L'inhibition du récepteur des hydrocarbures aryliques rétablit le dysfonctionnement endothélial médié par le sulfate d'indoxyle dans les anneaux aortiques du rat Ⅱ
Dec 18, 2023
3. Discussion
L’augmentation de la production de CYP1A1 et de ROS induite par l’activation de l’AhR joue un rôle essentiel dans l’altération de la vasodilatation dépendante de l’endothélium [24,25]. Les résultats de la présente étude suggèrent que le blocage de l'AhR avec CH223191 a atténué l'expression du gène prooxydatif CYP1A1 médié par IS etProduction de ROSdans l'aorte et l'expression préservée de l'eNOS ainsi que la réponse vasodilatatrice dépendante de l'endothélium à l'ACh. Une altération de la vasodilatation dépendante de l'endothélium suite à une exposition à l'IS a déjà été observée en milieu clinique chezPatients atteints d'IRC, de plus, la diminution des niveaux d'IS dans la circulation avec l'AST-120 a amélioré la fièvre aphteuse chez les patients atteints d'IRC [8] et amélioré la réponse endothéliale dans la microvascularisation des patients en phase terminalemaladie rénalepatients utilisant l’ionophorèse [26]. De même, dans les modèles animaux deMRC, le traitement par AST-120 a rétabli la relaxation dépendante de l'endothélium dans les anneaux aortiques [11]. Ensemble, ces résultats indiquent que l'IS est impliqué dans l'altération de la fonction endothéliale dépendante des vaisseaux microvasculaires et des conduits. Une limite potentielle à cette étude est que les expériences ont été réalisées en l'absence de protéines plasmatiques telles que l'albumine. Par conséquent, la concentration d'IS libre utilisée pour ces études aiguës peut être supérieure à celle observée dansPatients atteints d'IRC, cependant, le but de la présente étude était d'étudier les mécanismes de la fonction vasculaire induite par l'IS.
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L'endothélium vasculaireréglemente le naviretonus des conduits et des artères de résistance via plusieurs facteurs, l'oxyde nitrique (NO) étant considéré comme le principal mécanisme affecté par l'urémie [8,10,11,26-28]. Des études antérieures ont démontré une réduction de l'oxyde nitrique synthase endothélial (eNOS) et la production de NO dans les cellules endothéliales stimulées par l'IS est associée à une augmentation des ROS via l'activation de la NADPH oxydase, ainsi qu'à l'inhibition des systèmes antioxydants (8,10,14,15). En outre,MRCles rats traités avec AST-120 ont signalé une restauration de l'expression du NO et de l'eNOS, ainsi que des taux sériques d'IS plus faibles (29). De plus, la suppression génétique de l'AhR réduit la vitesse de l'onde de pouls par rapport aux souris de type sauvage, indiquant une élasticité accrue des vaisseaux, qui s'accompagne d'une augmentation de la teneur en NO et de l'activité de l'eNOS (30). Les résultats de ces études précédentes sont en accord avec ceux observés ici, où une augmentation de l'expression endothéliale de NOX4, de nitrotyrosine et de superoxyde et une réduction concomitante de l'eNOS ont été observées après la stimulation de l'IS. De plus, ces modifications de l'endothélium ont été empêchées en présence de CH223191. Des études antérieures ont examiné la relaxation indépendante de l'endothélium dans l'aorte en présence d'IS en utilisant le nitroprussiate de sodium donneur de NO ; cependant, aucun changement dans la réponse n'a été observé même après quatre jours d'incubation avec 1 mM IS par rapport aux conditions témoins [11], cette relaxation n'a donc pas été étudiée dans la présente étude.
Il a été rapporté que l’activation de l’AhR et sa voie en aval jouent un rôle dans le dysfonctionnement vasculaire dépendant de l’endothélium, l’hypertension et l’hypertrophie cardiaque, induisant l’expression du CYP1A1 et augmentant les ROS dans le système vasculaire et le cœur [24,25]. Des études chez des souris knock-out du CYP1A1 ont rapporté que l'activation de l'AhR empêchait l'augmentation de la production de superoxyde dans ces tissus et rétablissait la relaxation endothéliale (25). De plus, les souris knock-out AhR, ou l'inhibition pharmacologique du récepteur avec la -naphtoflavone (-NF), également un agoniste partiel de l'AhR, dans la néphropathie diabétique ont entraîné une réduction du stress oxydatif (31). Conformément à ces observations, des études sur l'activation de l'AhR des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) ont également démontré une élévation du stress oxydatif induit par l'IS avec une réduction concomitante du NO et une augmentation de l'expression du CYP1A1, qui ont été inhibées par l'inhibition de l'AhR ou empêchées. de pénétrer dans la cellule par inhibition du transporteur d'anions organiques probénécide [8,15].
L’augmentation du stress oxydatif peut être causée par un déséquilibre entre les états pro- et antioxydants. En examinant l'activation induite par AhR et Nrf2-de l'ARE, nous n'avons trouvé aucun changement dans l'expression des enzymes antioxydantes. Auparavant, Bolati et al. ont montré qu'une augmentation de l'IS régule négativement l'expression du gène Nrf2 dans les cellules HK2. De plus, dans un modèle de rat d'IRC avec une IS sérique élevée, l'expression réduite des protéines Nrf2 et NQO1 a été atténuée après un traitement par AST -120 (32). Nos résultats suggèrent que la phase II de la voie génomique pourrait ne pas encore être activée compte tenu de l'exposition aiguë de 4 heures à
EST utilisé dans cette étude. Une évaluation future de ces mécanismes antioxydants est justifiée en utilisant une période plus longue d’activation de l’AhR induite par l’IS.
L'acide indole-3 acétique (IAA) est un autre agoniste de l'AhR et du PBUT, qui augmente progressivement dans lecirculation des patients atteints d'IRCet prédictives de mortalité et d'événements cardiovasculaires indésirables majeurs, les taux sériques de cette molécule étaient corrélés à des marqueurs d'inflammation et d'oxydation [33]. De plus, la stimulation par l'IAA des HUVEC a entraîné une augmentation de l'expression des gènes du CYP1A1 et de la cyclo-oxgénase -2 (COX -2) ainsi qu'une augmentation de la production de protéines COX -2 et de ROS. En présence de CH223191, ces modifications de l'inflammation et du stress oxydatif ont été significativement réduites ou supprimées (33).
On sait que les réponses inflammatoires induites par l'IS entraînent l'expression de molécules d'adhésion, de cytokines inflammatoires et de chimiokines [11, 15, 34] qui contribuent à la pathogenèse du dysfonctionnement vasculaire. Il a été rapporté que CH223191 inhibe l'expression de la protéine chimio-attractive des monocytes induite par l'IS -1 (MCP -1) dans les HUVEC (15), atténuant ainsi l'inflammation vasculaire. De plus, les HUVEC transfectées par siAhR ont supprimé l'inflammation vasculaire renforcée par l'IS (médiée par le TNF), l'adhésion des leucocytes et l'expression du gène de la sélectine E (34). De plus, l'exposition à l'IS (1 mM) d'anneaux aortiques isolés d'animaux sains pendant quatre jours maximum a non seulement réduit la relaxation dépendante de l'endothélium, mais également réduit la coloration du CD31 et augmenté la molécule d'adhésion des cellules vasculaires-1 (VCAM{{18 }}) et l'expression de la molécule d'adhésion intracellulaire -1 (ICAM-1) dans l'aorte [11]. De la même manière, les aortes récoltées sur des souris CKD à dix semaines présentaient une relaxation réduite dépendante de l'endothélium, celle-ci étant encore réduite lorsqu'elles étaient incubées avec IS. Ces changements se sont accompagnés d'une réduction de la coloration CD31 et d'une augmentation de la coloration ICAM-1 et VCAM-1. De plus, le traitement des animaux atteints d'IRC avec AST-120 a amélioré la relaxation dépendante de l'endothélium et réduit l'expression des marqueurs d'adhésion vers les niveaux de contrôle [11]. Nos résultats examinant l'effet à court terme de l'IS avec et sans inhibition de l'AhR sur l'expression de VCAM-1 sont cohérents avec les résultats précédents décrits ci-dessus. Il est intéressant de noter que 4 heures après la stimulation par IS, l'expression du gène TNF semble être en augmentation, une découverte que nous avons déjà démontrée 18 heures plus tard dans les cellules endothéliales aortiques humaines, les cellules THP-1, les myocytes et fibroblastes cardiaques de rat et les cellules rénales de rat. cellules mésangiales [35–37]. D'autres ont également signalé une expression accrue du TNF dans les lignées cellulaires de monocytes et de macrophages (38, 39). Dans les macrophages, cela impliquerait des interférences entre AhR, le facteur nucléaire κB (un médiateur central de l’inflammation) et le suppresseur de la signalisation des cytokines 2 [39]. Cependant, à notre connaissance, l'effet inhibiteur direct du CH223191 sur l'expression du gène du TNF induit par l'IS dans le système vasculaire n'a pas encore été rapporté, ce qui pourrait constituer un nouveau mécanisme pour de futures recherches sur l'inflammation vasculaire induite par l'IS.
AhR est exprimé de manière omniprésente [40], ce qui suggère que son inhibition pourrait jouer un rôle dans l'atténuation des effets indésirables dans de nombreux tissus associés à l'IRC. Nous avons déjà montré que l'EI induit des effets cardiaques etcollagène rénalsynthèse dans les fibroblastes cardiaques et les cellules mésangiales rénales ainsi que l'hypertrophie myocytaire dans les myocytes cardiaques et les réponses inflammatoires dans les cellules THP -1 [35]. De plus, dans les modèles d'IRC et d'infarctus du myocarde où l'IS sérique et la fibrose cardiaque et rénale sont augmentés, il a été démontré que le traitement par AST-120 réduisait ces effets [41-43]. Ichii et coll. [44] ]. Dans le rein diabétique, on pense que l'AhR joue un rôle dans la fibrose, l'inflammation et le stress oxydatif, en augmentant l'expression de la coloration trichrome, de l'actine des muscles lisses, de la fibronectine, de la prostaglandine sérique E2 (PGE2), des produits finaux de glycation avancée du sérum, de la COX{{ 12}}, infiltration de macrophages F4/80, activité NOX et marqueur des dommages oxydatifs 8-hydroxydésoxyguanosine. L’expression accrue de ces marqueurs a été empêchée chez les souris diabétiques knock-out AhR et les souris diabétiques de type sauvage traitées avec l’antagoniste de l’AhR -NF (31). De plus, les études in vitro de Lee et al. (2016) ont montré que, tandis que la stimulation des cellules mésangiales de rat et de souris et des cellules tubulaires rénales humaines avec la N-ε-carboxyméthyl-lysine (CML), un produit final majeur de glycation avancée, augmentait l'expression de l'AhR, du collagène IV et du facteur de croissance du tissu conjonctif. , la fibronectine et la PGE2, cette expression a été empêchée dans les cellules transfectées avec shRNA-AhR ou traitées pharmacologiquement avec -NF (31).
Il est clair que l’AhR joue un rôle important dans la pathologie cardiovasculaire etmaladie rénaledans le cadre de l'IRC, offrant une nouvelle possibilité d'intervention thérapeutique. Les résultats des essais EPPIC faisant état d'un résultat neutre avec l'AST-120 [23], d'autres stratégies sont nécessaires pour atténuer les effets néfastes des PBUT dans l'IRC. Compte tenu de l'abondance de données indiquant le bénéfice de l'inhibition de l'AhR, in vivo, in vitro ou ex vivo, qu'elles soient génétiques ou pharmacologiques, une étude de preuve de principe in vivo examinant le CH223191 dans un modèle cliniquement pertinent de maladie rénale chronique et démontrant son efficacité serait nécessaire pour faire passer cette classe de médicaments à l’étape suivante.
En conclusion, la présente étude démontre qu'une altération de la vasodilatation endothéliale dépendante induite par l'IS est associée à un stress oxydatif induit, impliquant une augmentation de l'expression du CYP1A1. L'inversion de ces effets par l'inhibition de l'AhR avec CH223191 pourrait avoir une utilité thérapeutique dans le maintien de la fonction endothéliale dans la population atteinte d'IRC. Potentiellement, les antagonistes de l'AhR peuvent être utilisés comme traitement d'appoint en plus du traitement standard chez les patients atteints d'IRC et atténuer la progression du risque de MCV dans cette population.
4. Matériels et méthodes
4.1. Réactivité vasculaire
Concernant l'effet de l'IS en l'absence et en présence de l'antagoniste de l'AhR, CH223191 a été évalué pourfonction endothéliale. En bref, des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 1 0 à 14 semaines ont été anesthésiés avec du Lethbarb (Troy Laboratories, Australie) et l'aorte thoracique descendante a été récoltée comme décrit précédemment (36). Les aortes ont été nettoyées et disséquées en quatre anneaux de 5 mm et soigneusement placées entre 2 supports horizontaux en acier inoxydable dont une extrémité est reliée à un micromètre pour ajuster la tension. Les tissus ont été immergés dans des bains de tissus oxygénés contenant du tampon Krebs-Henseleit (NaCl 119 mM, KCl 4,7 mM, MgSO4,7H2O 1,17 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 1,18 mM, D-glucose 11 mM, 0,03 mM EDTA , 2,0 mM CaCl2) [11], et attribués au hasard aux conditions suivantes : (1) Contrôle ; (2) EST (300 µM); (3) EST + CH223191 (1 µM); (4) EST + CH223191 (10 µM). Les tissus ont été stabilisés sous 2 g de tension de base et lavés 5 fois avec du tampon Krebs toutes les 5 minutes. La viabilité et les réponses contractiles ont été évaluées avec (80 mmol/L) et ont permis d'atteindre une contraction maximale avant une période de sevrage de 3 × 5 minutes avec un tampon.
Les tissus placés dans le tampon Krebs-Henseleit ont été préincubés avec le véhicule (0,1 % de DMSO pour les conditions 1 et 2) ou l'antagoniste de l'AhR CH223191 (1 ou 10 µM pour les conditions 3 et 4, respectivement) pendant 2 h, suivis de une incubation d'une heure avec IS (300 µM, conditions 2 à 4, la condition témoin a reçu 120 µL d'eau distillée). Les anneaux aortiques ont ensuite été précontraints avec de la phényléphrine (PE, 30 µM), puis, une fois la constriction maximale atteinte, la fonction vasculaire dépendante de l'endothélium a été évaluée par une courbe de relaxation dose-réponse à l'acétylcholine (ACh; 1 nM – 30 µM). Le changement de tension a été obtenu via des transducteurs isométriques (FT03C, Grass Instruments, Quincy, MA, USA), amplifié (Unicor Instruments, Box Hill, Vic, Australie) et enregistré à l'aide de matériel d'acquisition de données (PowerLab 4sp, ADInstruments, Castle Hill). , NSW, Australie) et logiciel Chart (ADInstruments v5.6). La relaxation résultante avec chaque dose d'ACh a été exprimée en pourcentage de réduction de la contraction maximale obtenue avec la phényléphrine pour chaque condition. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d'éthique animale de l'hôpital Saint-Vincent, AEC 006/17.
4.2. Études sur l'expression génique
Des anneaux aortiques thoraciques provenant d'animaux séparés ont été isolés comme décrit ci-dessus et incubés avec du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné d'antibiotiques (1 %) dans 5 % de CO2 à 37 °C. Dans les conditions 1 à 4 décrites ci-dessus, les anneaux aortiques ont été incubés avec du CH223191 pendant 2 h, suivis de l'ajout d'IS pendant 4 h. L'ARN a été extrait à l'aide de la méthode d'extraction Trizol conformément aux instructions du fabricant, suivie d'un traitement à la DNase et d'une transcription inverse. La PCR a été réalisée à l'aide d'amorces SYBR green et spécifiques à la séquence pour les rats CYP1A1, Nrf2, NQO1, GSTA1/2, TNF et VCAM-1 (voir le tableau supplémentaire S1 pour les séquences d'amorces), à l'aide d'un QuantStudio 7- Système PCR Flex en temps réel (Applied Biosystems). L'analyse du changement relatif dans l'expression de l'ARNm du CYP1A1 a été réalisée à l'aide de la méthode comparative ∆∆Ct utilisant le gène domestique 18S.
4.3. Immunohistochimie
À la fin des expériences de réactivité vasculaire, les anneaux aortiques ont été immédiatement fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit, traités dans un processeur de tissus automatique et inclus en paraffine le lendemain pour l'immunohistochimie. Des coupes de tissus LV (4 µm) de chaque expérience ont été colorées pour RECA-1 (BioRad #MCA970GA, dilution 1/200), eNOS (BD Biosciences #610296, dilution 1/200), NOX4 (Abcam #133303, 1 /150 dilution), et de la nitrotyrosine (Merck #06-284, dilution 1/100), et détectée avec du di aminobenzimide comme décrit précédemment [45]. Les lames colorées ont été numérisées numériquement à l'aide du scanner Aperio Scanscope avec le logiciel Scanscope Console (v8, Aperio Technologies, Vista, CA, USA) et quantifiées pour la coloration luminale positive en pourcentage du périmètre total de la lumière à l'aide du logiciel Imagescope (v 11.1.2.760, Aperio Technologies ).
4.4. Évaluation des espèces réactives de l'oxygène
Les espèces réactives de l'oxygène(ROS) ont été détectés dans le tissu aortique obtenu lors des études fonctionnelles. Les coupes de tissus ont été colorées au dihydroéthidium (DHE, 2 µM) pendant 30 min à 37 ◦C [46]. Un microscope confocal (Nikon A1R, Nikon Instruments Inc., Melville NY, USA) a été utilisé pour visualiser la coloration fluorescente rouge avec un spectre d'émission de 610 nm à un grossissement × 20. Le pourcentage de zone de coloration DHE a été déterminé à l'aide d'ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).
4.5. Méthodes statistiques
Les effets sur la fonction endothéliale ont été comparés par une analyse de variance (ANOVA) à mesures répétées bidirectionnelles avec la comparaison post-hoc de Tukey pour déterminer l'effet du pourcentage de relaxation pour chaque dose d'ACh. Les valeurs de relaxation maximale (Rmax) et de pEC50 pour l'ACh ont été obtenues par régression non linéaire suivie d'une ANOVA à mesures répétées unidirectionnelles avec comparaison post-hoc de Tukey. Ceci a été utilisé pour déterminer la signification statistique des valeurs de relaxation maximale (Rmax) et de pEC50 pour l'ACh. De même, l'expression des gènes et la coloration immunohistochimique et DHE ont été comparées par une ANOVA unidirectionnelle avec la comparaison post-hoc de Tukey.
Matériel supplémentaire :Les informations complémentaires suivantes peuvent être téléchargées sur : https://www.mdpi.com/article/10.3390/toxins14020100/s1, Figure S1 : Effet du CH223191 seul sur la réactivité vasculaire dans les anneaux aortiques isolés de rat ; Figure S2 : Effet de l'inhibition de l'IS et de l'AhR sur l'expression des gènes Nrf2 et antioxydants. Tableau S1 : Séquences nucléotidiques des amorces utilisées pour la quantification des gènes par PCR en temps réel.
Contributions d'auteur:Conceptualisation, ARK ; méthodologie, CN et ARK ; validation, CN, AJE et ARK ; analyse formelle, CN et ARK ; enquête, CN; ressources, ARK et DJK ; conservation des données, CN et ARK ; rédaction-préparation d'un projet original, CN ; rédaction-révision et édition, CN, AJE, DJK et ARK ; visualisation, CN et ARK ; supervision, AJE et ARK ; administration de projet, AJE et DJK ; acquisition de financement, DJK Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
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