Facteurs fonctionnels anti-âge et mécanisme de Cistanche Deserticola Ⅱ

3. Résultat

3.1 Principes actifs potentiels et cibles de Cistanche deserticola

En examinant la littérature et en combinant les recherches antérieures de ce groupe de recherche, 12 composants chimiques, dont les glycosides de phényléthanol, les iridoïdes et les lignanes, ont été sélectionnés comme composés cibles pour la recherche en pharmacologie en réseau. Les informations spécifiques sont présentées dans le tableau 3. Après avoir supprimé les doublons de la base de données, un total de 86 cibles pour 12 ingrédients actifs potentiels ont été obtenus.

Cistanche de haute qualité pour anti-âge

3.2 Objectifs liés au vieillissement

7753 et 295 cibles liées au vieillissement ont été collectées respectivement dans les bases de données GeneCards et OMIM.

3. 3 Cibles communes des médicaments et des maladies et construction du réseau PPI

L'intersection des cibles médicamenteuses et des cibles pathologiques a donné lieu à 75 cibles d'intersection, qui ont été importées dans la plateforme d'analyse de réseau STRING, les nœuds non connectés du réseau ont été masqués et un réseau PPI a été construit. Voir les documents de publication améliorés. Il existe au total 45 nœuds et 59 connexions dans le réseau PPI. Huit cibles principales ont été éliminées par analyse topologique, comme le montre le tableau 4.

3.4 Analyse d'enrichissement GO et analyse d'enrichissement KEGG

Grâce à la base de données OmicsBean, les cibles principales ont été soumises à un enrichissement fonctionnel GO et à une analyse de la voie KEGG. L'analyse GO comprend trois aspects : le composant cellulaire, la fonction moléculaire et le processus biologique. Les 10 principaux éléments avec la plus petite valeur P sont présentés dans le matériel de publication amélioré. Les résultats montrent que les processus biologiques impliquent principalement la régulation du métabolisme réactif de l’oxygène, la régulation positive des réponses immunitaires, la localisation des protéines dans les organites, la digestion des polysaccharides, etc. ; les composants cellulaires comprennent principalement le système endomembranaire, la région extracellulaire, la membrane plasmique et les cellules liées à la membrane.

Organes, corps sécrétoires extracellulaires, appareil de Golgi, etc. ; les fonctions moléculaires sont principalement liées à l'activité de la glucosidase, à l'activité régulatrice de l'oxyde nitrique synthase, à la liaison des glucides, à l'activité de la -fructose furanosidase, etc. Au total, 27 voies liées au vieillissement ont été obtenues grâce au criblage d'enrichissement KEGG, et les 20 principales voies ont été regroupées dans une voie diagramme à bulles (voir les documents de publication améliorés). Cistanche deserticola retarde le vieillissement.

Tableau 3 Principes actifs de Cistanche deserticola

Tableau 4 : Cibles principales de Cistanche deserticola pour retarder le vieillissement

Cela implique principalement les voies cancéreuses, les systèmes neurosécrétoires et les voies de transduction du signal. Les voies du cancer comprennent principalement le cancer de la prostate, le cancer du sein et d’autres voies ; le système neuroendocrinien implique la voie de signalisation des œstrogènes, la voie de signalisation de la GnRH et la voie de signalisation de l'insuline (voie de signalisation de l'insuline), etc. les voies de signalisation comprennent la voie de signalisation de la phosphatidylinositol 3-kinase-protéine kinase B (PI3K Akt) et la voie de signalisation de la phospholipase D (voie de signalisation de la phospholipase D).

3.5 Construction du réseau matières médicinales-composants-cibles-voies

Les ingrédients actifs, les cibles et les voies de Cistanche deserticola qui retardent le vieillissement ont été cartographiés dans le réseau matière médicinale-ingrédient-cible-voie via le logiciel Cytoscape 3.8.0. Il y a un total de 114 nœuds et 218 lignes dans ce réseau (voir le matériel de publication amélioré).

3.6 Effet de Cistanche deserticola sur la durée de vie des nématodes

Les résultats des tests de toxicité sont présentés dans la figure 1. Par rapport au groupe témoin, Cistanche deserticola 25 et 50 ug·mL–1

Cela peut prolonger la durée de vie des nématodes. 100 ug·mL–1 n'a aucun effet évident. 200 et 500 ug·mL–1

Il présente une certaine toxicité pour les nématodes et raccourcit leur durée de vie. Sur la base des résultats des tests de toxicité, sélectionnez

Cistanche deserticola a été administré à des concentrations massiques de 25, 50, 75 et 100 ug·mL–1 pour déterminer la durée de vie des nématodes N2. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. Par rapport au groupe témoin, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

La durée de vie des nématodes du groupe a été considérablement prolongée, c'est pourquoi des expériences ultérieures ont été menées à 25, 50 et 75 ug·mL–1.

Figure 1 Courbe de survie des nématodes après administration de différentes concentrations massiques de Cistanche deserticola

• Légende:

• Rouge : groupe de contrôle
• Bleu : Groupe Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Vert : Groupe Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Violet : Groupe Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Orange : Groupe Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Brun : Groupe Cistanche 500 µg·mL⁻¹

• Haches :

• Axe Y : taux de survie (%)

• Axe X : Temps (t/d)

  
  

3.7 Effet de Cistanche deserticola sur la capacité de stress des nématodes

Dans des conditions de stress oxydatif induites par H2O2-, par rapport au groupe témoin, la durée de vie des nématodes du groupe de traitement Cistanche deserticola a été prolongée (Figure 2A). La durée de vie moyenne des nématodes du groupe témoin était de (1,44±0.07) h, et Cistanche deserticola 75 ug·mL– La durée de vie moyenne des nématodes du groupe 1 était de (2,02 ±0, 05) h, et la durée de vie a été considérablement prolongée (P<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tableau 5 Effet de différentes concentrations massiques de Cistanche deserticola sur la durée de vie des nématodes (xˉ±s, n=100)

Note:Par rapport au groupe témoin, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Effet de Cistanche deserticola sur l'accumulation de lipofuscine et la capacité de flexion du corps des nématodes

La lipofuscine s'accumule progressivement avec l'âge. Par rapport au groupe témoin, les niveaux de fluorescence bleue des nématodes dans les groupes Cistanche deserticola 25, 50 et 75 ug·mL–1 ont diminué de 15,09 %, 28,7 % et 39, 86 % respectivement. le 7ème jour (Figure 3A ~ B); Le 11ème jour, les niveaux de fluorescence bleue ont diminué respectivement de 8,55 %, 22,36 % et 36,84 %, indiquant que Cistanche deserticola a inhibé l'accumulation de lipofuscine.

L’effet de Cistanche deserticola sur la capacité de flexion du corps des nématodes est illustré à la figure 3C. Par rapport au groupe témoin, le nombre de temps de flexion du corps des nématodes dans le groupe Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 a augmenté de 25 % et 36 % en 30 s, les jours 3 et 7, respectivement. 17%, ce qui indique que Cistanche deserticola peut favoriser la courbure corporelle des nématodes.

3.9 Effet de Cistanche deserticola sur la capacité de déglutition et la capacité de reproduction des nématodes

Aux jours 3 et 7, par rapport au groupe témoin, il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans le taux de pompage pharyngé (nombre de pompes pharyngées en 60 s) des nématodes du groupe d'administration de Cistanche deserticola (Figure 4A), ce qui indique que Cistanche deserticola n'a pas modifié le taux de pompage pharyngé des nématodes N2. Prise alimentaire, les effets sur la longévité médiés par Cistanche deserticola ne dépendent pas des restrictions alimentaires. Il n'y a eu aucun changement significatif dans le nombre d'œufs (Figure 4B) et le nombre de descendants (Figure 4C) des nématodes traités avec le médicament par rapport au groupe témoin, ce qui indique que Cistanche deserticola n'a pas affecté la capacité de reproduction des nématodes.

3.10 Effet de Cistanche deserticola sur la teneur en ROS, en MDA et l'activité enzymatique antioxydante

La toxicité aiguë du stress entraîne une augmentation des niveaux de ROS. Comme le montrent les figures 5A et 5B, par rapport au groupe témoin, le niveau d'accumulation de ROS des nématodes dans le groupe Cistanche deserticola a été significativement réduit au 7ème jour d'administration (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Légende:

• Rouge : groupe de contrôle
• Bleu : Groupe Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Vert : Groupe Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Violet : Groupe Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Orange : Groupe Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Brun : Groupe Cistanche 500 µg·mL⁻¹

3.11 Effet de Cistanche deserticola sur l'expression de l'ARNm de gènes liés au vieillissement

La voie de signalisation de l'insuline (IIS), parmi les 20 principales voies analysées par KEGG, est étroitement liée au vieillissement de C. elegans, et la recherche sur le mécanisme est relativement mature [10], vérifiant ainsi l'expression de gènes liés au vieillissement sur la voie de signalisation de l'insuline. Les peptides de type insuline (ILP) libérés chez C. elegans se lient à leur récepteur DAF-2 et activent le produit final de glycation avancée-1 (AGE-1), qui active en outre la protéine kinase B{{ 7}}/2 (Akt-1/2). , phosphorylant le facteur de transcription DAF-16, entraînant une activité DAF-16 et

Sa migration vers le noyau est inhibée [11]. Comme le montre la figure 6, par rapport au groupe témoin, les niveaux d'expression des ARNm de DAF-2, AGE-1 et Akt-1 dans les nématodes de Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 groupe étaient significativement réduits (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). Il a été démontré que l’effet de prolongation de la vie médié par Cistanche deserticola dépend de la voie de signalisation IIS. Le gène sir-2.1 joue un rôle important dans les activités physiologiques telles que le vieillissement des nématodes, le stress et l'apoptose. La régulation positive de l’expression du gène sir-2.1 prolongera la durée de vie des nématodes [12], mais il n’y a aucun effet après l’administration du médicament. Modification significative du niveau d'expression de SIR-2. 1 ARNm (Figure 6). HSF-1 et SKN-1 jouent un rôle important dans la régulation du stress oxydatif et du vieillissement chez C. elegans [11]. Les résultats ont montré que par rapport au groupe témoin, Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

Les niveaux d'expression de HSF-1, HSP-16. 1, HSP-16. 2 et SKN-1 dans le groupe C. elegans ont été significativement augmentés (Figure 6). Les facteurs de transcription DAF-16/forkhead box protein (FOXO) et SKN-1/facteur de transcription nucléaire E2-facteur 2 lié (Nrf2) sont activés et peuvent réguler de nombreux gènes codant pour des antioxydants. protéines [13]. Par rapport au groupe témoin, les niveaux d'expression de SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2 et MTL-1 ARNm des nématodes dans le Le groupe Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 a augmenté de manière significative, ce qui indique que Cistanche deserticola peut améliorer la capacité antioxydante. prolongez votre vie. Les restrictions alimentaires peuvent améliorer la fonction mitochondriale et prolonger la durée de vie en limitant l'apport alimentaire [14]. Il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans l'expression de l'ARNm EAT-2 chez les nématodes de chaque groupe, ce qui indique que l'effet de prolongation de la vie médié par Cistanche deserticola ne se produit pas par la voie de restriction alimentaire (Figure 6).

Figure 4 Effet de Cistanche deserticola sur la capacité de déglutition et la capacité de reproduction des nématodes (xˉ±s, n=5)

Légende:

• 对照组 : Groupe témoin
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组 : groupe Cistanche 25 ug/mL
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组 : groupe Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组 : groupe Cistanche 75 ug/mL

Graphique B :

• 30 s内水平游泳距离/次 : Distance de nage horizontale en 30 secondes / temps
• Épisode 3 : Jour 3
• 7 juillet : Jour 7

Graphique C :

• 相关水平的百分率 : Pourcentage du niveau correspondant
• 7 juillet : Jour 7
• 11 janvier : Jour 11

Graphique A :

• 60 s内爬壁次数 : Nombre d'ascensions de murs en 60 secondes
• 第{{0}}日 : Jour 0
• Épisode 3 : Jour 3
• 7 juillet : Jour 7

Graphique B :

• 广泛测试得分 : Résultat du test sur le terrain
• Épisode 1 : Jour 1
• Épisode 2 : Jour 2
• Épisode 3 : Jour 3
• Épisode 4 : Jour 4
• Épisode 5 : Jour 5

Graphique C :

• 千元迷宫次数 : erreurs du labyrinthe en Y
• Épisode 1 : Jour 1
• Épisode 2 : Jour 2
• Épisode 3 : Jour 3
• Épisode 4 : Jour 4
• Épisode 5 : Jour 5

3. 12 Effet de Cistanche deserticola sur la durée de vie des nématodes avec des gènes mutants apparentés

Par rapport au groupe témoin, la courbe de durée de vie des nématodes mutants des gènes daf{{0}}, skn-1 et hsf-1 dans le groupe Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 a fait ne se déplace pas de manière significative vers la droite après le traitement (Figure 7A ~ C). La durée de vie moyenne des nématodes mutants du gène eat -2 a augmenté de 16, 45 % (P < 0, 001, figure 7D).

Les résultats ont montré que l'effet de prolongation de la vie médié par Cistanche deserticola était lié aux gènes daf-16, hsf-1 et skn-1, mais pas au gène eat-2. .

3. 13 Effet de Cistanche deserticola sur la translocation nucléaire des protéines DAF-16 et SKN-1

Des images représentatives de l’expression de la protéine DAF-16 dans le cytoplasme, l’espace intercellulaire et le noyau sont présentées à la figure 8A. Par rapport au groupe témoin, le rapport de localisation nucléaire de la protéine DAF-16 chez les nématodes était significativement augmenté et le rapport de localisation cytoplasmique était significativement réduit après l'administration de Cistanche deserticola (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Figure 5 Effets de Cistanche deserticola sur la teneur en ROS, en MDA et l'activité des enzymes antioxydantes chez les nématodes (xˉ±s, n=100)

Légende:

• 对照组 : Groupe témoin
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组 : groupe Cistanche 25 ug/mL
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组 : groupe Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组 : groupe Cistanche 75 ug/mL

Graphique B :

• 30 s内水平游泳距离/次 : Distance de nage horizontale en 30 secondes / temps
• Épisode 3 : Jour 3
• 7 juillet : Jour 7

Graphique C :

• 相关水平的百分率 : Pourcentage du niveau correspondant
• 7 juillet : Jour 7
• 11 janvier : Jour 11

Graphique A :

• 60 s内爬壁次数 : Nombre d'ascensions de murs en 60 secondes
• 第{{0}}日 : Jour 0
• Épisode 3 : Jour 3
• 7 juillet : Jour 7

Graphique B :

• 广泛测试得分 : Résultat du test sur le terrain
• Épisode 1 : Jour 1
• Épisode 2 : Jour 2
• Épisode 3 : Jour 3
• Épisode 4 : Jour 4
• Épisode 5 : Jour 5

Graphique C :

• 千元迷宫次数 : erreurs du labyrinthe en Y
• Épisode 1 : Jour 1
• Épisode 2 : Jour 2
• Épisode 3 : Jour 3
• Épisode 4 : Jour 4

• Épisode 5 : Jour 5

  
  

3. 14 Effet de Cistanche deserticola sur l'expression protéique de SOD-3, GST-4 et HSP-16.2 chez les nématodes

Les niveaux d'expression des protéines SOD-3, GST-4 et HSP-16.2 ont été visualisés et quantifiés à l'aide des nématodes transgéniques CF1553, CL2166 et TJ375, respectivement (Figure 9). Par rapport au groupe témoin, les niveaux d'expression protéique de SOD-3 et GST-4 chez les nématodes de chaque groupe de concentration massique de Cistanche deserticola ont été significativement augmentés (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).