, une signalisation olfactive et un ribosome (traduction de protéines) dans le tubule proximal d'échantillons de biopsie DKD humaine. La voie de traduction a également été enrichie dans le glomérule. Traduction accrue enrein diabétiques a été validé à l’aide du profilage polyribosomique dans le modèle murin de diabète db/db. En utilisant le séquençage d’ARN nucléaire unique (RNA-Seq) de reins de souris db/db, nous avons donné la priorité à des voies supplémentaires identifiées dans la DKD humaine. La voie de chevauchement supérieure identifiée dans les groupes de tubules proximaux snRNAseq murins et dans le tubule proximal LMD humaincompartiment était le catabolisme de l’acide carboxylique. En utilisant la chromatographie liquide ultra-performante et la spectrométrie de masse, il a également été constaté que la voie du catabolisme des acides gras était dérégulée dans le modèle murin db/db. Le métabolite Acétyl-CoA a été régulé négativement chez les souris db/db, ce qui correspond à l'expression différentielle humaine des gènes ACOX1 et ACACB. En résumé, nos résultats démontrent que les altérations tubulaires proximales de la traduction des protéines etcatabolisme de l'acide carboxyliquesont des caractéristiques clés à la fois humaines etDKD murin. 



Mots-clés :signature d'expression génique ; séquençage d'ARN nucléaire unique ;métabolomique; profilage ribosomal

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DE NOUVELLES HERBES POURREIN DIABÉTIQUE


1. Présentation

Le diabète sucré (DM) touche plus de 400 millions de personnes dans le monde [1] et plus de 30 millions aux États-Unis [2]. La maladie rénale diabétique (DKD) est l'une des complications les plus graves du diabète, touchant 19 millions de personnes aux États-Unis [3], et la principale cause demaladie rénale terminale(ESKD) [4]. La DKD est classiquement considérée comme une maladie glomérulaire ; cependant, se concentrer uniquement sur la pathologie glomérulaire en tant que site principal de la lésion néglige les principales altérations biologiques du compartiment tubulo-interstitiel qui contribuent à la physiopathologie de la DKD [5]. En effet, le pronostic et la progression de la DKD sont souvent parallèles à l'atrophie tubulaire et à l'étendue de la maladie interstitielle [6,7]. Il est également pertinent de montrer que le ciblage du tubule proximal avec des inhibiteurs du SGLT2 ralentit la progression de la DKD [8].

Les mécanismes cellulaires conduisant au développement et à la progression de la DKD sont certes complexes. Le milieu diabétique est caractérisé par des anomalies métaboliques, une inflammation, un stress oxydatif et des altérations de l'homéostasie protéique. Tous ces dérangements contribuent au stress cellulaire et au développement de la DKD. Il existe de plus en plus de preuves qu'une traduction altérée, l'étape fondamentale de l'expression des gènes qui crée des protéines fonctionnelles, est importante à la fois pour répondre et contribuer au stress cellulaire (9,10). Les altérations de la traduction contribuent aux déséquilibres de l'homéostasie des protéines et ont un impact sur la santé humaine et les maladies [11-14].

L'interrogatoire d'échantillons de biopsie de rein humain utilise régulièrement la microscopie optique, la microscopie électronique à transmission et les immunoréactions pour permettre au pathologiste de poser un diagnostic et un pronostic. Cependant, ces outils de diagnostic ont des limites dans la découverte des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies rénales, notamment la DKD. Par conséquent, des modèles animaux de diabète ont été historiquement utilisés pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la DKD ; cependant, aucun de ces modèles ne simule de manière appropriée la DKD humaine (15). Bien que les efforts récents visant à appliquer des techniques d'interrogation moléculaire plus avancées aux échantillons de biopsie de rein humain soient encourageants [16], nous pensons que l'utilisation de modèles animaux en parallèle avec le tissu rénal humain reste une approche expérimentale importante pour fournir des informations uniques sur les fondements moléculaires de la DKD.

Nous avons cherché à examiner la signature d'expression différentielle de la DKD humaine dans le glomérule et le tubule proximal. Nous avons émis l'hypothèse que la signature transcriptomique tubulaire proximale, en plus de celle du glomérule, détermine également les résultats de la DKD. Nous avons abordé cette hypothèse en interrogeant des échantillons de biopsie de rein humain avec microdissection au laser des régions tubulaires glomérulaires et proximales afin d'identifier les voies associées à la DKD et à sa progression. Ensuite, les voies clés ont été corroborées dans un modèle de souris diabétique en utilisant une approche multimodale de séquençage d’ARN nucléaire unique (RNA-Seq), de profilage polyribosomal et de métabolomique. En plus des perturbations dans la traduction des protéines, nos résultats confirment le rôle potentiel du métabolisme de l'acide carboxylique en tant que facteur clé dans la progression de la maladie rénale diabétique.

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2. Matériels et méthodes

2.1. Sujets humains

Cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de la faculté de médecine de l'université d'Indiana (IRB n° 190657223). Vingt-sept échantillons de reins ont été obtenus auprès du Kidney Precision Medicine Project Consortium et de la Biopsy Biobank Cohort of Indiana [17]. Les biopsies rénales étaient des biopsies d'indication pour la protéinurie ou un déclin de la fonction rénale chez les sujets atteints de diabète sucré. Dix-huit échantillons ont été prélevés auprès d’adultes atteints d’insuffisance rénale diabétique et sans seconde lésion glomérulaire. Neuf échantillons de référence sans preuve histologique de DKD ont été prélevés à partir de parenchyme non néoplasique d'échantillons de néphrectomie ou de donneurs décédés. Les variables cliniques et histopathologiques ont été extraites du dossier de santé électronique. Le débit de filtration glomérulaire estimé de base (DFGe) a été défini comme la valeur la plus proche de la date de la biopsie, à moins qu'une diminution de 20 % ou plus du DFGe n'ait précipité la référence à une biopsie. Dans ce scénario, un DFGe dans l'année précédant la biopsie et avant la baisse de 20 % a été défini comme référence pour les calculs de progression.


2.2. Microdissection laser du tissu rénal humain et séquençage de l'ARN

Des cryosections de 12 µm d'épaisseur ont été découpées à partir de blocs de tissus congelés conservés dans un milieu à température de coupe optimale, collées sur des lames membranaires en sulfure de polyphénylène (PPS) et traitées à l'aide d'un protocole Rapid Stain comme décrit précédemment (18, 19). Une zone minimale de 500 000 µm2 a été disséquée pour les compartiments tubulaires glomérulaires et proximaux à l'aide du laser UV pulsé du Leica LMD6500 et d'un objectif 20×. Les tissus disséqués ont été collectés dans un tube stérile sans RNAse contenant un tampon d'extraction d'ARN et l'ARN a été isolé conformément aux instructions du fabricant (Kit d'isolation d'ARN Arcturus PicoPure, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). La qualité de l'ARN a été déterminée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100.

Le séquençage a été effectué au Centre de génomique médicale de l’Université de l’Indiana. L'ARN ribosomal a été épuisé à l'aide du protocole du kit RiboGone-Mammalian (Cat # 634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). Le protocole v2 du kit SMARTer Universal Low Input RNA Kit (Cat # 634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) a été utilisé pour la synthèse d'ADNc et la construction de bibliothèques. Le séquençage a été effectué avec une configuration à extrémités appariées de 2 × 75 pb sur l'Illumina HiSeq 4000 à l'aide du kit HiSeq 3000/4000 PE SBS, et les données séquencées ont été cartographiées sur le génome hg38 à l'aide de STAR. Des lectures de séquençage cartographiées de manière unique ont été attribuées aux gènes du génome de référence hg38 à l'aide de Rsubread featureCounts (20,21).

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2.3. Approbations des études sur les animaux

Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le comité institutionnel de protection des animaux de l'université d'Indiana et sont conformes au guide des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Pour le séquençage en masse de l'ARN, le profilage polyribosomique et la métabolomique, les souches de souris mâles C57BL/6J (n° 000664, contrôle de fond/souris C57) et B6.BKS – Leprdb/J (n° 000697, souris db) ont été obtenues auprès du laboratoire Jackson ( Bar Harbor, ME, États-Unis). Les souris étaient âgées de 9 à 12 semaines et pesaient environ 30 g (souris C57) ou 40 à 50 g (souris db). Les souris ont été sacrifiées et les reins ont été récoltés (n=4 ou 5 par groupe).


2.4. Isolement du tissu rénal de souris et séquençage en vrac de l'ARN

Les reins ont été congelés et l'ARN a été extrait à l'aide d'un kit QIAGEN RNeasy Plus Midi avec une colonne d'élimination de l'ADN génomique. La qualité de l'ARN a été déterminée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100. Le kit de préparation de bibliothèque d’ARNm brins Illumina TruSeq a été utilisé pour la construction de la bibliothèque. Le séquençage a été effectué avec une configuration à extrémités appariées de 2 × 75 pb sur Illumina HiSeq 4000 à l'aide du kit HiSeq 3000/4000 PE SBS, et les données séquencées ont été cartographiées sur le génome mm10 à l'aide de STAR. Des lectures de séquençage cartographiées de manière unique ont été attribuées aux gènes du génome de référence mm10 à l'aide des décomptes de fonctionnalités Rsubread.



2.5. Isolement du tissu rénal de souris et séquençage d'ARN mononucléaire

Des souris âgées de 5, 8, 11, 16 et 20 semaines ont été évaluées (n=5 au total, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Des hétérozygotes de la même souche ont été utilisés comme contrôles de fond (n=3). L'albumine urinaire a été mesurée par un kit ELISA d'albumine de souris (Béthyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA) et la créatinine urinaire a été mesurée par un kit de test de créatinine QuantiChrom (Bioassay System, DICT-500, Hayward , Californie, États-Unis). Sur la glace, une partie de chaque rein a été ajoutée à 1 ml de tampon de lyse Nuclei EZ complété par 2 % d'inhibiteur de protéase (Thermofisher) et 1 % de Superase (Thermofisher). Après hachage, 1 ml de tampon a été ajouté et les tissus ont été homogénéisés à l'aide du broyeur de tissus KONTES Dounce (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). L'homogénat a été doucement mélangé avec 2 ml de tampon et incubé sur de la glace pendant 5 min. L'homogénat a été filtré sur une passoire de 40 µm et traité avec un tampon de lyse additionné de 1 % de Superbase, puis filtré à nouveau sur une passoire de 40 µm.30 µm, puis remis en suspension dans du PBS additionné de 2 % de BSA et 1 %Superase. Cette suspension a ensuite été filtrée sur filtre 5µm filtre et la concentrationa été ajusté à 1 à 3 millions de noyaux/mL avant la soumission au séquençage.
Le séquençage de l'ARN 30 nucléaire unique a été réalisé au Centre de génomique médicale de l'Université de l'Indiana en utilisant le système unicellulaire Chromium version 3 (10 × Genomics, San Francisco, Californie, États-Unis) et le Séquenceur NovaSeq6000 (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis). Cell Ranger 4.0 a été utilisé pour générer des fichiers FASTQ spécifiques à l'échantillon et les lectures ont été alignées sur le génome de référence mm10 à l'aide de STAR. Seurat v 3.0.1 a été utilisé pour intégrer des échantillons à l'aide des mesures de contrôle de qualité suivantes : nombre de gènes compris entre 200 et 3 000 et pourcentage de gènes mitochondriaux inférieur à 50 %. Au total, 58 405 cellules ont été conservées pour une analyse en aval. Le prétraitement standard, la sélection des fonctionnalités, la réduction des dimensions (20 composants principaux), l'identification des ancres entre les échantillons et l'intégration ont étéréalisée selon les méthodes d'ancrage Seurat v3.Les clusters ont été annotés en fonction demarqueurs courants d'expression génique [22] et en utilisant Kidney Cell Explorer [23]. 

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2.6. Isolement des tissus rénaux de souris et profilage polyribosomal

Les souris témoins de fond et db ont été sacrifiées à l'âge de 9 et 12 semaines. La perfusion cardiaque via le ventricule gauche a été réalisée avec 6 mL de cycloheximide (100 µg/mL dans du PBS). Les reins récoltés ont été immédiatement placés dans un tampon de lyse composé de 1 % de Triton X-100, 0,1 % de désoxycholate, 20 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, un comprimé de cocktail d'inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche, Penzberg , Allemagne), 50 µg/mL de cycloheximide et RNAsin (dilution 1:500). Les tissus ont été homogénéisés à 4 ◦C à l'aide d'un homogénéisateur de tissus Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, France). Les homogénats de tissus ont été incubés sur de la glace pendant 10 min, puis centrifugés à 9 600 x g pendant 10 min. Le surnageant a été ajouté au sommet d'un gradient de saccharose généré par BioComp Gradient Master (10 % de saccharosesur 50 % de saccharose dans 20 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, et 50 mg/mLcycloheximide) et centrifugé à 284,000× g pendant 2 h à 4 heures◦C. Les dégradés ont été récoltésdu haut dans une récolteuse Biocomp (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Canada),et la teneur en ARN des fractions ribosomales éluées a été surveillée en continu par UVabsorbance à 254 nm.



2.7. Métabolomique

Pour évaluer les signatures métabolomiques, des échantillons de souris témoins de fond et db (n=5 par groupe) ont été préparés à l'aide du système automatisé MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, NV, USA). L'analyse métabolomique a été réalisée chez Metabolon Inc. En bref, les tissus rénaux congelés ont été traités selon la méthode d'extraction standard de Metabolon conformément au protocole de l'entreprise. Les extraits ont été analysés sur une chromatographie liquide ultra-performance (UPLC) Waters ACQUITY avec une colonne C18 (Waters UPLC BEH C18-2,1 × 100 mm, 1,7 µm) et un appareil Thermo Scientific Q-Exactive haute résolution/précision. spectromètre de masse interfacé avec une source d'ionisation par électrospray chauffée (HESI-II) et un analyseur de masse Orbitrap fonctionnant à une résolution de masse de 35,000.

Les données brutes ont été extraites, identifiées et traitées CQ à l'aide du matériel et du logiciel Metabolon (Durham, Caroline du Nord, États-Unis). Les pics ont été quantifiés en utilisant l'aire sous la courbe. Des analyses statistiques standard avec le test t à deux échantillons de Welch ont été effectuées dans ArrayStudio sur des données transformées en log.




2.8. Expression génétique différentielle, analyse des voies et statistiques

Les données d'expression du LMD humain et des tissus rénaux de souris issues du séquençage de l'ARN ont été normalisées par quantile et l'expression différentielle a été déterminée à l'aide d'un test exact dans edgeR avec des valeurs p < 0.05 considérées comme statistiquement significatives après la fausse analyse de Benjamini-Hochberg. Correction de tests multiples du taux de découverte (FDR). Pour les échantillons de rein de souris ayant subi un séquençage de snRNA, l'expression différentielle a été déterminée à l'aide d'un test Wilcoxon Rank Sum avec des valeurs p ajustées par Bonferroni <0,05 considérées comme statistiquement significatives. Cependant, des valeurs p non corrigées sont fournies dans le manuscrit. Les données d'expression génique ont été étudiées pour les voies enrichies dans Gene Ontology, Kegg et Reactome à l'aide d'une analyse de réseau de transcriptogrammes comme décrit précédemment (19, 24-26). En bref, tous les gènes codant pour les protéines, quelle que soit la valeur p, sont classés par réseaux d'interaction protéine-protéine. Un algorithme de Monte Carlo a été utilisé pour regrouper les gènes selon des fonctions biologiques partagées. La signification est déterminée à l'aide d'un test t de Welch bilatéral après 500 permutations aléatoires pour estimer le taux de fausses découvertes avec des valeurs p < 0,05 considérées comme statistiquement significatives. Étant donné que seul un sous-ensemble de gènes est exprimé dans une cellule donnée pour les données snRNA-seq, la méthode du transcriptogramme n’est pas réalisable pour ce type de données. L'analyse des voies pour snRNA-seq impliquait l'enrichissement de gènes différentiellement exprimés dans Gene Ontology, Kegg et Reactome selon le test exact de Fisher, sans tenir compte des interactions réseau protéine-protéine. Tous les groupes de cellules tubulaires proximales à tous les moments ont été fusionnés pour identifier les gènes enrichis entre les souris témoins et db. Le cluster unique de podocytes a également été fusionné au fil du temps. Cette méthode a également été appliquée aux données d’ARN-seq humain lors de l’évaluation du chevauchement avec l’ensemble de données snRNA-seq. Les valeurs p corrigées par le FDR pour les voies ont été utilisées pour identifier le chevauchement entre les sous-segments correspondants. PAM (partitionnement autourmédoïdes) a été utilisé pour regrouper des échantillons de diabétiques humains en fonction des gènes impliqués dans chaque voie qui se chevauchent. Les caractéristiques cliniques différentielles ont été déterminées à l’aide du test Wilcoxon Rank Sum entre les groupes regroupés.














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