Facteurs fonctionnels anti-âge et mécanisme de Cistanche Deserticola

[Abstrait] Objectif: Pour explorer lefacteurs fonctionnels anti-âgeet mécanisme de la substance comestible et médicinaleCistanche désertiquebasé sur la pharmacologie de réseau etin vivoexpériences de l'organisme modèleCaenorhabditis elegans. Méthodes: Cibles potentielles des principales composantes deC. déserticola ont été prédits par la base de données et la plateforme d'analyse de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) et d'autres bases de données. Les cibles prédites ont été saisies dans la plateforme d'analyse de réseau STRING pour obtenir le réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) des composants actifs et des cibles de la maladie, afin d'éliminer les cibles principales. L’analyse d’enrichissement des voies de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) a été utilisée pour prédire et analyser les voies d’action, et le réseau de voies de composants-cibles-cibles actives du médicament a été construit par Cytoscape.C. elegansa été divisé en un groupe vide etC. déserticolagroupes avec des concentrations différentes. La durée de vie, la capacité de reproduction et la capacité d'exercice desC. elegansont été observés directement. Les activités de la superoxyde dismutase (SOD), de la catalase (CAT), de la glutathion peroxydase (GSH-Px) et de la teneur en malondialdéhyde (MDA) et en espèces réactives de l'oxygène (ROS) dansC. elegansont été déterminés par le test du kit. La réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT PCR) a été utilisée pour déterminer l'expression de gènes liés à la durée de vie et au changement de capacité au stress chezC. elegans. Résultats: Les facteurs fonctionnels potentiels peuvent agir sur75les objectifs liés au vieillissement, et8protéines cibles principales, y compris la protéine de choc thermique HSP90- (HSP90AA1), le récepteur des œstrogènes (ESR1), GTPase HRas (HRAS), prothrombine (F2), métalloprotéinases matricielles-2 (MMP2), hexokinase-2 (HK2), la sucrase-isomaltase (SI) et la maltase-glucoamylase (MGAM), ont été éliminées par analyse topologique. L'analyse KEGG a montré que Cistanche deserticola pouvait interférer avec27voies de signalisation, notamment la voie de signalisation des œstrogènes, la voie de signalisation du cancer, la voie de signalisation de la GnRH et la voie de signalisation de l'insuline pour retarder le vieillissement.Cistanche désertiquepeut prolonger considérablement la durée de survie moyenne et améliorer la capacité de stress oxydatif deC. elegans, améliorent les activités de SOD, CAT et GSH-Px, et réduisent l'accumulation de ROS et de MDA, ainsi que l'expression depaf-2etâge-1ont diminué, tandis que l'expression depaf-16et ses gènes cibles en aval (putain-3, mtl-1, TPS-4,ctl-1etctl-2) ont été augmentés, ainsi queskn-1et les gènes liés au choc thermique (HSF-1, hsp-16.1ethsp-16.2). Conclusion: La pharmacologie de réseau est appliquée pour expliquer le mécanisme possible deC. déserticolaen anti-âge, et il a été prouvé queC. déserticolapeut prolonger la durée de vie deC. eleganset améliore la capacité anti-stress. Le mécanisme peut être lié à l'inhibition de la voie de signalisation de l'insuline et à l'activation des facteurs de transcription en aval deDAF-16et les gènes liés au choc thermique, améliorant ainsi la capacité de stress oxydatif deC. elegans.

Mots-clés :Cistanche deserticola YC Ma; anti-âge; facteurs fonctionnels; mécanisme; stress oxydatif

EXTRAIT DE CISTANCHE AVEC 75% DE GLYCOSIDES

Cistanche deserticola YC Maest une matière médicinale traditionnelle chinoise précieuse dans mon pays. Il est connu sous le nom de « Ginseng du désert ». Il a été enregistré pour la première fois dans « La matière médicale de Shen Nong » et est répertorié comme étant de la meilleure qualité. Il a un goût sucré, salé, chaud par nature et retourne aux méridiens des reins et du gros intestin. La médecine traditionnelle chinoise estime qu'elle a pour effet de nourrir le yang des reins, de reconstituer l'essence et le sang, et d'hydrater les intestins et le laxatif[1]

. En 2018, la Cistanche deserticola (désert) a été incluse dans le « Catalogue des substances traditionnellement alimentaires et médicinales chinoises » [2], et sa valeur dans le développement de produits de santé a été reconnue. Selon les statistiques, la fréquence de la Cistanche deserticola dans les prescriptions anti-âge et prolongeant la vie est juste derrière le ginseng [3]. La recherche pharmacologique moderne montre que Cistanche deserticola a des effets antioxydants, anti-âge, anti-fatigue, d'amélioration de la mémoire et d'autres effets significatifs [4], mais ses facteurs fonctionnels et son mécanisme anti-âge ne sont toujours pas clairs. Caenorhabditis elegans (ci-après dénommé nématode) est un organisme multicellulaire avec un bagage génétique clair, une durée de vie relativement courte, une reproduction rapide et une culture facile. À mesure que sa durée de vie augmente, il présente un phénotype de vieillissement similaire à celui des humains. Les gènes, les protéines et les voies de signalisation de C. elegans sont hautement conservés chez l'homme.

Il présente 60 à 80 % d’homologie avec les gènes humains. Ces dernières années, les nématodes ont été largement utilisés dans la recherche anti-âge de la médecine traditionnelle chinoise et de la médecine naturelle [5]. Cette étude utilise des méthodes de pharmacologie en réseau pour prédire les ingrédients actifs, les cibles et les voies de signalisation de Cistanche deserticola pour retarder le vieillissement ; en utilisant les nématodes comme organismes modèles, en observant leur durée de vie, leur reproduction et d'autres indicateurs globaux, les changements dans le stress oxydatif, la capacité d'exercice et leur relation avec la durée de vie sont mesurés. L'expression de gènes apparentés, explorant le mécanisme de Cistanche deserticola dans le retard du vieillissement et fournissant informations relatives à la santé

Fournir une référence pour le développement et l’application de produits de santé.

1 Matériel

1.1 Instruments

Stéréomicroscope SMZ-168 (société Motic) ; Microscope à fluorescence à contraste de phase inversé CKX41 (société Olympus) ; Lecteur de microplaques Multiskan FC (société scientifique Thermo Fisher) ; Amplificateur de gène de réaction en chaîne par polymérase (PCR) Mycycler, instrument de PCR quantitative à fluorescence MJ Mini™ (Bio-Rad Company).

1.2 Tester le médicament

Cistanche deserticola a été collecté dans la base de plantation de Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) dans le comté de Yutian, Xinjiang. Il a été identifié par le chercheur Zhang Tiejun de l'Institut de recherche pharmaceutique Co., Ltd. de Tianjin comme étant Cistanche deserticola YC Ma ; Ester d'acide diéthylique de 2ʹ,7ʹ-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH DA), 2 % de NaN3 (Sigma Company) ; Réactif Trizol, kit de synthèse d'ADNc, SYBR Green Kit (Takara Bioengineering Co., Ltd.) ; un kit de superoxyde dismutase (SOD), un kit de catalase (CAT), un kit de glutathion peroxydase (GSH Px), un kit de malondialdéhyde (MDA) (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.) ; réaction en chaîne par polymérase quantitative de fluorescence (qRT PCR) Les amorces requises ont été synthétisées par Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd., et les séquences d'amorces sont présentées dans le tableau 1.

1.3 Nématodes

Les 10 types génétiques différents de nématodes utilisés dans l’expérience provenaient tous du Caenorhabditis Genetics Center. Les informations détaillées sont présentées dans le tableau 2.

2 Méthode

2.1 Criblage des facteurs fonctionnels et des cibles de Cistanche deserticola

En examinant la littérature et en combinant la caractérisation antérieure du groupe de matériaux de Cistanche deserticola par ce groupe de recherche, les principaux composants chimiques et composants sanguins ont été éliminés [{{0}}]. Dessinez la structure du composé dans le logiciel ChemDraw 19.0, saisissez-la dans la base de données SwissTargetPrediction (//new.swisstargetprediction.ch/) et utilisez la méthode de correspondance pharmacophore inverse pour obtenir des résultats de dépistage virtuel. Dans le même temps, la base de données et la plateforme d'analyse pharmacologiques du système de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php) ont été utilisées. Utilisez la fonction de recherche UniProtKB dans la base de données UniProt (http://www.uniprot.org/) et Reviewed

Swiss-Prot filtre les protéines, limite l'espèce à « humaine » et corrige la protéine cible du composé selon le nom du gène. Intégrez les résultats cibles des deux bases de données pour obtenir une bibliothèque cible potentielle de composés.

2.2 Analyse prédictive des cibles liées au vieillissement

Utilisez les bases de données GeneCards (https://www.genecards.org/) et OMIM (https://omim.org/) pour effectuer une recherche avec les mots-clés « vieux, sénile, décrépit, sénescence, faible, caducité », où GeneCards Genes with un score supérieur ou égal à 10 % ont été criblés, les résultats des deux bases de données ont été fusionnés, les gènes en double ont été éliminés et les cibles liées au vieillissement ont finalement été obtenues. Combinez ensuite les cibles des facteurs fonctionnels du point 2.1 avec les cibles liées au vieillissement mentionnées ci-dessus, prenez l'intersection et dessinez un diagramme de Venn.

2.3 Construction d'un réseau d'interaction protéine-protéine (IPP)

Saisissez la cible d'intersection obtenue dans la plateforme de données STRING 11.5 (http://string-db.org/), limitez l'espèce à "Homo sapiens", le niveau de confiance le plus élevé du score d'interaction est 0.900, et obtenez le réseau PPI. Enregistrez les données au format .TSV et importez-les dans Cytoscope

3. 8.0 logiciel, ajustez la taille du nœud et la profondeur de couleur avec la valeur du degré pour obtenir le réseau PPI des ingrédients actifs de Cistanche deserticola et des cibles de maladies. Les points dont les trois paramètres de degré, d'intermédiarité et de proximité étaient tous supérieurs à la médiane ont été sélectionnés comme cibles principales, et un total de 8 cibles principales ont été obtenues après sélection.

2. 4 Bioanalyse de l'ontologie des gènes (GO) et gènes et gènes de Kyoto

L'analyse d'enrichissement de la voie Encyclopedia of Groups (KEGG) utilise la base de données OmicsBean (//www.omicsbean.cn/login/) pour effectuer une analyse fonctionnelle GO et une analyse d'enrichissement de la voie KEGG sur les cibles d'intersection, trier en fonction de la valeur P, et Analyser les voies qui en résultent.

2.5 Construction du réseau matières médicinales-composants-cibles-voies

Importez des matières médicinales, des composants, des cibles et des voies dans le logiciel Cytoscope 3.8.0 pour construire un réseau de matières médicinales-composants-cibles-voies Cistanche deserticola.

2.6 Culture des nématodes

Les nématodes ont été cultivés à 20 degrés en utilisant un milieu NGM (contenant 0,750 g de NaCl, 0,625 g de tryptone et 4,250 g d'agar dans 250 ml d'eau bidistillée). Escherichia coli OP50 stérilisé (65 degrés, 45 min) a été utilisé comme source de nourriture et réparti uniformément sur la surface du milieu de culture NGM. Utilisez une solution de lyse (5 % NaClO, 5 mol·L-1 NaOH) pour synchroniser les nématodes et cultiver les nématodes synchronisés au stade L4 dans un incubateur à 20 degrés. Les nématodes au stade L4 ont été sélectionnés au hasard et divisés en groupes témoins (milieu NGM) et groupes d'administration de Cistanche deserticola avec différentes concentrations massiques pour les expériences.

2.7 Préparation du médicament

Prendre 10 g de matière médicinale Cistanche deserticola, ajouter de l'eau distillée selon le rapport matière-liquide de 1:10, refluer et extraire deux fois, 2 h à chaque fois, combiner les extraits aqueux, filtrer et concentrer à sec sous pression réduite. Utilisez de l'eau distillée stérile pour préparer une solution mère avec une concentration massique de 50 mg·mL–1 (basée sur la quantité de médicament brut). Utilisez le milieu de culture NGM pour préparer des solutions avec des concentrations massiques finales de 0, 25, 50, 75, 100, 200 et 500 ug·mL-1 pour une utilisation ultérieure.

2.8 Essai de toxicité

Les nématodes N2 ont été transférés dans des boîtes de Pétri contenant différentes concentrations massiques de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL–1), 100 dans chaque groupe. Le jour de l'administration a été compté comme jour 0. Changez chaque jour le milieu contenant le médicament frais et enregistrez la mort des nématodes pour obtenir la plage posologique sûre de Cistanche deserticola.

2.9 Expérience de stress

Les nématodes N2 ont été transférés dans des cellules contenant différentes concentrations massiques de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1

) dans la boîte de Pétri, 100 dans chaque groupe. Le jour de l'administration du médicament a été compté comme le jour 0. Un nouveau milieu de culture contenant le médicament a été remplacé chaque jour. Une expérience de stress a été menée le 7ème jour d'administration du médicament. Dans l'expérience sur le stress oxydatif, les nématodes de chaque groupe ont été transférés dans un milieu NGM (10 µL de H2O2 à 30 % ont été ajoutés à chaque 10 mL de milieu NGM) et la survie des nématodes a été enregistrée toutes les 30 minutes. Dans l'expérience sur le stress thermique, les nématodes ont été continuellement exposés à 35 degrés et cultivés, et l'état de survie des nématodes a été enregistré toutes les 2 heures.

2. 10 Expérience de flexion du corps

Prendre les nématodes N2, les regrouper et administrer les mêmes traitements qu'en 2.9. Les 3ème et 7ème jours après l'administration du médicament, une expérience de flexion du corps a été réalisée. 20 nématodes ont été prélevés dans chaque groupe et le nombre de courbures corporelles des nématodes en 30 secondes a été détecté et enregistré.

2. 11 Expérience de pompe pharyngée

Prenez les nématodes N2, regroupez-les et administrez-les dans les mêmes conditions que 2.9, mettez 1 nématode dans chaque boîte de Pétri et définissez 5 parallèles pour chaque concentration massique. Observer sous un stéréomicroscope les jours 0, 3 et 7 d'administration. La fréquence de déglutition des nématodes a été observée pendant 60 s à chaque fois et le nombre de pompes pharyngées a été enregistré.

2.12 Expérience de reproduction

Prenez les nématodes N2 au stade L1, placez-les dans le milieu médicamenteux et cultivez-les jusqu’au stade L4. Ensuite, transférez-les chaque jour dans un nouveau milieu contenant le médicament avec des concentrations massiques différentes et mesurez le nombre d’œufs pondus par les nématodes. Les anciennes plaques contenant les œufs sont placées. Après 48 h de culture à 20 degrés, le nombre de descendants a été déterminé. Chaque boîte de Pétri contient 1 nématode et 5 parallèles sont définis pour chaque concentration massique.

2.13 Détermination de l'accumulation de lipofuscine

Prenez les nématodes N2, groupez et administrez les mêmes traitements qu’en 2.9, avec 100 nématodes dans chaque groupe. Des expériences de mesure de la lipofuscine ont été réalisées aux 7ème et 11ème jours d'administration du médicament. 35 nématodes ont été sélectionnés au hasard et placés sur des feuilles d'agarose à 2 %, anesthésiés avec 2 % de NaN3 et utilisés un microscope à fluorescence (la longueur d'onde de la lumière d'excitation était de 360 ​​à 370 nm et la lumière émise (longueur d'onde : 420 à 460 nm). Observez le bleu autofluorescence chez le nématode et utiliser le logiciel imageJ 1.51 pour quantifier l’intensité de la fluorescence.

2. 14 Détermination de la teneur en MDA, ROS et activité enzymatique antioxydante

Prenez les nématodes N2, regroupez-les et administrez les mêmes traitements qu'en 2.9, avec 100 nématodes dans chaque groupe. Le 7ème jour après l'administration, les nématodes présents sur le milieu de culture de chaque groupe ont été lavés avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 % et collectés dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, homogénéisés sur de la glace et centrifugés à 3 000 r·min{{ 10}} pendant 10 min (rayon centrifuge 42, 5 mm), prélevez le surnageant après centrifugation et utilisez un kit pour mesurer les activités de la teneur en SOD, CAT, GSH-Px et MDA. Dans l'expérience de détermination des ROS, les nématodes ont été lavés trois fois avec du tampon M9, placés dans une solution DCFH-DA avec une concentration finale de 10 μmol·L–1 et incubés à 37 degrés dans l'obscurité pendant 20 minutes, en les agitant toutes les 5 minutes. min. Lavez ensuite deux fois avec le tampon M9 et placez les nématodes sur une lame de verre. Prenez des photos à l’aide d’un microscope à fluorescence (longueur d’onde de la lumière d’excitation 485 nm, longueur d’onde de la lumière d’émission 520 nm) et utilisez le logiciel ImageJ 1.51 pour évaluer l’intensité relative de la fluorescence.

2. 15 Facteur d'accélération de la désintégration-16 (DAF-16), translocation nucléaire de SKN-1 et SOD-3, glutathion S-transférase-4 (GST{{ 8}}), protéine de choc thermique-16. 2 (HSP -16. 2) Visualisation utilisant respectivement les nématodes transgéniques TJ356 et LG333 pour les expériences de translocation nucléaire des protéines DAF-16 et SKN-1.

Les nématodes transgéniques CF1553, CL2166 et TJ375 ont été utilisés pour déterminer l'expression des protéines SOD-3, GST-4 et HSP-16.2. Le regroupement et l'administration sont les mêmes que ceux du point 2.9. Le septième jour après l'administration du médicament, un microscope à fluorescence a été utilisé pour prendre des photos des nématodes de chaque groupe et le logiciel ImageJ 1.51 a été utilisé pour quantifier l'intensité de fluorescence de la GFP.

2. 16 Détermination de la durée de vie des nématodes mutants

Les expériences ont été menées avec les nématodes CF1038, EU1, PS3551 et DA1116, respectivement, et ont été divisées en groupe témoin et groupe d'administration de Cistanche deserticola 75 ug·mL–1. Le taux de survie des nématodes de chaque groupe a été compté chaque jour. 2. Expérience 17 qRT-PCR : des nématodes N2 de stade L4 ont été transférés dans un milieu de culture NGM (contenant 150 μmol·L–1 de pentfluorouracile) contenant différentes concentrations massiques de Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 μmol·L–1), 20 Incuber au degré pendant 6 jours. L'ARN total des nématodes a été extrait à l'aide de la méthode Trizol et transcrit de manière inverse en ADNc pour la quantification de l'ARNm. Les données ont été traitées à l'aide de la méthode 2 – ΔΔCt et act-1 a été utilisé comme gène de référence interne.

2.18 Analyse des données

Le logiciel SPSS 19.0 a été utilisé pour l'analyse statistique et les données sont exprimées sous la forme (-x ± s). Les différences entre les groupes ont été analysées par ANOVA unidirectionnelle et P<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. Résultat

3.1 Principes actifs potentiels et cibles de Cistanche deserticola

En examinant la littérature et en combinant les recherches antérieures de ce groupe de recherche, 12 composants chimiques, dont des glycosides phényléthanoïdes, des iridoïdes et des lignanes, ont été sélectionnés comme composés cibles pour la recherche en pharmacologie en réseau. Les informations spécifiques sont présentées dans le tableau 3. Après avoir supprimé les doublons de la base de données, un total de 86 cibles pour 12 ingrédients actifs potentiels ont été obtenus.