Effets anti-âge des anthocyanes de Ribes Meyeri sur les cellules souches neurales et les souris vieillissantes, partie 2

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Nar sauve les phénotypes sénescents des 23M-NSC

Les anthocyanes R. Meyer sont riches en de nombreux types de flavonoïdes et de composants bioactifs [1,3-5]. Anthocyanes de Meyer. Nous avons révélé que Nar pourrait être un métabolite important des flavonoïdes, car la voie de biosynthèse des flavonoïdes était fortement enrichie en anthocyanes R. Meyer (tableau supplémentaire 1). Pour déterminer les effets anti-sénescents de Nar, diverses concentrations (0, 1,7, 3,4, 6,8, 13,6 et 27,2 ug/mL) ont été appliquées aux 23M-NSC et des dosages CCK-8 ont été utilisés pour enquêter sur la viabilité cellulaire Comme le montre la figure supplémentaire 3, le traitement à 6,8 ug / ml de Nar a augmenté la viabilité cellulaire de 150%. .utilisations de l'hespéridineDans les 23M-NSC traités avec 6,8 ug/mL de Nar, l'expression de l'ARNm de p16nk4a a été réduite (figure 3A). Nar a également allongé les télomères des mNSC cultivées et augmenté la synthèse d'ADN (Figure 3B, 3C). Pour explorer davantage les effets de Nar sur la prolifération cellulaire, nous avons effectué une coloration par immunofluorescence de Ki67, qui est un antigène nucléaire de cellules mitotiques qui s'exprime tout au long du cycle cellulaire, sauf dans G0 [19,27]. Le traitement avec Nar a amélioré la prolifération cellulaire, telle que mesurée par l'augmentation du nombre de cellules Ki 67- positives (Figure 3D, 3E). Ensuite, nous avons également détecté le potentiel de différenciation des NSC en neurones. En effet, le traitement à 6,8 ug/mL de Nar a également augmenté le nombre de cellules positives au MAP 2- (Figure 3F, 3G). Ces résultats démontrent systématiquement que Nar peut inverser la sénescence 23M-NSC.

Figure 2. Les anthocyanes de Ribes Meyer améliorent la mémoire et les capacités d'apprentissage de la souris en augmentant les cellules souches neurales (NSC). (A)Le temps est pris pour trouver la plate-forme. (B) Le temps est pris pour atteindre d'abord la plate-forme. (C) Vitesse moyenne pour trouver la plate-forme. (D)Distance a nagé avant de trouver la plate-forme. (E. F)Traitement avec R.empire perdu cistanchechaque anthocyane a augmenté le nombre et la taille des neurosphères par rapport aux témoins. (G) Les neurosphères de taille 50-100 um ont été augmentées en nombre par le traitement à l'anthocyanine R. Meyer chez la souris. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Figure 3. Effet de la naringénine (Nar) sur la sénescence des cellules souches neurales de souris (MNC). (A) L'expression de l'ARNm de p16k4a a été mesurée par qRT-PCR dans des NSC 23M avec et sans traitement de 6,8 ug/mL de Nar pendant 48 h. (B) Distributions des phases du cycle cellulaire des 23M-NSC traités avec Nar pendant 48 h et des cellules témoins. (C) La longueur relative des télomères des 23M-NSC a augmenté de manière significative avec le traitement Nar, (D) Immunofluorescence Ki67 coloration des muscles traités avec Nar pendant 48 h, avec marquage nucléaire DAPI, (E) Quantification de (D), (F) Représentant champs de coloration MAP2 et GFAPimmunofluorescence des mNSC cultivées après contrôle et traitement Nar. (G) Quantification de (F). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

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Nar améliore la mémoire et la cognition chez les souris vieillissantes

Les niveaux cognitifs diminuent avec le vieillissement et les traitements anti-âge peuvent améliorer les niveaux cognitifs [11, 28]. Pour vérifier les effets anti-âge de Nar in Vivo, nous avons injecté 20 mg/kg de Nar à des souris C57BL/6 vieillissantes (âgées de 12 mois) par la veine caudale. Le test MWM a été utilisé pour examiner la mémoire spatiale et les capacités cognitives des souris.fraction flavonoïde purifiée micronisée 1000 mg utilisationsAu cours de 5 jours d'entraînement répété, le temps nécessaire aux souris vieillissantes traitées au Nar pour trouver la plate-forme a progressivement diminué par rapport au groupe témoin (Figure 4A). Les résultats des tests ont révélé que le temps nécessaire pour atteindre d'abord la plate-forme a été réduit (figure 4B), tandis que le temps passé dans la zone de la plate-forme a été augmenté (figure 4C). En outre, les souris vieillissantes traitées au Nar ont été observées dans la zone de la plate-forme à une fréquence plus élevée que le groupe témoin (figure 4D). Ensemble, ces résultats suggèrent que Nar peut améliorer la mémoire spatiale et les capacités cognitives chez les souris vieillissantes.

Analyse de séquençage de l'ARN du sang traité au Nar de souris vieillissantes

Pour étudier les mécanismes anti-âge spécifiques à Nar, nous avons analysé le profil d'expression génique du sang traité par Nar de souris vieillissantes à l'aide du séquençage d'ARN (ARN-seq). Les résultats ont révélé 1 961 gènes différentiellement exprimés (DEG). En général, l'expression génique de Nar a été régulée à la baisse et seul un petit nombre de gènes ont été régulés à la hausse par rapport au groupe témoin non traité (Figure 5A, 5B). De plus, d'importants gènes de la voie de signalisation liés au vieillissement ont été régulés à la baisse, en particulier ceux de la voie de signalisation du TNF (figure 5C).oteflavonoïdeCes résultats impliquent que Nar affecte la voie de signalisation du TNF, influençant ainsi profondément la fonction du TNF-a, qui est impliqué dans les troubles cognitifs liés au vieillissement [29,30]. Nous avons donc examiné les taux de TNF- dans le plasma de souris. Résultats des tests immuno-enzymatiques d (ELISA)

Figure 4. La naringénine (Nar) améliore la mémoire et les capacités d'apprentissage chez les souris vieillissantes. (A) La latence d'échappement des souris vieillissantes traitées au Nar était plus courte que celle du groupe témoin. (B) Le temps nécessaire pour atteindre la plate-forme pour la première fois était plus court chez les souris vieillissantes traitées au Nar que dans le groupe témoin. (C) Durée du temps passé dans la zone de plate-forme. (D) Fréquence d'observation dans la zone de plate-forme pour les souris vieillissantes traitées au Nar par rapport au groupe témoin. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche peut anti-âge

DISCUSSION

Le vieillissement est associé à un risque accru de déclin cognitif ainsi qu'à une perte des capacités d'apprentissage et de mémoire [22,23]. La perte neuronale et la neurogenèse altérée sont étroitement liées au dysfonctionnement cérébral associé à l'âge [11-13]. Ainsi, l'augmentation du nombre de neurones et l'amélioration de la neurogenèse sont cruciales pour le traitement anti-âge. R. Meyer, une plante riche en flavonoïdes et autres substances bioactives [1, 3-6], possède de nombreuses fonctions qui n'ont pas encore été décrites. Dans la présente étude, les anthocyanes R. Meyer ont favorisé la prolifération des NSC et augmenté la formation de neurosphères avec une morphologie uniforme. Le traitement aux anthocyanes R. Meyer a également amélioré le phénotype de vieillissement cellulaire, avec des niveaux réduits de ROS et d'expression du gène P16nk4 lié au vieillissement, une phase de synthèse d'ADN accrue et des télomères allongés.puritains vitamine cDe plus, les résultats de la coloration par immunofluorescence ont révélé que les anthocyanes R Meyer stimulaient la formation de neurones. Ces résultats suggèrent que les anthocyanes de R. Meyer ont des effets anti-âge sur les mNSC et peuvent également favoriser directement la formation de neurones in vitro. De plus, le déclin cognitif est étroitement lié au vieillissement [22, 23]. Nos résultats MWM ont démontré que l'administration intragastrique d'anthocyanes R. Meyer améliorait la mémoire spatiale et les capacités d'apprentissage chez les souris vieillissantes, et augmentait également

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 ou<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

L'utilisation de l'analyse métabolomique pour étudier la composition spécifique des anthocyanes de R. Meyer a révélé que Nar pourrait être un métabolite flavonoïde important. Il a déjà été rapporté que Nar améliore la sénescence des cellules myocardiques [31], améliore la capacité métabolique du tractus intestinal [32] et exerce des effets anti-inflammatoires [33] et anticancéreux [34]. Cependant, les effets de Nar sur les NSC au cours du vieillissement restent inconnus. Pour explorer les effets anti-âge des anthocyanes R. Meyer, nous avons mené d'autres études en utilisant Nar. Le traitement avec 6,8 ug/mL de Nar a augmenté la viabilité cellulaire, réduit l'expression du gène P16ink4a, allongé les télomères et favorisé la différenciation NSC en neurones in vitro. Pour mieux évaluer les effets de Nar sur la prolifération cellulaire, nous avons effectué des études d'immunofluorescence. Les résultats ont indiqué que le traitement par Nar augmentait à la fois le nombre de cellules Ki67-positives et la proportion de cellules positives pour MAP2-, ce qui suggère que Nar peut favoriser la neurogenèse. De plus, les effets de Nar sur l'apprentissage et la mémoire ont également été évalués chez des souris vieillissantes. Les résultats du test MWM ont constamment démontré que le traitement Nar améliore l'apprentissage spatial chez les souris vieillissantes. Fait intéressant, l'analyse ARN-seq a révélé que Nar peut affecter la sénescence via la voie de signalisation du TNF, en particulier en régulant à la baisse l'expression du TNF-a dans le sang des souris vieillissantes. Les tests ELISA ont également indiqué que le traitement au Nar réduisait les taux plasmatiques de TNF-a par rapport aux souris vieillissantes témoins. Le TNF-a est un facteur clé de la voie de signalisation du TNF et est étroitement lié au vieillissement cognitif. Ses fonctions incluent la promotion de changements pathologiques dans les synapses de l'hippocampe [29] et l'inhibition de la prolifération des cellules précurseurs [35]. Des niveaux altérés de TNF sont associés à des troubles cognitifs dans la dépression, la schizophrénie, le trouble bipolaire et la maladie d'Alzheimer [30,36,37]. Plus précisément, le TNF-a est régulé positivement chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer [38].

En résumé, notre étude démontre que les anthocyanes de R. Meyer améliorent les effets du vieillissement dans les NSC via Nar, qui régule à la baisse les niveaux de TNF-a in vivo et améliore la cognition chez les souris vieillissantes. Ensemble, nos découvertes fournissent une nouvelle stratégie pour le développement de traitements cliniques, visant à mieux réaliser la valeur médicinale des anthocyanes R.Meyer.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Animaux d'expérimentation

Cette étude a été approuvée par le comité de protection des animaux de l'Université de Tongji et menée conformément aux directives institutionnelles. Des anthocyanes R. Meyer ont été administrées par voie intragastrique pendant 2 mois à des souris âgées de 12- mois maintenues sur le fond C57BL/6. Nar a été injecté dans la veine caudale pour des souris âgées de 1- mois à 12- mois maintenues sur le fond C57BL/6. Les souris témoins ont reçu le même volume de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).

Préparation des anthocyanes R. Meyer et Nar

Des fruits R. Meyer (500 g) ont été homogénéisés à l'aide d'un homogénéisateur de tissus et mis en suspension dans 1 L de méthanol contenant 0,1 % d'acide chlorhydrique. L'extraction par ultrasons a été effectuée trois fois pendant 30 min à température ambiante. Les extraits ont été combinés et le méthanol a été concentré sous pression réduite pour obtenir des extraits de R Meyer. L'extrait a ensuite été purifié avec une résine macroporeuse AB-8 pour augmenter la teneur en anthocyanes.

La naringénine (C15H1205 ; MW : 272,25 ; pureté : supérieure ou égale à 98 % ; qualité HPLC) a été achetée auprès de Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Sichuan, Chine) et stockée à 2 degrés {{6 }} degré dans un environnement sec sans lumière. La concentration de la solution mère était de 100 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). La concentration finale de DMSO n'a pas dépassé 0,1 % dans le milieu de culture.

Essais de neurosphère et de différenciation

Les NSC ont été dérivés du SVZ de souris. Les souris ont été sacrifiées après anesthésie et la SVZ a été soigneusement disséquée et dissociée en cellules individuelles avec 0.4 U/mL de papaïne (Imogen, Alexandria, VA, USA ; Cat No : LS003126). Les NSC ont été étalés dans des boîtes de 10 cm contenant 10 mL de milieu de base NSC avec 10 ng/mL d'EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, États-Unis ; Cat No : AF-100-15) et 10 ng/mL de FGF (PeproTech, Cranbury, NJ , États-Unis ; Cat No :AF-100-18B). Les neurosphères ont été passées tous les 5 jours. Des NSC provenant de neurosphères de passage -2 fraîchement dissociées ont été ensemencées sur de la laminine (Gibco, Gaithersburg, MD, États-Unis ; Cat No : 23017015) et du bromhydrate de poly-L-ornithine (Poly-L ; Sigma Aldrich, St Louis, MO, États-Unis ; Cat No : P3655) lames de verre revêtues de NSCBasalMedium sans suppléments de différenciation. Les cellules différenciées ont été immunocolorées pour Tu1 (bêta-tubuline II ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis ; Cat No : 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Cat No : MA5-12826) et la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP ; Thermo Fisher Scientific, Cat No. PA5-16291), puis contre-coloré avec du 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ; Thermo Fisher Scientific, Cat No : D1306). Les lames ont été examinées à l'aide d'un microscope Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, USA). La quantification des cellules TuJ1- et MAP2-positives a été réalisée en comptant les cellules marquées de trois expériences indépendantes. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'un test t non apparié.

Cet article est extrait de www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, n° 17