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Activité antinociceptive des stolons de salsa Cistanche, en croissance dans la République du Kazakhstan

Elmira B. Kartbaevaa, et al

ABSTRAIT

HerbeCistanche(espèce Cistanche) en médecine traditionnelle chinoise est utilisée pour le traitement de plusieurs maladies et symptômes, y compris la douleur. L'objectif de cette étude était d'évaluer l'effet antinociceptif de l'hydroéthanoliqueextrait deCistanchesalsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae, stolons dans des modèles animaux de douleur. La composition chimique deHerbeCistanchea été analysé par HPLC-UV. Des souris Swiss Webster (25–30 g, n=6) ont été prétraitées par voie orale avecHerbeCistanche(10, 30 ou 100 mg/kg) et évalué dans le test au formol et dans la réponse de léchage induite par la capsaïcine ou le glutamate. KazakhHerbe Cistancheest composé principalement de glycosides phénylpropanoïdes, à partir desquelséchinacoside, actéoside, ettubulosideB sont les principaux constituants. LorsqueHerbeCistanchea été administré à des souris, il a eu un effet dans les deux phases du test au formol (77 % d'activité à 30 mg/kg pour la phase 1 et 62 % d'activité à 100 mg/kg pour la phase 2) suggérant des propriétés analgésiques et anti-inflammatoires. KazakhHerbeCistanchea pu réduire le temps de léchage des animaux après injection de glutamate (réduction de 81 % à 30 mg/kg) et de capsaïcine (réduction de 81 % à 100 mg/kg). Nous concluons que les composés phénoliques présents dans l'extrait hydroéthanolique de C. salsa pourraient être responsables de son profil pharmacologique. Afin de s'approvisionner en matière première de bonne qualité pour la médecine traditionnelle chinoise, nous avons recommandé de standardiser cette espèce kazakhe à l'aide deéchinacoside et actéosidecomme marqueurs.

Mots clés:Herba Cistanche,HPLC-UV,Échinacoside, Actéoside, Tubuloside, Normalisation

Introduction

Cistanchesalsa(CA Mey) Beck, Orobanchaceae, est une plante parasite de la République du Kazakhstan où elle est utilisée comme matière première industrielle (Sarsenbayev et al., 2011 ; Grudzinskaya et Gemedzhieva, 2012). La valeur scientifique de cette herbe dans la médecine traditionnelle chinoise concerne le traitement des problèmes rénaux (allant de la douleur à l'insuffisance), de l'impuissance, de l'infertilité féminine, de la leucorrhée morbide, de la métrorragie abondante et de la constipation sénile (Jiangsu New Medical College Dictionary of Traditional ChineseDrugs, 1977 ; Herbes médicinales chinoises, 1988). La composition chimique des stolons d'autres espèces deCistanchea déjà été étudiée en détail par des scientifiques chinois. Les composés phénoliques suivants ont été identifiés :échinacoside, tubuloside, actéoside, outre les lignanes, les iridoïdes et un polysaccharide complexe (Yong et Tu, 2009 ; Zhang et al., 2003 ; Xie et al., 2005 ; Jiang et al., 2009 ; Suiet al., 2011 ; Liu et al., 2013 ; Zhou et al., 2014).

Shimoda et al. (2009) ont montré que cette herbe possède un effet hypocholestérolémiant tandis que Yang et al. (2013) ont déterminé son activité hépatoprotectrice. Nan et al. (2013) ont rapporté l'activité anti-inflammatoire de ses extraits. Un polysaccharide complexe précédemment isolé de cette plante a montré des effets immunomodulateurs (Wang et al., 2009).

Bien qu'il y ait une quantité considérable deCistanchestolons en République du Kazakhstan, il n'y a pas d'utilisation populaire de cette plante par la population kazakhe bien que les voisins en Chine l'utilisent intensivement. En raison du fait qu'il existe aujourd'hui un problème considérable lié à la substitution/adultération des plantes médicinales et le besoin croissant de standardiser les médicaments à utiliser dans la médecine traditionnelle chinoise, cette étude a été conçue pour déterminer la composition chimique phénolique de cette matière première végétale poussant au Kazakhstan voisin. ainsi que d'évaluer son utilisation comme antinociceptif pour potentiellement soulager la douleur - ce qui caractérise l'une de ses principales utilisations en Médecine Traditionnelle Chinoise.

matériaux et méthodes

Matériel végétal

Cistanchesalsa (CAMey.) Beck, Orobanchaceae, stolons ont été collectés dans le désert de Moinkum, Village de Bakanas, en juillet 2014 à Almaty. Le matériel végétal a été identifié par le Dr G. Sitpayeva de l'Institut de Botanique et de Phytointroduction, Ministère de l'Education et des Sciences de la République du Kazakhstan où il a été déposé sous le numéro 01-04/306.

Analyse chimique

Des stolons de C. salsa (2 g) ont été soumis à une extraction par micro-ondes. Initialement, le matériau a été broyé à 0.001–2.000 mm puis placé dans un récipient hermétique pour être extrait pendant 10 min at100–1100 ◦C avec de l'éthanol à 80 % (rapport 1:10). L'extrait hydroéthanolique (CSHE) a été analysé par HPLC-MS. L'extrait brut a été dissous dans du méthanol (9,6 mg/ml) et filtré à travers une membrane en Téflon de 0,45 mm avant l'analyse. Un chromatographe en phase liquide modèle HP 1100 Series (société Agilent Technologies, Inc., CA, USA), équipé d'un dégazeur à vide, d'une pompe à gradient basse pression à quatre canaux et d'un injecteur automatique. Les composés phénoliques ont été séparés par chromatographie par une colonne Zorbax Eclipse XDB-C18, 2,1 × 50 mm, remplie de polymère de gel de silice octadécylsilyle (1,8 µm). L'analyse chromatographique a été effectuée avec un flux de phase mobile de 0,2 ml/min, une pression de fonctionnement de l'éluant de 175 à 200 kPa, une température du four à colonne de 30 ◦C, un volume d'échantillon de 2 ml, un mode d'alimentation en éluant à gradient : 0 à 36 min 10 % A - 90 % B;36 min – 100 % B (éluant A : méthanol, éluant B : solution d'acide formique à 0,2 %). La détection a été effectuée par UV aux longueurs d'onde de 254, 334, 350, 410, 450 et 550 nm. La comparaison des temps de rétention obtenus, des spectres UV et de masse avec ceux des composés de référence a été utilisée pour l'identification des composés chimiques dans l'extrait. L'analyse quantitative a été réalisée par l'utilisation de standardsverbascosideetéchinacosideanalysés dans les mêmes conditions chromatographiques. Leurs courbes d'étalonnage ont permis de calculer la quantité de chacun des autres glycosides phénylpropanoïdes dans l'extrait éthanolique de cette plante. La méthode n'a pas été validée.

Animaux

Des souris Swiss Webster (20 à 25 g, âgées de deux mois) ont été utilisées dans cette étude (données par l'Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brésil). Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard (cycle lumière-obscurité de 12 h, 22 ± 2 degrés et 70 à 80 % d'humidité. Nourriture et eau à volonté). Les animaux n'ont reçu que de l'eau afin d'éviter toute interférence de la nourriture avec l'absorption de la substance 12 h avant le début des expériences. L'acclimatation aux conditions de laboratoire a eu lieu pendant au moins 1 h avant chaque essai. Tous les protocoles ont été menés conformément aux directives sur les normes éthiques pour l'investigation de la douleur expérimentale chez les animaux et ont suivi les principes et directives adoptés par le Conseil national pour le contrôle de l'expérimentation animale (CONCEA), approuvés par l'Institut des sciences biomédicales/UFRJ, Ethical Comité pour la recherche animale et a reçu le numéro DFBCICB015-04/16. Tous les protocoles expérimentaux ont été réalisés pendant la phase lumineuse. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum et conformément aux règles de CONCEA. A la fin de chaque expérience, les souris ont été tuées par surdosage de kétamine/xylazine.

Traitements

Dans cette étude, la CSHE a été évaluée à 10, 30 et 100 mg/kg. L'extrait a été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, FisherBiotech) afin de préparer une solution mère à 100 mg/ml. Le PBS a été utilisé comme diluant pour la préparation des différentes doses. Solutions contenant 10, 30 et 100 mg/kg d'extrait hydroéthanolique deCistanchesalsaont été préparés. Les médicaments standard utilisés étaient la morphine 2,5 mg/kg (Merck, diluée dans une solution saline tampon phosphate (PBS)), l'acide acétylsalicylique 200 mg/kg (Sigma Aldrich, dissous avec 5 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans 0,9 solution saline) et capsazepine 10 nMolper paw. Une solution saline plus DMSO (à la même concentration que dans le traitement le plus élevé avec l'extrait) a été administrée au groupe témoin négatif. Tous les traitements (extrait testé et standards) ont été administrés par voie orale. La seule exception était la capsazépine qui était administrée par injection intraplantaire.

Douleur aiguë induite par le formol

Une solution de formol à 2,5 % (formaldéhyde à 37 %) a été injectée (20 ul) dans la région plantaire de la patte arrière droite de souris 60 minutes après le traitement (extrait hydroéthanolique deCistanchesalsaou acide acétylsalicylique 200 mg/kg ou morphine 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Les animaux ont été placés individuellement dans une chambre en verre transparent et la durée en secondes qu'ils ont passées à lécher leur patte après l'injection de formol a été enregistrée et analysée sur deux périodes distinctes, la phase précoce de la douleur neurogène (0 à 5 min après l'injection) et la phase tardive. douleur inflammatoire (15 à 30 min après l'injection).

Nociception induite par la capsaïcine

Ce test était basé sur la méthode décrite par Sakurada et al. avec quelques modifications (Sakurada et al., 1992). De la capsaïcine (20 ul)C18H27NO3 (Galena, Campinas, SP) a été injectée dans la région plantaire de la patte arrière droite des souris (1,6 ug/patte) une heure après le traitement (extrait hydroéthanolique deCistanchesalsa ou capsazépine10 nMol/patte). Les animaux ont été placés individuellement dans une chambre de verre et la ou les durée(s) de léchage de patte ont été enregistrées entre 0 et 5 min après l'injection de capsaïcine puis analysées.

Nociception induite par le glutamate

Dans la méthode décrite par Beirith et al. (2002), une solution de glutamate dans du PBS (20 ul) (acide l-glutamique, Sigma–Aldrich, 3,7 ng/patte) a été injectée dans la région plantaire de la patte arrière droite des souris une heure après le traitement (extrait hydroéthanolique deCistanchesalsa ou morphine 2,5 mg/kg). Les animaux ont été placés individuellement dans une chambre en verre et la durée du léchage de pattes (secondes) a été enregistrée entre 0 et 15 min après l'injection de glutamate, puis analysée.

analyses statistiques

Les données chimiques sont présentées sous forme de moyenne ± ET de cinq expériences. Tous les groupes expérimentaux pharmacologiques consistaient en un minimum de six souris. L'analyse de la variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test de Dunnett a permis de visualiser la signification statistique entre les groupes à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5.0. les pvalues ​​étaient considérées comme significatives lorsqu'elles étaient inférieures à 0.05(p <>

Résultats

CistancheLe chromatogramme de l'extrait d'hydroéthanol de salsa (deux dilutions différentes) est illustré à la Fig. 1. Le tableau 1 montre la détermination des composés phénoliques ainsi que leurs temps de rétention respectifs dans le chromatogramme.

Effet du CSHE sur la douleur aiguë induite par le formol

Dans le test de douleur aiguë induite par le formol, les CSHE à 10, 30 et 100 mg/kg ont pu réduire le léchage de pattes dans la première phase du test connue sous le nom de phase de douleur neurogène, ces réductions étaient de 60, 77 et 58 %, respectivement. . De plus, ils étaient également efficaces pour réduire la douleur inflammatoire induite au cours de la deuxième phase du test, le pourcentage d'inhibition de la douleur inflammatoire était de 42, 46 et 62 %, respectivement (Fig. 2). La morphine (2,5 mg/kg) et l'acide acétylsalicylique (200 mg/kg) ont présenté les résultats suivants : 55 %/33 % et 31 %/54 % pour les première et deuxième phases, respectivement.

Effet du CSHE sur la nociception induite par le glutamate

Le CSHE a réduit le léchage induit par le glutamate aux trois doses testées, 10, 30 et 100 mg/kg de 76, 81 et 53 %, respectivement (Fig. 3). La morphine à 2,5 % a entraîné une réduction de 76 %

Effet du CSHE sur la nociception induite par la capsaïcine

Afin de vérifier si le CSHE affecterait la nociception via les récepteurs TRPV1, il a été testé dans un modèle de douleur induite par la capsaïcine. L'effet antinociceptif à travers ce modèle a été observé pour le CSHE dans les trois doses testées, de 76, 79 et 81 %, respectivement (Fig. 4). La capsazépine 10 nMol/patte a entraîné une réduction de 60 %.

Discussion

Au total, dix glucosides phénylpropanoïdes ont été identifiés dans l'extrait hydroéthanolique de C. salsa (qui pousse au Kazakhstan).Échinacoside(10,98mg/g),actéoside(9,44 mg/g) et le tubuloside B (7,94 mg/g) étaient les principaux composés identifiés. Les données obtenues ont été corrélées avec la littérature disponible pour les espèces deCistanchecroissant dans différentes régions d'Asie (Zhou et al., 2014 ; Xieet al., 2005 ; Jiang et al., 2009).Échinacosideetactéosidesont les principaux composants, qui forment la base de la standardisation des espèces officinalesCistanchedésertique etCistanchetubulosa, répertorié dans la pharmacopée chinoise en 2005. Nous proposons que ces composés puissent également être utilisés pour la standardisation deCistancheles stolons de salsa du Kazakhstan, car ils sont les plus importants dans l'extrait d'hydroéthanol étudié.

Selon les résultats pharmacologiques de cette étude, il est possible de suggérer que le CSHE est un agent efficace contre la douleur neurogène et l'inflammation comme observé dans le test au formol. Au meilleur de notre connaissance,Cistanchela salsa n'a jamais été testée par rapport à ses actions antinociceptives. Une étude de 2002 avecCistanchedeserticola (Lin et al., 2002) a montré que cette plante présentait des activités antinociceptives et anti-inflammatoires lorsqu'elle était testée dans des modèles tels que les contorsions totales, le formol et l'œdème de la patte. Bien qu'il n'y ait eu aucune tentative d'enquêter sur les principaux constituants actifs des extraits, ils ont considéré l'extrait de butanol et la couche aqueuse comme les actifs. Sans surprise, ces solvants sont à l'échelle de polarité qui correspond aux glycosides phénylpropanoïdes trouvés dansCistanchesalsa. De plus, Lin et ses collaborateurs ont établi que l'action antinociceptive deCistanchedes extraits de deserticola n'était pas due à l'action du composé sur le récepteur des opiacés ou liée au système immunitaire. Dans notre étude, l'extrait riche en phénylpropanoïdes a montré une activité dans les deux phases du test au formol. L'activité observée était due en fait à la cible pharmacologique recherchée et non à une éventuelle altération motrice comme en témoigne le test au rotarod. Les résultats des tests au formol indiquent le potentiel de douleur neurogène ainsi que la douleur induite par les médiateurs inflammatoires. Initialement, nous avons décidé d'étudier la voie de la douleur neurogène. Étant donné que des composés similaires d'autres espèces précédemment étudiées n'ont montré aucune activité de récepteur opiacé, nous avons décidé de tester d'autres modèles, tels que les modèles de glutamate et de capsaïcine.

Le glutamate est un neurotransmetteur excitateur qui joue un rôle important dans la modulation de la douleur dans les systèmes nerveux périphérique et central. Cette action est médiée par les récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluR) et les récepteurs métabotropiques du glutamate. Les iGluR peuvent être divisés en N-méthyl-d-aspartate (NMDA) et -amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-acide propionique (AMPA) (Kolber, 2015). La recherche a montré que lors de l'antagonisme des récepteurs NMDA et AMPA avec la kétamine et le kainate, respectivement, des effets antinociceptifs sont observés. Cependant, les antagonistes ciblant ces récepteurs ont jusqu'à présent induit un effet indésirable substantiel et pour cette raison, de nouvelles recherches se concentrent sur le mGluRshoping selon lequel un médicament médié par ce récepteur causerait moins d'effets secondaires (Palazzo et al., 2014). Les résultats du test du CSHE ont montré que ce traitement était efficace pour réduire la douleur induite par le glutamate. Cependant, on ne sait toujours pas si cet effet est médié par des récepteurs ionotropes et/ou métabotropes. La morphine est l'un des médicaments disponibles ayant un effet sur la transmission glutamatergique (Deyama et al., 2007). Il est rapporté dans la littérature que l'activation des récepteurs du glutamate augmente les réponses TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Pour cette raison, il est possible que l'effet observé pour le CSHE soit dû à une activité sur TRPV1 et pas nécessairement à une réponse directe sur les récepteurs du glutamate.

L'étape suivante de cette recherche consistait à réaliser un test de léchage de pattes en utilisant la capsaïcine comme agent algésique, qui est un agoniste du récepteur TRPV1. Les résultats ont montré qu'effectivement, le CSHE diminuait la douleur grâce au récepteur TRPV1.

Dans le cas du CSHE, presque dans toutes les méthodologies testées, nous avons pu observer que la dose de 30 mg/kg donnait de meilleurs résultats que 100 mg/kg. Cela peut être dû à la saturation de la solution conduisant à des composés précipités et à une quantité effectivement moindre de médicaments biodisponibles.

La confirmation de la composition chimique établie pour l'extrait kazakh CSHE était une étape importante car les principaux constituants présents dans celui-ci ont déjà vu leurs actions antinociceptives/anti-inflammatoires confirmées d'une manière ou d'une autre. Par exemple,échinacosidea été établi comme l'un des principes actifs responsables de l'action antinociceptive de l'échinacée (Hostettmann, 2003). En outre, une étude antérieure de Schapoval et ses collaborateurs (Schapoval et al., 1998) a soulignéactéosidecomme l'un des principaux principes actifs dans un extrait à l'éthanol préparé avec Stachytarpheta cayennensis tel qu'évalué par l'œdème de la patte et les modèles de plaque chauffante. Backhouse et ses collègues (Backhouse et al., 2008) sont également considérésactéosideêtre le principe actif de Buddleja globosa en utilisant plusieurs modèles d'évaluation de la douleur, dont le test au formol. De nouvelles formulations sont actuellement développées en utilisant les connaissances de pointe pour augmenter la stabilité et prolonger l'action antinociceptive deactéoside(Isacchi et al., 2016).

Conclusion

Dix substances de nature phénolique ont été identifiées dans les stolons du KazakhstanCistanchesalsa par analyse HPLC/MS. Ces composés pourraient être responsables de l'activité antinociceptive observée dans les modèles expérimentaux réalisés ici. considérant que sur le territoire du Kazakhstan le genreCistancheest représenté principalement par des espècesCistanchesalsa, nous pouvons recommander sa récolte et sa standardisation à l'aideéchinacosideetactéosideen tant que composés standard, pour obtenir une matière première de bonne qualité pour la médecine traditionnelle chinoise.

Divulgations éthiques

Protection des sujets humains et animaux. Les auteurs déclarent que les procédures suivies étaient conformes aux règlements du comité d'éthique de la recherche clinique compétent et à ceux du Code d'éthique de l'Association médicale mondiale (Déclaration d'Helsinki).

Confidentialité des données.

Les auteurs déclarent qu'aucune donnée patient n'apparaît dans cet article.

Droit à la vie privée et au consentement éclairé. Les auteurs déclarent qu'aucune donnée patient n'apparaît dans cet article.

Contributions des auteurs

EBK a exécuté la collecte de la plante, la préparation de l'extrait et l'analyse des résultats chimiques ainsi que la rédaction de l'article ; GRD, a exécuté tous les tests pharmacologiques ; ZBS a conçu l'étude en collaboration avec FB ; LNI et ENB, ont participé à la conception de la pharmacopée de l'étude pour l'inclusion des résultats obtenus dans la pharmacopée kazakhe ; IIT, a exécuté les analyses HPLC ; PDF, a conçu l'étude pharmacologique et FB, a organisé l'équipe ensemble afin de rédiger cet article.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Les auteurs du Brésil remercient M. Alan Minho pour l'assistance technique et l'Instituto Vital Brazil pour les dons d'animaux utilisés. Ils souhaitent également reconnaître les subventions du CNPq et de la Fundac¸ ão Carlos Chagas Filho de Apoio à Pesquisa do Estadodo Rio de Janeiro. Les auteurs irlandais souhaitent remercier le programme de recherche sur les établissements de troisième niveau de la High Education Authority pour le soutien financier du cycle 5 à TBSI et souligner l'importance du programme SFI ISCA-Brazil (grantno. SFI/13/ISCA/2843) qui a contribué au collaboration entre le Brésil et l'Irlande. Les auteurs du Kazakhstan tiennent à remercier KazNMU pour le soutien financier accordé à l'exécution de ce travail.

Extrait de : "Activité antinociceptive des stolons de salsa de Cistanche, en croissance dans la République du Kazakhstan" par Elmira B. Kartbaevaa, et al

---EB Kartbaeva et al. / Revista Brasileira de Farmacognosia 27 (2017) 587–591

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