L'échafaudage activé par le gène Klotho anti-âge favorise la réponse rajeunissante de cicatrisation des plaies dans les cellules souches dérivées du tissu adipeux humain

Mots clés:anti-âge; -Klotho ; échafaudage activé par les gènes ; les cellules souches dérivées du tissu adipeux ; angiogenèse;dépôt de matrice ;guérison rajeunissante

Cliquez ici pour obtenir Herb Cistanche pour l'anti-âge et la cicatrisation des plaies

1. Introduction

La cicatrisation des plaies est un processus biologique complexe qui nécessite une orchestration étroite de multiples événements cellulaires [1]. Cependant, dans la population vieillissante, les événements cellulaires sont perturbés, entraînant un retard de cicatrisation [2]. La perturbation des mécanismes de guérison est due en partie à la réduction du homing des cellules progénitrices de la moelle osseuse et à d'autres maladies métaboliques courantes telles que le diabète.3,4]. Dans la gestion des plaies, l'application d'échafaudages en biomatériaux devient de plus en plus courante en tant que traitement. Échafaudages en biomatériauxprotéger la plaie contre l'infection, absorber les exsudats de la plaie et garder la plaie humide pour prévenir la nécrose des tissus [5]. Les thérapeutiques peuvent également être chargées dans des échafaudages de biomatériaux et favoriser une cicatrisation plus rapide des plaies difficiles à cicatriser [1]. Cependant, les échafaudages de biomatériaux seuls peuvent ne pas orchestrer efficacement les multiples cascades de signalisation se produisant dans la plaie. La délivrance de cellules souches est parfois proposée comme solution pour modérer les événements complexes de signalisation dans la plaie [6]. 

Les cellules souches sécrètent des facteurs paracrines et peuvent se différencier en cellules de plusieurs lignées tissulaires.7]. Les cellules souches sont généralement délivrées dans la plaie par des injections intradermiques [6], pulvérisation topique [8], ou en tant que greffons issus de l'ingénierie tissulaire [9]. Ces dernières années, l'application de greffons issus de l'ingénierie tissulaire pour la cicatrisation des plaies chroniques a progressivement gagné en popularité en raison de leur capacité à cicatriser rapidement les plaies.9–11]. Apligraf® et dermagreffe® sont deux des constructions de bio-ingénierie approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) largement utilisées pour le traitement des plaies chroniques [12,13]. Cependant, la génération de ces greffons nécessite une culture cellulaire prolongée pour produire un nombre élevé de cellules [14]. Lors de l'utilisation de cellules souches, une culture prolongée peut augmenter la sénescence cellulaire et diminuer la souche des cellules souches [15,16]. Par conséquent, le maintien de la souche des cellules souches est essentiel pour obtenir une réponse thérapeutique optimale. La délivrance de gènes thérapeutiques aux cellules souches à l'aide de vecteurs non viraux est une stratégie potentielle pour améliorer la fonctionnalité des cellules souches.17]. Traditionnellement, les cellules sont transfectées dans des cultures 2D puis transplantées in vivo [18]. Cependant, des plateformes telles que les échafaudages activés par des gènes, constitués d'échafaudages de biomatériaux fonctionnalisés avec des nanoparticules portant le transgène thérapeutique [19], que notre groupe a été le premier à offrir une solution alternative pour transfecter les cellules dans un environnement 3-D. Cette étude s'est concentrée sur le développement d'une version activée par les gènes de l'échafaudage 3D collagène-sulfate de chondroïtine (coll-CS) qui a un énorme potentiel de traduction clinique, car sa composition est similaire à celle du modèle de régénération cutanée (DRT) d'Integra, un modèle cliniquement approuvé. échafaudage pour la cicatrisation des plaies chroniques [20]. Nous utilisons principalement un polymère cationique appelé polyéthylèneimine (PEI) pour condenser des plasmides d'ADN codant pour des gènes de facteurs de croissance tels que le facteur dérivé du stroma -1 alpha et le facteur de croissance nerveuse et les assembler en nanoparticules chargées [21–23]. Ces nanoparticules chargées sont ensuite chargées de trempage dans notre échafaudage coll-CS pour générer les échafaudages activés par les gènes. Nos études précédentes ont également montré que l'échafaudage activé par les gènes à base de PEI peut provoquer une surexpression transitoire du transgène thérapeutique dans une gamme de cellules cicatrisantes et favoriser leurs capacités de régénération [21,24,25]. Traditionnellement, l'échafaudage activé par les gènes a été développé pour cibler les cellules hôtes et favoriser la réparation locale [26]. Cependant, de nouvelles preuves indiquent que les échafaudages activés par des gènes chargés de cellules ont une puissance supérieure pour régénérer des structures tissulaires complexes que les échafaudages activés par des gènes seuls [27]. 

L'abondance cellulaire est l'une des exigences cruciales pour la génération de greffons issus de l'ingénierie tissulaire.28]. Le tissu adipeux est une source riche qui peut fournir un grand nombre de cellules souches. Le tissu adipeux contient jusqu'à 500 fois plus de cellules souches pour une même masse de moelle osseuse, une source tissulaire traditionnelle pour l'extraction des cellules souches.29]. De plus, les cellules souches peuvent être extraites du tissu adipeux à l'aide d'un procédé de liposuccion mini-invasif.29]. Notre étude récente a révélé que les cellules souches adipeuses humaines (ADSC) démontrent une excellente biocompatibilité avec l'échafaudage coll-CS. L'utilisation d'un échafaudage activé par un gène pro-angiogénique a encore amélioré les réponses régénératives des ADSC [30]. Cependant, les ADSC ont tendance à perdre leur souche lors de l'expansion [31]. Auparavant, nous avons découvert qu'une protéine anti-âge -Klotho pourrait améliorer significativement la prolifération des ADSC humains sains et diabétiques [32]. La plupart des études utilisent généralement la variante primaire -Klotho [33–35] et ont montré que la protéine peut augmenter la durée de vie des ADSC en activant l'activité transcriptionnelle de la télomérase [33]. -Les MSC surexprimant Klotho se sont également avérées exercer de puissants effets anti-fibrotiques dans les lésions rénales par l'inhibition de Wnt / -signalisation caténine [36]. Cependant, le rôle de -Klotho dans les cellules souches reste relativement inexploré.

Outre la différence d'orientation de la recherche entre les - et -Klotho, l'anti-âgeLes protéines Klotho ne sont pas encore pleinement intégrées dans les stratégies d'ingénierie tissulairepour la cicatrisation des plaies. Par conséquent, dans cette étude, nous avons cherché à étudier l'impact fonctionnel d'un -Échafaudage activé par le gène Klotho sur des ADSC humains pour des applications de cicatrisation des plaies. Nousont d'abord étudié les activités transcriptionnelles des facteurs de pluripotence classiques (oct-4,Nanog et Sox-2), marqueur de prolifération (Ki-67) et régulateurs de cicatrisation (TGF- 3 et TGF- 1) dans les ADSC. Nous avons ensuite évalué la bioactivité du milieu conditionnégénéré par l'échafaudage activé par le gène chargé d'ADSC pour évaluer son potentiel paracrine.Enfin, nous avons examiné la régénération de la membrane basale (fibronectine, laminine,et collagène IV) et les protéines associées aux cicatrices ( -SMA et élastine) dans les ADSC chargéséchafaudage activé par des gènes pour évaluer la maturation contrôlée des tissus.

2. Résultats

2.1. -L'échafaudage activé par le gène Klotho améliore de manière transitoire la souche des ADSC humains et les gènes pro-réparateurs

L'analyse de l'expression génique a d'abord montré que les ADSC sur l'échafaudage activé par le gène surexprimaient le -Gène Klotho plus de 172- fois (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1UN). Cette découverte a confirmé l'interaction efficace des ADSC avec l'échafaudage activé par les gènes. L'analyse du marqueur de prolifération Ki-67 a en outre confirmé que les ADSC sur l'échafaudage activé par le gène maintenaient également une capacité proliférative robuste sur 14 jours (Figure1UN). Ayant confirmé la surexpression de l'anti-âge -Klotho, nous avons ensuite évalué le rajeunissement des cellules souches par l'activation de facteurs de "pluripotence" dans les ADSC. Globalement, nous avons noté une régulation transitoire des trois facteurs de transcription sur les 14 jours (Figure1B). Cependant, les ADSC n'ont montré qu'une augmentation significative de l'expression du gène Oct-4 qui s'est maintenue jusqu'au jour 14. Plus précisément, les ADSC ont montré un 2.5- fois (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Les taux de TGF-pro-fibrotique 1 gène dans le -Les ADSC surexprimant Klotho se sont avérés comparables à ceux du groupe d'échafaudage sans gène au cours des 14 jours. Cependant, les niveaux de TGF- anti-fibrotique 3 étaient significativement (3,6- fois,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Échafaudage activé par le gène Klotho

Améliore la puissance paracrine des ADSC humains2.2.1. Bioactivité pro-angiogénique Le test de bioactivité du CM généré par un échafaudage activé par des gènes chargés d'ADSC a d'abord montré qu'il pouvait contrôler temporairement l'activité métabolique dans les HUVEC. Le CM du jour 3 a considérablement amélioré l'activité métabolique des HUVEC, tandis que l'utilisation du CM âgé à partir du jour 14 a considérablement réduit l'activité métabolique des HUVEC (Figure2UN). Ceci étant constaté, nous avons ensuite testé l'impact pro-angiogénique du CM à partir du jour 3 et 14 sur les HUVEC ensemencées sur Matrigel. Comme prévu, le jour 3 CM du groupe d'échafaudage activé par le gène de manière significative (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Cependant, aucune autre augmentation de l'activité angiogénique ne s'est produite avec le jour 14 CM par rapport à celle du jour 3 CM. En outre, le jour 14 CM des deux groupes a présenté une efficacité pro-angiogénique similaire (Figure2C). Collectivement, notre découverte indique que l'échafaudage activé par les gènes accélère de manière transitoire la réponse pro-angiogénique des ADSC.

pro-fibrotique TGF- 1. ** et * indiquentp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± écart-type (n = 3).

Figure 2. Bioactivité paracrine pro-angiogénique de l'échafaudage CM activé par le gène chargé d'ADSC. (A) Le CM produit par l'échafaudage activé par le gène chargé d'ADSC au cours des 14 jours a démontré une capacité à contrôler temporairement l'activité métabolique des HUVEC. (B) Jour 3 CM du groupe d'échafaudage activé par le gène a considérablement amélioré la formation de tubules endothéliaux et sa ramification par rapport à celle du groupe d'échafaudage sans gène. (C) Formation de tubules et ramification des cellules endothéliales 6 h après l'exposition au CM des ADSC échafaudage ensemencé activé par des gènes et sans gènes, * indique p <0.05. Les données représentent la moyenne ! écart type (n=3)

2.2.2. Guérison et maturation des fibroblastes dermiques

L'une des conclusions de l'étude sur l'angiogenèse est qu'à mesure que l'échafaudage activé par les gènes chargés d'ADSC mûrit, il ne favorise plus l'angiogenèse. En outre, au jour 14, leur puissance angiogénique était similaire à celle du groupe d'échafaudage sans gène (figure 2B, C). Semblable au résultat de l'étude d'angiogenèse, les deux groupes ont démontré des niveaux similaires de fermeture de la plaie fibroblastique avec le jour 14 CM. Plus précisément, les deux groupes ont cicatrisé la plaie d'environ 40 % en 12 h (figure 3A). Cette découverte a révélé qu'au cours de la maturation, le groupe d'échafaudage activé par le gène soutient mais ne favorise pas la fermeture de la plaie des fibroblastes dermiques.

Néanmoins, comme les fibroblastes ont été stimulés avec des CM âgés, nous avons étudié si les influences de l'expression des protéines matricielles impliquées dans la maturation de la plaie. Comme prévu, les fibroblastes dermiques stimulés avec CM du groupe d'échafaudage sans gène ont abondamment exprimé la protéine de collagène I pro-fibrotique (figure 3B). Au contraire, les fibroblastes stimulés avec CM du groupe d'échafaudage activé par le gène ont démontré une expression inférieure de 50 % (p <0,05) de la protéine de collagène I. Pendant ce temps, les deux groupes manquaient d'expression de collagène anti-fibrotique, et aucune différence n'a été observée entre les deux groupes. Pris ensemble, cela implique que l'échafaudage activé par le gène améliore la réponse modulatrice ADSCswound pendant la maturation.

Figure 3. Influence de la paracrine sur la cicatrisation et la maturation cutanées. (A) Le CM âgé de 14 jours des deux groupes a exercé des niveaux similaires d'activité de fermeture des plaies dans les fibroblastes dermiques adultes humains d'environ 4 0 % en 12 h. (B) Le CM de l'échafaudage activé par le gène a considérablement réduit l'expression de collagène pro-fibrotique dans les fibroblastes. " indique p < 0,05 Les données représentent la moyenne=écart-type (n=3). Dans la figure 3B, GAS et GFS représentent respectivement l'échafaudage activé par les gènes et l'échafaudage sans gènes

2.3. L'échafaudage activé par le gène B-Klotho améliore la régénération de la membrane basale avec une réponse anti-fibrotique améliorée dans les ADSC humains

Après avoir observé la stimulation contrôlée de la fonctionnalité des ADSC par l'échafaudage activé par les gènes, nous avons finalement étudié la réponse des ADSC à la régénération des matrices et des protéines dermiques. L'échafaudage activé par les gènes a considérablement amélioré la régénération de la membrane basale des ADSC. Plus précisément, l'échafaudage activé par le gène a favorisé de manière significative le dépôt des composants de la membrane basale laminine et collagène IVFigure 4A). Après l'analyse semi-quantitative, nous avons également noté que le dépôt de matrice suivait une tendance par rapport au groupe d'échafaudage sans gène. La tendance observée était la fibronectine (1,0- fois) < laminine (2,1- fois, p < {{10}}.05) < collagène IV (8.8- fois, p < 0,01). Une fois la capacité à régénérer la membrane basale déterminée, nous avons ensuite évalué l'expression de protéines cruciales pour une cicatrisation qualitative supérieure, telle qu'une réduction des cicatrices. Les ADSC sur l'échafaudage activé par le gène ont démontré une expression réduite de manière significative (p <0, 05) de la protéine contractile associée à la cicatrice a-SMA. L'expression de l'a-SMA dans les ADSC était inférieure de 50 % par rapport au groupe d'échafaudage sans gène (figure 4B). Enfin, après avoir observé l'expression réduite de l'a-SMA, nous avons évalué l'expression de la protéine de matrice élastique, l'élastine. Les ADSC sur l'échafaudage activé par le gène ont démontré une expression qualitative d'élastine relativement supérieure grâce au dépôt d'un réseau fibreux mature d'élastine par rapport aux ADSC sur l'échafaudage sans gène (figure 4B).

Figure 4. Dépôt de protéines de matrice pro-cicatrisation par les ADSC dans l'échafaudage activé par le gène au jour 14. (A) Les ADSC dans l'échafaudage activé par le gène ont démontré une régénération significative. fonctionnement de la membrane basale par rapport aux ADSC dans l'échafaudage sans gène. Les ADSC ont principalement déposé un réseau relativement mature de protéines de collagène IV, suivi de la laminine et de la fibronectine. (B) Les ADSC de l'échafaudage activé par le gène ont également exprimé 2- fois plus faible de la protéine SMA par rapport aux ADSC du gène -échafaudage libre. En conjonction avec sous-sol mem. régénération des branes, les ADSC dans l'échafaudage activé par les gènes ont déposé une matrice élastique qualitativement meilleure. Toutes les images ont été capturées à travers un objectif 20x à l'aide d'un microscope IX73 Olympus* et * indique respectivement p <0.01 et p < 0.05. Barre d'échelle 50um. Les données représentent l'écart type moyen (n=3).-SMA et la fibronectine ont été doublement immunocolorées.

E-mail :wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950