BCAT2 façonne un microenvironnement tumoral non enflammé et induit une résistance à l'immunothérapie anti-PD-1/PD-L1 en régulant négativement les chimiokines proinflammatoires et l'immunité anticancéreuse

Pour améliorer le taux de réponse de la monothérapie au blocage des points de contrôle immunitaire (ICB), il est nécessaire de trouver une cible émergente en thérapie combinée. Grâce à l'analyse des indicateurs liés au microenvironnement tumoral (TME), il est validé que BCAT2 façonne un TME non inflammatoire dans le cancer de la vessie. Les résultats de la multiomique indiquent que BCAT2 a un effet inhibiteur sur le recrutement des lymphocytes cytotoxiques en limitant les activités des voies liées aux cytokines/chimiokines proinflammatoires et à la voie de chimiotaxie des lymphocytes T. Les tests immunologiques révèlent que la sécrétion de chimiokines liées aux lymphocytes T CD8+ conserve une forte corrélation négative avec BCAT2, générant une tendance décroissante des lymphocytes T CD8+ autour des cellules tumorales BCAT2+ de loin en près. Le co-traitement du déficit en BCAT2 et de l'anticorps anti-PD -1 a un effet synergique in vivo, impliquant le potentiel du BCAT2 en thérapie combinée. De plus, la valeur de BCAT2 pour prédire l’efficacité de l’immunothérapie est validée dans plusieurs cohortes d’immunothérapie. Ensemble, en tant que molécule clé du TME, BCAT2 est une cible émergente en combinaison avec l'ICB et un biomarqueur pour guider la thérapie de précision.

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1. Présentation

Le cancer de la vessie (BLCA) est l'une des tumeurs malignes les plus courantes du système urinaire.[1] On estime que plus de 430 000 patients sont diagnostiqués chaque année dans le monde.[2] Malgré un traitement chirurgical radical, près de la moitié des patients atteints d'un cancer de la vessie à invasion musculaire présentent des métastases.[3] Par conséquent, la thérapie systémique joue un rôle important dans le cancer de la vessie avancé. Avec le développement de l’immunothérapie, en particulier du blocage des points de contrôle immunitaire (ICB), de plus en plus de preuves indiquent que l’ICB a d’excellentes performances dans l’élimination de la charge tumorale.[4] Cependant, il existe encore un grand nombre de patients qui ne répondent pas à la monothérapie par ICB en raison d'une résistance primaire ou d'une résistance acquise.[5] Pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits, la combinaison d’autres thérapies rationnelles avec l’ICB offre un tout nouvel aperçu de la résistance à la monothérapie. Le microenvironnement tumoral (TME) est un système complexe et a un impact profond sur l'efficacité de l'immunothérapie.[6] Avec un niveau d'infiltration insuffisant de lymphocytes T cytotoxiques (CTL), le TME non enflammé a été considéré comme un facteur critique dans l'incapacité de générer une puissante réponse immunitaire antitumorale pendant l'immunothérapie.[7] Par conséquent, il est essentiel de trouver une molécule clé capable de transformer le TME non inflammatoire en TME inflammatoire et susceptible de constituer une cible thérapeutique combinée. L'aminotransférase 2 à chaîne ramifiée (BCAT2) est une enzyme essentielle dans le processus de métabolisme des acides aminés soufrés.[8] Li et coll. ont découvert que BCAT2 était essentiel au développement du cancer du pancréas en médiateur du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA).[9] Lee et coll. démontré que le déficit en BCAT2 inhibait la croissance tumorale de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) en régulant le métabolisme lipidique.[10] Bien que plusieurs recherches aient montré que BCAT2 influençait directement le processus biologique des tumeurs en régulant les voies métaboliques, son rôle dans la régulation du statut immunitaire du TME n'a jamais été exploré. Dans notre étude, grâce à une analyse complète des indicateurs liés au TME dans la cohorte Xiangya BLCA et dans plusieurs cohortes publiques BLCA, nous avons montré que BCAT2 façonnait probablement un TME immunosuppresseur dans BLCA. Pour explorer les mécanismes moléculaires, nous avons en outre effectué un séquençage d'ARN unicellulaire (siRNA seq) et un séquençage d'ARN en masse, révélant que BCAT2 joue un rôle répressif dans le recrutement de CTL dans le TME, en inhibant les activités des voies de signal associées aux cytokines/chimiokines et Voies du signal de chimiotaxie des cellules T. In vitro, des tests multi-immunologiques ont démontré que la sécrétion de chimiokines liées aux CTL présente des corrélations négatives stables avec l'expression de BCAT2. Selon l'analyse panoramique des puces à ADN tissulaires (TMA), nous avons trouvé une relation mutuellement exclusive entre les CTL et les cellules tumorales BCAT2+ dans la distribution spatiale. In vivo, un effet coopératif a été révélé dans la thérapie combinée de perte de BCAT2 et d'ICB. Plus important encore, son rôle dans la prévision de l’effet curatif de l’immunothérapie a été validé dans la cohorte d’immunothérapie Xiangya BLCA.

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2. Résultats

2.1. BCAT2 est en corrélation négative avec l'immunité anticancéreuse du TME dans BLCA

Dans la plupart des types de cancer, l'expression de BCAT2 est plus élevée dans les tissus cancéreux que dans les tissus normaux (Figure S1A, Informations complémentaires) et son modèle d'expression dans BLCA a été validé dans la cohorte Xiangya BLCA (Figure S1B, Informations complémentaires). En outre, BCAT2 est largement exprimé dans diverses lignées de cellules cancéreuses (Figure S1C, Informations complémentaires). En outre, les résultats d'une analyse pancancéreuse complète sur le système de chimiokines, les CMH, les immunostimulateurs et les TIIC ont indiqué que BCAT2 a des effets immunosuppresseurs significatifs dans quelques types de cancer, notamment le cancer de la vessie (BLCA), le cancer du sein (BRCA), les cellules papillaires rénales du rein. carcinome (KIRP), adénocarcinome pancréatique (PAAD), sarcome (SARC) et carcinome de la thyroïde (THCA) (Figure S2A, B, Informations complémentaires). De plus, des corrélations négatives entre BCAT2 et les points de contrôle immunitaires inhibiteurs courants (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 et LAG-3) ont également été trouvées (Figure S2C – F, Informations complémentaires ). Grâce à une analyse pan-cancer complète, nous avons constaté que BCAT2 avait l’effet immunosuppresseur le plus profond dans BLCA. Par conséquent, nous avons exploré plus en détail son rôle immunologique dans BLCA. Sur la base de la valeur d'expression médiane de BCAT2, nous avons divisé les individus en groupes à BCAT2 élevé et en groupe à faible BCAT2 dans la cohorte TCGA-BLCA. De toute évidence, une série de chimiokines, de récepteurs de chimiokines, de molécules liées au CMH et d'immunostimulateurs étaient sous-exprimés dans le groupe à BCAT2 élevé et surexprimés dans le groupe à faible BCAT2 (Figure 1A). Un résultat similaire a été observé dans le cycle de l’immunité contre le cancer, qui couvre plusieurs étapes essentielles dans le recrutement et l’infiltration des cellules immunitaires (Figure 1B). De plus, nous avons démontré des liens négatifs robustes entre les niveaux d'infiltration des cellules immunitaires (cellules CD8+T, CD4+cellules T, cellules nature killer (NK) et cellules dendritiques (DC)) et BCAT2 dans différents algorithmes (Figure 1C). De même, une expression plus faible des gènes effecteurs des cellules immunitaires (cellules T CD8+, cellules NK, macrophages, cellules T helper 1 (Th1) et cellules DC) ont été observées dans le groupe à BCAT2 élevé par rapport au groupe à faible BCAT2. groupe (Figure 1D). Plus important encore, lorsque BCAT2 est corrélé avec le score TIS (Figure S3, informations complémentaires) et les points de contrôle immunitaires inhibiteurs (Figure 1E), des relations négatives évidentes ont été révélées entre eux. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que BCAT2 pourrait réguler négativement la réponse immunitaire du TME et affecter profondément l’efficacité de l’immunothérapie. De plus, les résultats ci-dessus ont été bien validés dans neuf cohortes BLCA indépendantes (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 et GSE128702) (figures S4 à S12, informations complémentaires). Enfin, nous avons vérifié à nouveau l'association entre BCAT2 et TME dans la cohorte Xiangya BLCA. De manière cohérente, l'expression de BCAT2 a des relations négatives avec l'activité du cycle immunitaire du cancer, les niveaux d'infiltration des TIIC, le score TIS et les niveaux d'expression des points de contrôle immunitaires (Figure 2A – C). Collectivement, nous avons révélé qu'une expression élevée de BCAT2 forme un TME non enflammé dans BLCA et qu'une faible expression de BCAT2 forme un TME enflammé dans BLCA.

2.2. Explorer le mécanisme de BCAT2 dans la formation du TME par Bulk RNA-seq et siRNA-seq

Dans la cohorte TCGA-BLCA, les DEG entre les groupes BCAT2 élevé/faible, les groupes à score immunitaire élevé/faible et les groupes à score stromal élevé/faible ont été identifiés et se sont croisés (Figure S13A, Informations complémentaires). Il est intéressant de noter que les DEG liés au positif BCAT2 n'avaient aucune intersection avec les DEG liés au score immunitaire et stromal positif (Figure 2D). Pendant ce temps, le même phénomène s'est produit dans les EG liés au négatif parmi eux (Figure S13B, Informations complémentaires). Ces résultats indiquent que BCAT2 régule probablement négativement les voies immunitaires. Par coïncidence, les résultats des analyses GO et KEGG ont révélé que les DEG liés au BCAT2- étaient enrichis de manière plus significative dans les voies de migration des leucocytes, d'activation des lymphocytes T et d'interaction cytokine-–récepteur de cytokine (Figure 2E, F). Par conséquent, nous avons supposé que BCAT2 façonne un TME non enflammé dans BLCA en inhibant les activités des voies liées aux cytokines/chimiokines. Cependant, la caractéristique du séquençage massif de NA détermine sa limitation, dont le niveau d’expression du gène est calculé par la valeur moyenne de toutes les cellules du tissu. Pour surmonter cette limitation, le siRNA a été réalisé sur trois échantillons BLCA. Plus de 19 000 cellules ont été analysées et classées en six catégories : cellule épithéliale, cellule fibroblastique, cellule T/NK, cellule endothéliale, cellule B et cellule myéloïde (Figure 3A), se référant à des biomarqueurs reconnus (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 et VWF).[11] Étonnamment, BCAT2 était principalement exprimé dans les cellules épithéliales (EPCAM+), plutôt que dans les cellules endothéliales et les cellules immunitaires. Sur la base de l'accumulation de CNV, les cellules épithéliales EPCAM + ont été considérées comme des cellules urothéliales malignes. Pour valider le modèle d'expression de BCAT2, deux cohortes externes de siARN ont été incluses dans l'étude. Dans la cohorte d'ARNc GSE135337, plus de 36 000 cellules ont été traitées et divisées en cinq groupes. Le sous-type cellulaire principalement exprimé de BCAT2 était toujours une cellule urothéliale de la vessie maligne (Figure 3B). Un modèle d'expression similaire est réapparu dans la cohorte siRNA GSE145137 (Figure 3C). Par conséquent, le modèle d’expression majoritaire sur les cellules malignes laisse entendre que BCAT2 agit comme un élément immunorégulateur du TME, principalement au moyen de caractéristiques variables des cellules cancéreuses. Sur la base du niveau d'expression de BCAT2, les cellules urothéliales malignes ont été divisées en un groupe à BCAT2 élevé et un groupe à faible BCAT2. L'analyse GSEA des termes GO dans les cohortes d'ARNsi GSE135337 et GSE145137 a révélé qu'un ensemble de voies liées aux cytokines/chimiokines étaient significativement régulées négativement dans le groupe à taux élevé de BCAT2, notamment la production de chimiokines, la sécrétion de chimiokines, la régulation de la voie de signalisation médiée par les chimiokines, la réponse à la chimiokine, liaison aux récepteurs de chimiokines, activité des cytokines, liaison aux cytokines et liaison aux récepteurs de cytokines (Figure 3D – G ; Figure S14B, informations complémentaires). Pendant ce temps, la chimiotaxie leucocytaire, la chimiotaxie lymphocytaire, la chimiotaxie des lymphocytes T et leurs voies de régulation présentaient des corrélations significativement négatives avec BCAT2 (Figure 3E – I ; Figure S14A, Informations complémentaires). L'analyse GSEA des termes KEGG a indiqué que les voies d'interaction cytokine-récepteur de cytokine ainsi que le traitement et la présentation de l'antigène étaient évidemment régulés négativement dans le groupe à taux élevé de BCAT2 (Figure 3F). Ensemble, une expression élevée de BCAT2 réprime les activités des cytokines pro-inflammatoires et des voies liées aux chimiokines, conduisant à une diminution du niveau d'infiltration des TIIC, ce qui façonne finalement un TME non enflammé.

Figure 1. BCAT2 est en corrélation négative avec l'immunité anticancéreuse dans le TME du BLCA. A) Modèle d'expression des chimiokines, des récepteurs de chimiokines, des molécules du CMH et des immunostimulateurs dans les groupes BCAT2 élevés et faibles. B) Activité du cycle d’immunité contre le cancer dans les groupes BCAT2 élevés et faibles. Sept couleurs représentent sept étapes du cycle. *p < 0.05 ; **p < 0.01 ; ***p < 0,001. C) Corrélations entre BCAT2 et plusieurs types de cellules immunitaires (cellules CD8+T, CD4+cellules T, cellules DC et cellules NK) dans six algorithmes indépendants. D) Modèles d'expression de plusieurs sous-types de gènes effecteurs liés aux cellules immunitaires (cellules CD8+T, cellules NK, macrophages, cellules Th1 et cellules DC) dans les groupes BCAT2 élevés et faibles. E) Corrélations entre les gènes effecteurs liés à BCAT2 et à l'ICB. Le chiffre dans le cercle signifie le coefficient de corrélation.

Figure 2. Validation de la fonction de BCAT2 par la cohorte Xiangya BLCA. A) Corrélations entre le cycle d’immunité BCAT2/cancer (à gauche) et BCAT2/TIIC (à droite). Les lignes pleines et pointillées signifient les relations positives et négatives, l'épaisseur des lignes signifie le coefficient de corrélation, les lignes de différentes couleurs représentent la valeur p des corrélations. B) Corrélations entre les gènes effecteurs liés à BCAT2 et à l'ICB. C) Corrélations entre les gènes effecteurs liés au score BCAT2 et TIS. Le chiffre dans le cercle représente le coefficient de corrélation. D) Intersection de gènes liés au BCAT2, au score immunitaire et au score stromal positif. E, F) Les 20 principales voies de signalisation d'enrichissement des analyses GO et KEGG dans les gènes liés au BCAT2-.

Figure 3. Exploration du mécanisme de BCAT2 dans la mise en forme du TME par séquençage d'ARN en masse et séq d'ARNc. A, B) tracés tSNE du modèle d’expression unicellulaire de BCAT2 dans la cohorte Xiangya siRNA et la cohorte GSE135337. C) Tracé en violon du modèle d’expression unicellulaire de BCAT2 dans la cohorte GSE145137. D, E) L'analyse GSEA du terme GO indique les activités des voies liées aux cytokines/chimiokines et aux voies liées à la chimiotaxie des cellules immunitaires entre différents groupes BCAT2 de la cohorte GSE135337. F) L'analyse GSEA du terme KEGG indique les activités de présentation de l'antigène et l'interaction de la voie des cytokines et des récepteurs de cytokines entre différents groupes BCAT2 de la cohorte GSE145137. G – I) L'analyse GSEA du terme GO indique les activités des voies liées aux cytokines/chimiokines, aux voies liées à la chimiotaxie des cellules immunitaires et aux voies liées à la migration des cellules immunitaires entre différents groupes BCAT2 de la cohorte GSE145137. J, K) Analyse GO et KEGG des DEG entre les lignées cellulaires BCAT2 OE et BCAT2 KD.

2.3. BCAT2 varie les modèles d'expression des chimiokines liées aux cellules CD8+T et inhibe la capacité cytotoxique des CTL

Pour valider les voies d'enrichissement mentionnées ci-dessus, des lignées cellulaires de cancer de la vessie humaine (T24)/murine (MB49) de surexpression de BCAT2 (BCAT2 OE) et d'inactivation de BCAT2 (BCAT2 KD) ont été construites avec succès (Figure S15A – D, informations complémentaires) et ont été testées avec séquençage d’ARN à haut débit. L'analyse attendue et GO des lignées cellulaires T24 a révélé que les DEG étaient significativement enrichis dans les voies de signalisation médiée par les chimiokines, la réponse à la chimiokine, la migration des leucocytes et la migration des leucocytes (Figure 3J). L'analyse de la voie KEGG des lignées cellulaires T24 a montré que la voie de signalisation des chimiokines, la voie d'interaction cytokine-récepteur de cytokine et la voie du cancer de la vessie étaient significativement enrichies (Figure 3K). De même, plusieurs voies critiques liées aux cytokines/chimiokines ont été découvertes dans les analyses GO et KEGG de lignées cellulaires MB49 (Figure S16A, B, Informations complémentaires). De toute évidence, diverses cytokines et chimiokines jouent un rôle essentiel dans la régulation du TME. Par conséquent, il est nécessaire de cribler les cytokines/chimiokines spécifiquement régulées par BCAT2. Par conséquent, de multiples tests immunologiques ProcartaPlex ont été appliqués pour identifier la variation de sécrétion de cytokines/chimiokines dans les lignées cellulaires du cancer de la vessie humaine et murine. Étonnamment, les niveaux de sécrétion de CCL3, CCL4, CCL5 et CXCL10 sont régulés positivement dans les lignées cellulaires BCAT 2-KD humaines et murines et régulés négativement dans les lignées cellulaires BCAT 2-OE humaines et murines (Figure 4A, B ; Figure S16C). , D, informations complémentaires). Dans des études précédentes, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 et CXCL10 étaient considérées comme des chimiokines cruciales pour le recrutement de lymphocytes T CD8+ dans le TME.[12] Par conséquent, pour une analyse plus complète des chimiokines liées aux lymphocytes T CD8+, toutes ont été incluses pour une validation plus approfondie. De manière frappante, les niveaux d'expression d'ARN de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 et CXCL10 étaient significativement régulés négativement dans les cellules BCAT2 OE et significativement régulés positivement dans les cellules BCAT2 KD (Figure 4C). De même, les résultats de l'ELISA ont montré que les niveaux de protéines sécrétées présentaient également des corrélations négatives avec une expression de BCAT2 (Figure 4D). Ces résultats ont indiqué que la surexpression de BCAT2 inhibe les niveaux de transcriptome et de protéines des chimiokines liées aux lymphocytes T CD8+, notamment CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 et CXCL10. Plus important encore, le test de chimiotaxie a révélé que la lignée cellulaire BCAT2 OE inhibait de manière significative la capacité de chimiotaxie des cellules T CD8+ (Figure 4E, à gauche). À l'inverse, les surnageants cellulaires de la lignée cellulaire BCAT2 KD étaient capables d'attirer plus de lymphocytes T CD8+ que son contrôle négatif (Figure 4E, à droite). Ces résultats ont indiqué que BCAT2 peut affecter la capacité de chimiotaxie des lymphocytes T CD8+ en régulant les niveaux d'ARNm et de protéines des chimiokines associées. En outre, un test de destruction des cellules cancéreuses médié par les lymphocytes T a été utilisé pour explorer la variation de cytotoxicité des lymphocytes T après un contact direct avec des cellules tumorales exprimant un niveau différent de BCAT2. Comme le montrent les figures 4F et S17A, B (informations à l'appui), la surexpression de BCAT2 sur les cellules tumorales a directement supprimé la fonction cytotoxique des cellules T et l'inactivation de BCAT2 sur les cellules tumorales a inversé de manière significative la tendance. L'analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T collectés a révélé que les proportions de lymphocytes T CD8+TNF-𝛼+ et de lymphocytes T CD8+IFN-𝛾+ présentaient des différences significatives dans les différents systèmes de coculture, ce qui signifiait un changement massif dans l'activité des lymphocytes T CD8+ (Figure 4G ; Figure S17C, D, Informations complémentaires). Collectivement, BCAT2 est capable d'inhiber la capacité de recrutement des lymphocytes T CD8+ en régulant les niveaux de chimiokines associés ainsi qu'en supprimant les activités des CTL par contact direct. De plus, les résultats du test de destruction des cellules cancéreuses médiées par les lymphocytes T (sans groupe de lymphocytes T) peuvent déduire que BCAT2 joue un rôle oncogène dans le cancer de la vessie. Par conséquent, un test de colonies sur plaques et un test de migration/invasion transwell ont été utilisés pour valider cette hypothèse. Comme prévu, la surexpression de BCAT2 a considérablement amélioré la capacité de prolifération, de migration et d'invasion des cellules tumorales, et l'inactivation de BCAT2 a nettement supprimé ces comportements (Figure S18A – F, Informations complémentaires).

2.4. Validation de la relation spatiale exclusive entre la cellule tumorale BCAT2+ et la cellule CD8+T par TMA de la cohorte Xiangya BLCA

Selon les résultats d'expériences de séquençage d'ARN, de scARN et in vitro, nous avons démontré que BCAT2 joue un rôle immunosuppresseur dans BLCA en supprimant le recrutement et la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+. Cependant, l'interaction des cellules tumorales BCAT2+ et des cellules CD8+T est encore inconnue au niveau des tissus humains. Dans la cohorte Xiangya BLCA, des images représentatives et un score global d'IHC ont révélé une corrélation négative entre BCAT2 et CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (figures 5A, B). La coloration multicolore IF des cellules tumorales BCAT2+ (BCAT2+CK19+) et des cellules BCAT2+CD8+T a été réalisée en TMA et analysée de manière semi-automatique à l'aide du Plateforme de quantification panoramique TissueFAXS. Comme le montre la figure 5C, la portée d'expression de BCAT2 et de CK19 se chevauchait largement. À l’inverse, la portée d’expression de BCAT2 et CD8 était distincte et séparée. Les proportions détaillées de coexpression des cellules BCAT2+CK19+ et des cellules BCAT2+CD8+T étaient de 87,29 % et 5,09 % (Figure 5D, E), ce qui était cohérent avec le modèle d'expression de BCAT2 dans scRNA-seq. Dans l'ensemble de la TMA, il existait toujours une différence significative dans la proportion de coexpression entre eux (Figure S19A, Informations complémentaires). Plus important encore, dans l'analyse multidimensionnelle du gradient de distance (0-25, 25-50, 50-100 et 100-150 μm) autour des cellules tumorales BCAT2+, le nombre de lymphocytes T CD8+ a été progressivement augmenté. de près à loin (Figure 5F ; Figure S19B, Informations complémentaires). Ensemble, nous avons démontré qu'au niveau des tissus humains, BCAT2 est également principalement exprimé dans les cellules tumorales et que la cellule tumorale BCAT2+ a une relation spatiale exclusive avec les cellules T CD8+.

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2.5. La perte de BCAT2 améliore l'efficacité du traitement anti-PD-1

Avec un impact négatif important sur le TME et une corrélation négative étroite avec le blocage des points de contrôle inhibiteurs, il suscite un grand intérêt pour explorer l'effet synergique de la perte de BCAT2 et du traitement anti-PD- 1. Avant l’immunothérapie, un modèle de cancer sous-cutané de la vessie a été construit par BCAT2 KD et des lignées cellulaires murines témoins. Ensuite, une thérapie anti-PD-1 et une thérapie de contrôle ont été appliquées à des souris porteuses de tumeurs (Figure 6A). Conformément à son rôle oncogène et à son mécanisme de régulation des chimiokines in vitro, le déficit en BCAT2 a inhibé la croissance tumorale et prolongé la durée de survie in vivo, en régulant positivement les chimiokines liées au CD8+T (Figure 6B – E ; Figure S20A, Informations complémentaires). En ce qui concerne l'efficacité de l'immunothérapie, bien que la monothérapie anti-PD-1 puisse réduire en partie la charge tumorale, le co-traitement de BCAT2 KD et d'anticorps monoclonaux anti-PD-1 (MAB) a indiqué un meilleur effet de suppression tumorale et a gagné plus bénéfice de survie. Le jour prévu, les tumeurs ont été récoltées et préparées pour une analyse plus approfondie. Une partie d’entre eux a été digérée en suspension unicellulaire et réalisée par cytométrie en flux. Avec une population similaire de leucocytes et de lymphocytes T (Figure S20B – E, informations complémentaires) dans la tumeur, une proportion plus élevée de lymphocytes T CD8+ a été observée dans le groupe présentant un déficit en BCAT2 que dans le groupe témoin négatif. De même, le groupe de thérapie combinée présentait une infiltration plus massive de CTL que le groupe de monothérapie (Figure 6F – H). Plus important encore, les indicateurs de cytotoxicité (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 et Perforine) des CTL ont également été renforcés dans les tumeurs murines avec perte de BCAT2 et traitement combiné par rapport au contrôle correspondant (Figure 6G, I – L). Les autres parties des tumeurs ont été transformées en coupes congelées et mises en œuvre par coloration IF. Comme prévu, la densité des lymphocytes T CD8+ dans la région d'intérêt (ROI) a montré la même tendance avec l'analyse par cytométrie en flux (Figure 6M, N). Ces résultats ont indiqué que le déficit en BCAT2 sur les cellules tumorales peut façonner un TME enflammé et être très efficace avec le traitement par immunothérapie. Pour comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ dans l'effet synergique du co-traitement, le mab CD8𝛼 a été appliqué pour les contrarier chez des souris immunocompétentes (Figure S21A, Informations complémentaires) et a validé son effet de déplétion par cytométrie en flux et IF. (Figure S21B, C, Informations complémentaires). De toute évidence, après l'épuisement, la charge tumorale et la durée de survie ont été significativement inversées (Figure S21D – G, Informations complémentaires). Ces résultats ont indiqué que les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle indispensable dans l'effet synergique de la thérapie combinée.

Figure 4. BCAT2 fait varier les modèles d'expression des chimiokines liées aux lymphocytes T CD8+ et inhibe la capacité cytotoxique des CTL. A, B) Les cartes thermiques des tests immunologiques multiples ProcartaPlex affichent la variation de sécrétion des cytokines et des chimiokines courantes dans les groupes BCAT2 OE, BCAT2 KD et témoins négatifs (n=3 par groupe). C, D) Les histogrammes montrent les niveaux d'expression d'ARNm normalisés et les concentrations de sécrétion de protéines de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 et CXCL10 dans BCAT2 OE (à gauche), BCAT2 KD (à droite) et les groupes témoins négatifs (n {{ 15}} par groupe). *p < 0.{{20}}5 ; **p < 0.01 ; ***p < 0,001. E) Le test de chimiotaxie indique une capacité de chimiotaxie différente des CTL dans les groupes BCAT2 OE, BCAT2 KD et témoins négatifs (n=3 par groupe). *p < 0,05 ; **p < 0,01. F) Le test de destruction des cellules cancéreuses médiée par les lymphocytes T indique différentes capacités de destruction des cellules T co-cultivées avec BCAT2 OE, BCAT2 KD et des lignées cellulaires de contrôle négatif (n=3 par groupe). G) L'analyse par cytométrie en flux indique différentes activités des lymphocytes T CD8+ dans différents groupes de coculture (n=3 par groupe).

Figure 5. Validation des relations spatiales exclusives des cellules tumorales BCAT2+ et des cellules CD8+T par TMA de la cohorte Xiangya BLCA. A) Image IHC de BCAT2 et CD8 dans les types de TME inflammatoires et non inflammatoires. Barre d'échelle : 50 μm. B) Corrélation entre BCAT2 et CD8 sur la base de leurs scores IHC dans la TMA globale. C) Image IF multicolore de BCAT2, CK19, CD8 et indice de combinaison dans les types de TME enflammés et non inflammatoires. Cellule BCAT2+ (rose), cellule CK19+ (cyan), cellule CD8+T (orange) et noyau cellulaire (bleu). Barre d'échelle : 50 μm. D, E) Taux de coexpression détaillés des cellules BCAT2+CK19+ et BCAT2+CD8+ dans l'échantillon typique. F) Analyse du gradient de distance (0-25, 25-50, 50-100 et 100-150 μm) des cellules CD8+T autour des cellules BCAT2+CK19+ dans le type typique échantillon.

Figure 6. La perte de BCAT2 améliore l'efficacité du traitement anti-PD-1. A) Organigramme du plan de traitement. B) Tumeurs récoltées de différents schémas thérapeutiques (n=5 par groupe). C – E) Quantification du volume de la tumeur, du poids corporel et de la durée de survie dans différents schémas thérapeutiques (n=5 par groupe). ns : aucune signification ; *p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

De plus, parallèlement aux cellules tumorales, une petite proportion de BCAT2 est également exprimée dans les cellules CD8+T. Par conséquent, nous avons étudié plus en détail si les différents niveaux d'expression de BCAT2 sur les cellules T CD8+ pouvaient affecter leurs activités. Après avoir coloré la suspension unicellulaire de la rate murine avec des anticorps fluorescents liés au BCAT2 et aux lymphocytes T, nous avons comparé les proportions de lymphocytes CD8+ TNF-𝛼+T et CD8+ IFN-𝛾+T entre BCAT. Groupes 2+CD8+ et BCAT2−CD8+. Fait intéressant, nous avons constaté que les proportions étaient similaires entre les deux groupes, révélant que l'activité des lymphocytes T CD8+ est indépendante de son niveau d'expression de BCAT2 (Figure S22A – C, Informations complémentaires).

2.6. BCAT2 prédit la réponse à l'immunothérapie dans plusieurs cohortes d'immunothérapie réelles

Les résultats ci-dessus ont démontré le rôle immunosuppresseur de BCAT2 dans le TME et l'effet synergique de la combinaison de la perte de BCAT2 avec un traitement anti-PD-1. Cependant, son potentiel prédictif sur l’efficacité de l’immunothérapie n’est pas clair. Par conséquent, dans la cohorte TCGA-BLCA, les scores d’enrichissement des voies liées à l’immunothérapie ont été comparés entre les groupes BCAT2 élevés et faibles. Comme le montre la figure S23A (informations complémentaires), le groupe à faible teneur en BCAT2 présentait des gènes plus actifs dans les voies liées à l'immunothérapie, ce qui peut en déduire qu'une faible expression de BCAT2 représente un état plus sensible à l'immunothérapie. Pour une validation plus approfondie, 58 patients atteints d'un cancer de la vessie invasif musculaire (MIBC) ayant accepté un traitement anti-PD néoadjuvant -1 dans notre hôpital ont été inclus dans la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA. Les images représentatives IHC, IF et CT du répondeur et du non-répondeur impliquent que le niveau d'expression de BCAT2 est étroitement lié à l'efficacité de l'immunothérapie : un individu avec un faible niveau d'expression de BCAT2 est plus susceptible de répondre à l'immunothérapie qu'un individu avec un faible niveau d'expression de BCAT2. niveau d'expression élevé de BCAT2 (Figure 7A – C). De plus, le score IHC de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA et la matrice d'expression d'ARNm de la cohorte IMvigor210 ont indiqué une forte corrélation négative entre BCAT2 et PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002 ; R=−0,41, p < 0,001) (Figure S23B, C, informations complémentaires). Par conséquent, nous avons directement comparé l'efficacité de l'immunothérapie entre les groupes à BCAT2 élevé et faible dans la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA et avons constaté que le groupe à faible BCAT2 présentait une proportion significativement plus élevée de répondeurs que le groupe à BCAT2 élevé (p=0,001). (Figure 7D). De plus, nous avons évalué les valeurs de prédiction de BCAT2, PD-L1 et l'indice de combinaison (BCAT2+PD-L1) sur la réponse pathologique à l'immunothérapie et avons constaté les excellentes performances de l'indice de combinaison (BCAT2+PD- L1) sur la précision des prédictions (figure 7E). De manière inspirante, en ce qui concerne les résultats de survie, le groupe à faible BCAT2 avait une survie sans maladie (DFS) plus longue que le groupe à BCAT2 élevé (p=0,032) (Figure 7F), démontrant la valeur pronostique de BCAT2 dans Immunothérapie BLCA. En clinique, les individus atteints de TME du désert sont plus susceptibles d'avoir une efficacité d'immunothérapie limitée que les individus atteints de TME enflammé, ce qui souligne encore l'importance des indicateurs de prévision. Par conséquent, nous avons sélectionné tous les individus atteints de TME du désert dans la cohorte IMvigor210 et mené une évaluation complète. Dans une comparaison directe du niveau d'expression de BCAT2 parmi différents groupes de réponse, le groupe CR (répondeur) avait un niveau d'expression de BCAT2 significativement inférieur à celui des groupes SD et PD (non-répondants) (Figure 7G). Plus important encore, l'indice combiné (BCAT2+PD-L1) présentait également d'excellentes performances en termes de précision de prédiction (Figure 7H). Bien qu'il n'y ait pas de différence significative en termes de survie globale (SG) entre les groupes BCAT2 élevés et faibles dans la cohorte IMvigor210 de type désert, la tendance du pronostic était toujours similaire à celle de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA (Figure 7I). Outre PD-L1, l’instabilité des microsatellites (MSI) est l’autre prédicteur essentiel de l’efficacité de l’immunothérapie. Le statut de réparation des mésappariements (MMR) : le MMR compétent (pMMR) et le MMR déficient (dMMR) maintiennent une conformité élevée avec le MSI basse fréquence (MSI-L) et le MSI haute fréquence (MSI-H).[13] Par conséquent, nous avons mené une évaluation complète de tous les individus de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA sur la base des résultats de coloration de quatre gènes marqueurs MMR (MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2). Le résultat a révélé une proportion significativement plus élevée de dMMR (MSI-H) dans le groupe à faible BCAT2 par rapport au groupe à BCAT2 élevé (p=0,02) (Figure S23D, E, Informations complémentaires). En outre, nous avons évalué les valeurs prédictives du MMR, du BCAT2 et de l'indice combiné (MMR+BCAT2) sur l'efficacité de l'immunothérapie et avons constaté que l'indice combiné (MMR+BCAT2) avait une performance éligible en termes de précision de prédiction (Figure S23F, Informations complémentaires). Ensemble, ces résultats ont démontré que BCAT2 est qualifié pour agir comme un prédicteur complémentaire de l’efficacité de l’immunothérapie BLCA. Enfin, la valeur prédictive de BCAT2 en réponse à l’immunothérapie a été explorée dans différents types de cancer. Nous avons constaté que les individus présentant une expression élevée de BCAT2 présentaient un taux de réponse significativement plus faible (p=0,04) dans la cohorte GSE35640 (mélanome) (Figure 7J). Bien qu'il n'y ait pas eu de différences significatives dans le taux de réponse entre les groupes BCAT2 élevés et faibles dans la cohorte GSE173839 (cancer du sein), GSE135222 (NSCLC) et Gide 2019 (mélanome), les patientes présentant une faible expression de BCAT2 étaient toujours plus susceptibles d'avoir une réponse positive. à l’immunothérapie (Figure 7K – M).

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2.7. La valeur de BCAT2 dans la prévision du sous-type moléculaire et l’orientation de la thérapie de précision

Avec une grande hétérogénéité existant dans la classification histologique traditionnelle, de plus en plus de preuves ont montré que le sous-type moléculaire est capable de fournir une classification plus précise sur la base du profil du transcriptome dans BLCA.[14] De plus, avec des caractéristiques immunologiques similaires dans le même sous-type, la classification moléculaire a un grand potentiel pour prédire le TME et guider un traitement de précision en clinique.[15] Grâce à une analyse complète des différents systèmes de sous-types moléculaires de la cohorte TCGA-BLCA, nous avons constaté que les individus présentant une faible expression de BCAT2 sont plus susceptibles d'être classés dans un sous-type basal, accompagné de voies activées de différenciation basale, de différenciation EMT, de différenciation immunitaire, de réponse à l'interféron, et ainsi de suite. Les individus présentant une expression élevée de BCAT2 sont principalement classés en sous-types luminaux, accompagnés de voies actives de différenciation luminale, de différenciation urothéliale et de Ta (Figure S24A, Informations complémentaires). Selon le consensus du sous-type moléculaire, le sous-type basal a un niveau d'infiltration plus élevé de lymphocytes effecteurs et une voie de signalisation IFN-𝛾 plus active que le sous-type luminal,[16] ce qui implique une meilleure efficacité de l'immunothérapie. Ensuite, l’AUC a été utilisée pour évaluer l’exactitude de la prédiction. Étonnamment, à l'exception du système de sous-type Baylor (AUC=0,76), la majeure partie de l'AUC était supérieure à 0,90 dans d'autres systèmes (Figure S24B, Informations complémentaires), ce qui signifie une précision de prédiction robuste de BCAT2 dans le sous-type moléculaire. Pour explorer plus en détail son rôle dans la prédiction de l'efficacité d'autres thérapies, nous avons comparé l'activité de la thérapie cible du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et les voies liées à la radiothérapie entre les groupes BCAT2 élevés et faibles. Avec des activités manifestement régulées positivement, les patients du groupe à faible BCAT2 sont plus susceptibles d'avoir une réponse positive au traitement ciblé par l'EGFR et à la radiothérapie (Figure S24C, Informations complémentaires). Pour améliorer la fiabilité des prédictions sur le sous-type moléculaire et la sensibilité au traitement, huit cohortes BLCA (cohorte Xiangya BLCA, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 et E-MTAB-1803) et une cohorte d'immunothérapie BLCA (IMvigor210) ont été demandé une validation externe. Outre une excellente précision de prédiction, des résultats similaires ont été trouvés dans ces cohortes (figures S25 à S27, informations complémentaires). La maladie hyperprogressive (HPD) est un état extrêmement insensible à l’immunothérapie. Pour explorer l'influence de BCAT2 sur HPD, des biomarqueurs associés à HPD ont été collectés à partir d'études précédentes [17] et la CNV des biomarqueurs a été comparée entre les groupes BCAT2 faibles et élevés. À l'exception de l'EGFR, les taux d'amplification CNV d'autres biomarqueurs associés HPD-positifs (symbole rouge) étaient plus élevés dans le groupe à taux élevé de BCAT2, en particulier MDM2 (p=0,0116). Les taux de suppression CNV des biomarqueurs associés HPD-négatifs (symbole vert) étaient plus faibles dans le groupe à BCAT2 élevé (Figure S24D, Informations complémentaires). Les résultats ont indiqué que les patients présentant une expression élevée de BCAT2 présentent un risque potentiel d'HPD pendant l'immunothérapie. La chimiothérapie néoadjuvante (NAC) est une thérapie cruciale dans le BLCA. Les marqueurs prévoyant la réponse à la NAC dans le BLCA ont été collectés à partir d'une revue de Buttigliero et al. et leurs taux de mutation ont été comparés entre les deux groupes. Sur la base de taux de mutation globaux plus élevés des biomarqueurs et d'une mutation plus fréquente de RB1 dans le groupe à faible BCAT2, nous avons supposé que l'individu ayant une faible expression de BCAT2 avait une meilleure efficacité de la NAC en clinique (Figure S24E, Informations complémentaires). Par conséquent, la base de données Drugbank a été utilisée pour comparer l’efficacité de plusieurs schémas de chimiothérapie courants entre deux groupes et a révélé que les individus ayant une faible expression de BCAT2 sont plus susceptibles de répondre à la chimiothérapie. De plus, le groupe à faible BCAT2 a également montré une meilleure efficacité dans les schémas thérapeutiques courants d’immunothérapie et de thérapie ERBB. De manière inattendue, les patients présentant une expression élevée de BCAT2 obtiennent probablement de meilleurs effets curatifs avec le traitement antiangiogénique (Figure S24F, Informations complémentaires). Collectivement, les individus ayant une faible expression de BCAT2 appartiennent à un sous-type moléculaire enflammé, le sous-type basal, ce qui signifie une réponse plus positive à l'immunothérapie, à la chimiothérapie, à la radiothérapie, à la thérapie ciblée par EGFR et à la thérapie ERBB. Malheureusement, les patients présentant une expression élevée de BCAT2 répondent mal à ces traitements. Cependant, le traitement antiangiogénique peut être une lueur d’espoir pour eux.

Figure 7. BCAT2 prédit la réponse à l'immunothérapie dans plusieurs cohortes d'immunothérapie réelles. A) Image IHC de BCAT2 et PD-L1 entre répondeur et non-répondeur dans la cohorte d’immunothérapie Xiangya BLCA. Barre d'échelle : 50 μm. B) Image IF multicolore de BCAT2 et PD-L1 entre répondeur et non-répondeur dans la cohorte d’immunothérapie Xiangya BLCA. Barre d'échelle : 50 μm. Cellule BCAT2+ (verte), cellule PD-L1+ (jaune) et noyau cellulaire (bleu). C) Image CT de la différence d’efficacité de l’immunothérapie entre les individus présentant des niveaux d’expression élevés et faibles de BCAT2. La flèche rouge pointe vers la zone tumorale. D) Différence globale du taux de réponse entre les groupes BCAT2 élevés et faibles dans la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA. E) Précision de la prédiction de BCAT2, PD-L1 et indice de combinaison (BCAT2+PD-L1) sur la réponse à l'immunothérapie dans la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA. F) Différence de survie sans maladie (DFS) entre les groupes BCAT2 élevés et faibles dans la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA. G) Différences dans le niveau d'expression de BCAT2 parmi les groupes CR, PR, SD et PD dans le type désertique de la cohorte IMvigor210. *p < 0,05 ; ns : aucune signification. H) Précision de la prédiction de BCAT2, PD-L1 et indice de combinaison (BCAT2+PD-L1) sur la réponse à l'immunothérapie dans un type désertique de cohorte IMvigor210. I) Différence de survie globale (SG) entre les groupes BCAT2 élevés et faibles dans un type désertique de la cohorte IMvigor210. J–M) Différences de réponse à l'immunothérapie entre les groupes BCAT2 élevés et faibles dans les cohortes GSE35640, GSE173839, GSE135222 et Gide2019.

3. Discussion

En tant qu'enzyme clé dans le processus de catabolisme des BCAA, des recherches antérieures se sont principalement concentrées sur le rôle métabolique du BCAT2 dans des maladies telles que l'obésité, le diabète et l'arythmie. Ma et coll. démontré que l'élimination de BCAT2 dans le tissu adipeux peut accélérer le brunissement adipeux et la thermogenèse, ce qui conduit à une réduction du taux d'obésité chez la souris.[19] En détectant des échantillons de sang de plus de 2 000 individus, Gerszten et al. ont décrit un profil de métabolites liés au diabète et ont découvert que les BCAA transformés par BCAT2- jouent un rôle crucial dans le développement de la maladie.[20] Portero et coll. a révélé que des mutations non-sens de BCAT2p.Q300*/p.Q300* entraînent des niveaux élevés de BCAA et induisent des arythmies chez la souris.[21] Récemment, quelques études ont révélé que BCAT2 entretenait une relation étroite avec le cancer. Lei et coll. a révélé que la dégradation de BCAT2 médiée par l'acétylation peut retarder le développement de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) en régulant à la baisse le niveau de métabolisme des BCAA.[22] Wang et coll. considéré que le niveau de transcription restreint de BCAT2 entraîne une diminution du niveau de glutamate intracellulaire, ce qui stimule la ferroptose des cellules d'hépatome. Cependant, toutes les recherches existantes ont mis l'accent sur l'influence du catabolisme des BCAA médié par les BCAT2- sur le processus biologique du cancer plutôt que d'explorer un tout nouveau mécanisme. Dans cette étude, nous avons révélé pour la première fois le rôle immunosuppresseur de BCAT2 dans le TME. L’application de l’immunothérapie redéfinit le traitement du cancer, avec une qualité de vie exceptionnelle et une durée de survie prolongée. Néanmoins, en raison de l’hétérogénéité du système écologique immunitaire tumoral, seule une partie des individus obtient une efficacité satisfaisante. Le TME est un système complexe, composé de cellules tumorales, de cellules immunitaires, de cellules stromales et de capillaires.[24] Selon le niveau d'infiltration des CTL, les TME peuvent être classés en types inflammatoires et non inflammatoires en général.[25] De plus en plus de preuves indiquent que le TME enflammé joue un rôle positif dans le déclenchement de réponses immunitaires antitumorales efficaces pendant le traitement.[26] Par conséquent, nous avons analysé de manière approfondie plusieurs indicateurs liés au TME et avons constaté qu'une expression élevée de BCAT2 façonne un TME non enflammé, avec un cycle d'immunité contre le cancer entravé, un modèle d'expression répressive du profil de chimiokine, des molécules du CMH et un niveau d'infiltration insuffisant de TIIC. De plus, BCAT2 est négativement lié aux gènes TIS et effecteurs de l’ICB, ce qui implique que les individus présentant une expression élevée de BCAT2 sont plus susceptibles de ne pas répondre à l’immunothérapie. Pour valider notre hypothèse, nous avons comparé le taux de réponse entre les groupes BCAT2 élevés et faibles de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA et d'autres cohortes d'immunothérapie. Étonnamment, il y avait des différences significatives dans plusieurs cohortes, ce qui indique que BCAT2 est également capable de jouer un rôle prédictif de l'efficacité de l'immunothérapie, en particulier dans le BLCA. En outre, scRNA-seq a été utilisé pour explorer le mécanisme de régulation de BCAT2 dans le TME et a indiqué que l'activité des voies de signalisation liées aux cytokines/chimiokines, la voie de signalisation de la chimiotaxie des lymphocytes T et la voie de signalisation de la migration des lymphocytes T ont des corrélations négatives significatives avec BCAT2. En tant que réseau de régulation essentiel, les cytokines et les chimiokines sont indispensables au transport de diverses cellules immunitaires vers le TME. Le système des chimiokines comprend quatre superfamilles : C, CC, CXC et CX3C, avec une redondance considérable dans l'appariement des ligands et des récepteurs.[27] Les cytokines peuvent être divisées en sous-familles Th1, Th2 et Th17 en fonction de leur fonction biologique.[28] Grâce à la sécrétion de différents niveaux de celles-ci, la lutte entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires suffit à reprogrammer les caractéristiques du TME.[29] Néanmoins, parmi une grande quantité de cytokines et de chimiokines, il est nécessaire d’éliminer le groupe le plus précieux. À l'aide d'un panel de tests immunologiques de cytokines et de chimiokines, nous avons révélé que les chimiokines, notamment CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 et CXCL10, sont fortement corrélées négativement à l'expression de BCAT2 dans les cellules cancéreuses de la vessie humaine et murine. Il est bien connu que CXCL9 et CXCL10 sont responsables du recrutement des cellules CD8+T dans le TME.[30] Pour vérifier la fonction de CCL3, CCL4 et CCL5, nous avons consulté des recherches antérieures. Harlin et coll. a utilisé des matrices de protéines et la qPCR pour révéler que la régulation positive de CCL3, CCL4 et CCL5 est capable de favoriser la migration des cellules CD8+T dans le mélanome.[31] Noman et coll. ont découvert qu'une population de sécrétion accrue de CCL5 aide à établir un TME proinflammatoire en transportant des CTL dans les tissus du cancer colorectal.[32] Grâce à l'IHC et à la séquence d'ARN du profil de chimiokine dans plusieurs cohortes, Romero et al. démontré que CCL4 et CCL5 ont une forte association avec le niveau d'infiltration des cellules CD8+T dans le cancer du pancréas.[33] Par conséquent, nous avons considéré que les chimiokines liées aux lymphocytes T CD8+ sont des chimiokines majeures régulées par BCAT2 dans le cancer de la vessie. Bien que nous ayons démontré les fortes corrélations négatives entre BCAT2 et les chimiokines liées aux lymphocytes T CD8+, le mécanisme de régulation sous-jacent entre elles doit encore être exploré plus en détail. L'étude de Peterson et al. démontré que l'activation de la voie de signalisation MAP kinase (MAPK) peut induire la production de CX3CL1.[34] Xu et coll. a révélé que la voie de signalisation JAK-STAT régulait la sécrétion de chimiokines liées à Th1-, provoquant une diminution du niveau d'infiltration des TIL.[35] Récemment, Peng et al. ont découvert que la déméthylase JMJD3 peut inhiber l'expression des chimiokines liées aux cellules CD4+T et réduire le niveau d'infiltration des cellules T cytotoxiques dans le TME, représentant un rôle crucial de la modification épigénétique dans la régulation de l'expression des chimiokines.[36] Mayo et coll. a également révélé qu'un inhibiteur épigénétique, l'histone désacétylase 1, a une grande capacité à supprimer l'expression de CXCL8 via l'activation de la voie de signalisation du facteur nucléaire-𝜅B (NF-𝜅B).[37] De plus, en tant que symboles du métabolisme des cellules tumorales, de la glycolyse aérobie et des espèces réactives de l'oxygène (ROS), indiquant de grandes performances pour induire l'expression de CXCL8 et CXCL14 en augmentant les activités des voies de signalisation de NF-𝜅B et de la protéine activatrice du facteur de transcription 1 (AP{{93 }}).[38] Fait intéressant, dans notre étude, les voies de signalisation de NF-𝜅B, STAT et MAPK étaient significativement enrichies entre les lignées cellulaires BCAT2 élevées et faibles (Figure 3K ; Figure S16A, B, Informations complémentaires). Par conséquent, en combinant les études ci-dessus, nous explorerons plus en détail la molécule clé dans le mécanisme de régulation des chimiokines liées au BCAT2 et au CD8+T. Le taux de réponse objective limité de la monothérapie par ICB incite à l'avènement d'une stratégie thérapeutique combinée. Pour convertir le TME non immunologique en TME immunologique, Wolchok et al. appliqué un co-traitement du nivolumab (thérapie anti-PD-1) et de l'ipilimumab (thérapie anti-CTLA-4) chez des patients atteints de mélanome et a trouvé un effet curatif encourageant, attribué à une amorçage, une activation et une destruction synchrones améliorées des CTL .[39] Plus qu'une combinaison avec un autre type d'ICB, la chimiothérapie et l'immunothérapie constituent une option thérapeutique alternative. En tant que schéma thérapeutique de première intention pour le carcinome urothélial avancé, quelques études ont montré que la chimiothérapie à base de cisplatine est capable de façonner un TME proinflammatoire en augmentant le niveau d'expression du CMH I de classe sur les cellules dendritiques et en endommageant les MDSC et les Treg. Par coïncidence, Homma et al. a révélé qu'un autre médicament de chimiothérapie courant pour le cancer de la vessie, la gemcitabine, peut améliorer la quantité d'infiltration de cellules CD8+T et altérer les cellules immunitaires immunosuppressives dans le TME.[41] Dans notre expérience préclinique sur les animaux, le co-traitement de la perte de BCAT2 et du mab anti-PD -1 a montré une efficacité antitumorale plus distincte par rapport à la monothérapie du mab anti-PD -1 chez des souris immunocompétentes, qui fournit un traitement innovant. stratégie pour les patients résistants à l’ICB. Parallèlement, grâce à l'analyse par cytométrie en flux et à l'IF, nous avons démontré que l'inactivation de BCAT2 recrute non seulement davantage de population de CTL dans le TME, mais améliore également l'activité de destruction des CTL. De même, Peng et al. ont découvert que la surexpression de LGALS2 diminue la quantité de CTL infiltrants ainsi que les biomarqueurs cytotoxiques chez les souris porteuses d'un cancer du sein.[42] Yang et coll. Il a illustré que CXCL13 est capable d'augmenter la réponse à l'immunothérapie dans des modèles murins de cancer de l'ovaire en augmentant le niveau d'infiltration des lymphocytes T CD8+ et le niveau de sécrétion de GZMB, IFN-𝛾 et IL-2.[43] Accompagnant une réponse anticancéreuse plus forte, la thérapie combinée perturbe encore davantage la boucle de rétroaction immunitaire existante, ce qui entraîne probablement de graves effets secondaires. Selon le modèle d'expression de BCAT2 au niveau du siARN, spécifiquement exprimé dans les cellules tumorales plutôt que dans les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, nous pouvons en déduire de manière préliminaire que la perte de BCAT2 ou l'inhibiteur de BCAT2 est moins susceptible d'entraîner de terribles effets indésirables. Cependant, la posologie optimale et l'intervalle de temps entre l'inhibiteur de BCAT2 et l'anticorps anti-PD -1 en thérapie combinée doivent encore être explorés.

Pour guider une thérapie de précision chez les individus, nous avons corrélé BCAT2 au sous-type moléculaire de BLCA et aux biomarqueurs critiques de diverses thérapies. Sur la base de prédictions crédibles issues de plusieurs cohortes, nous avons constaté que l’immunothérapie, la chimiothérapie, la radiothérapie et la thérapie ciblée par EFGR conviennent aux patients présentant une faible expression de BCAT2. Un traitement antiangiogénique est recommandé pour les patients présentant une expression élevée de BCAT2. Différent du processus de détection compliqué des sous-types moléculaires, BCAT2 est un prédicteur portable pour une thérapie de précision. Inévitablement, nos études présentent certaines limites. Premièrement, la taille des échantillons et la durée de suivi de la cohorte Xiangya BLCA et de la cohorte d’immunothérapie Xiangya BLCA étaient limitées. Nous devons élargir davantage la taille de l’échantillon et poursuivre un suivi standardisé. Deuxièmement, en tant que cohorte réelle, la cohorte d’immunothérapie Xiangya BLCA contenait différentes options chirurgicales, ce qui a probablement provoqué un biais potentiel. Nous élargirons encore notre cohorte et procéderons à une analyse de sous-groupes basée sur la même option chirurgicale. Troisièmement, l’effet coopératif de la thérapie combinée in vivo doit être davantage validé à l’aide de l’application systémique de l’inhibiteur BCAT2. En résumé, en tant que rôle immunosuppresseur dans le TME du BLCA, BCAT2 est une cible émergente dans la thérapie combinée de l'ICB et un biomarqueur précis de la thérapie de précision.

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4. Section expérimentale

cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 et la valeur p ajustée < 0.05. Des analyses de Gene Ontology (GO) et de l'Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) ont été effectuées sur les DEG identifiés par le package ClusterProfiler R.[51] Le package Seurat R avec l'algorithme Findmarker a été appliqué pour calculer le niveau d'expression de BCAT2 sur les cellules épithéliales dans scRNA-seq. Sur la base d'un classement varié de l'expression génique par valeur de changement de pli (FC), une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) a été mise en œuvre pour juger des corrélations positives et négatives. Identification des DEG liés au système immunitaire : le package ESTIMATE R a été utilisé pour calculer les scores immunitaires et stromaux dans la cohorte TCGA-BLCA. Selon la valeur médiane de deux scores et le niveau d’expression de BCAT2, le package Limma R a été appliqué pour identifier les DEG positifs/négatifs liés au système immunitaire et au stroma. Le package R du diagramme de Venn a été utilisé pour prendre l’intersection de différents groupes et garantir les DEG communs. Classification des individus utilisant des sous-types moléculaires de BLCA : Sept sous-types moléculaires de BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT et Consensus) ont été largement appliqués en clinique pour évaluer les caractéristiques du TME et l'efficacité de diverses thérapies.[52] Compte tenu de l'interaction complexe des différents sous-types, nous les avons collectivement divisés en deux catégories principales : les sous-types basaux et luminaux.[16] Les packages R de sous-typages Consensus MIBC et BLCA ont été utilisés pour classer les individus en sous-types spécifiques. Après normalisation, l'aire sous la courbe ROC (AUC) a été utilisée pour évaluer la fiabilité de BCAT2 dans la prédiction de la classification. Évaluation thérapeutique de précision des patients : Comme illustré dans notre étude précédente,[53] une série de signatures génétiques critiques, qui peuvent prédire l'efficacité de la chimiothérapie, de la radiothérapie, de la thérapie ciblée et de l'immunothérapie, ont été recueillies à partir de différentes études et bases de données.[16, 54] L'algorithme ssGSEA a été utilisé pour calculer les scores d'enrichissement des signatures génétiques.[55] Lignées cellulaires : Des cellules de cancer de la vessie humaine (T24) et des cellules de cancer de la vessie murine (MB49) ont été achetées respectivement auprès de Procell Life Science & Technology (Wuhan, Chine) et Meisen CTCC (Jinhua, Chine). Ils ont été maintenus dans un milieu DMEM (BasalMedia, Chine) avec 1 0 % de sérum fœtal bovin (FBS) (BI, Israël), 1 % de pénicilline et de streptomycine (NCM Biotech, Chine), et cultivés dans un incubateur à 37 °C. température de degré contenant 5% de CO2. Construction et séquençage d'ARN de cellules de transfection stables : le vecteur lentiviral plenti-BCAT2-flag-puromycine (GV341) a été conçu et construit par GeneChem (Shanghai, Chine) pour la surexpression stable de BCAT2- (BCAT2 OE) lignée cellulaire et son contrôle négatif (oe-vecteur). De plus, l'ARN en épingle à cheveux court (shRNA) BCAT 2- a été cloné dans un vecteur lentiviral GV 112- par GeneChem (Shanghai, Chine) pour une lignée cellulaire stable BCAT 2- knock down (BCAT2 KD). . Les séquences cibles de shRNA ont été répertoriées dans le tableau S3 (informations complémentaires). Ensuite, les lentivirus BCAT2 recombinants ont été transfectés dans des cellules objectives conformément aux instructions du fabricant. 2 µg mL-1 de puromycine (Amersco, USA) ont été utilisés pour filtrer les cellules de transfection stables pendant trois jours. Le Western blot et la PCR quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) ont été appliqués pour valider l’efficacité de la transfection. Finalement, une cellule de transfection stable présentant la meilleure efficacité a été sélectionnée pour le séquençage d’ARN et d’autres expériences. Trois échantillons en double de chaque lignée cellulaire ont été envoyés à la plateforme BGI RNA-seq (Shenzhen, Chine). Les critères de sélection des DEG et d’analyse des voies d’enrichissement étaient les mêmes que ceux décrits en 2.3 (analyses des voies d’enrichissement). Tests immunologiques multiples ProcartaPlex pour détecter le niveau de sécrétion des chimiokines et des cytokines des lignées cellulaires cancéreuses : panel de tests immunologiques ProcartaPlex humain (Cat : EPX340-12167-901) et panel de tests immunologiques ProcartaPlex de souris (Cat : EPX{{50}}) ont été achetés auprès de ThermoFisher Scientific (Massachusetts, États-Unis) pour détecter les niveaux d'expression protéique de plus de 3 0 chimiokines et cytokines cruciales dans les cellules cancéreuses de transfection stables. En bref, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés à partir d'une plaque à puits 24- et centrifugés pour éliminer les cellules et les débris cellulaires. Ensuite, les surnageants clarifiants ont été incubés avec des billes dans le panneau en suivant les instructions du fabricant. La plateforme de détection Luminex (ThermoFisher Scientific, USA) a été utilisée pour effectuer une analyse quantitative sur chaque échantillon. Les indicateurs non détectés ont été exclus de l’analyse. qRT-PCR : l'ARN total a été isolé à partir de cellules avec le kit d'isolement de l'ARN total cellulaire et le kit d'isolement de l'ARN total animal (Foregene, Chine) conformément au protocole du fabricant. L'ADNc a été synthétisé à l'aide du système UeIris II RTPCR pour la synthèse de l'ADNc du premier brin (US Everbright, Chine). La qRTPCR a été réalisée à l'aide du SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, Chine) sur le système CFX Connect (Bio-Rad, USA). GAPDH a été utilisé comme contrôle standard interne. Les amorces ont été conçues et synthétisées par Sangon Biotech (Shanghai, Chine) et les séquences d'amorces détaillées ont été répertoriées dans le tableau S4 (informations complémentaires). ELISA : Les concentrations de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) et CXCL10 (IP10) dans les surnageants de cultures de cellules de cancer de la vessie humaine ont été déterminées par des kits ELISA humains selon le protocole du fabricant (Proteintech, USA). Un lecteur de microplaques biotechnologiques (ThermoFisher Scientific, USA) a été utilisé pour mesurer les valeurs de densité optique (DO). Compte tenu de la grande diversité des niveaux de sécrétion entre les différentes cytokines et chimiokines, nous avons procédé à la standardisation des données (transformation log 2) avant analyse. Western Blot : un tampon RIPA (NCM biotech, Chine) ajouté à un cocktail d'inhibiteurs de protéase à 1 % (NCM biotech, Chine) a été utilisé pour lyser les cellules. Le kit de dosage de protéines BCA (NCM biotech, Chine) a été utilisé pour déterminer les concentrations de protéines. Après avoir été transférées sur des membranes PVDF, les protéines cellulaires ont été incubées successivement avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires spécifiques conjugués à la HRP. Les signaux ont été capturés par le système d'imagerie XRS (Bio-Rad, USA). Les anticorps primaires comprennent un anticorps anti-BCAT2 (Cat : ab95976, Abcam, USA) et un anticorps anti-GAPDH (Cat : ab8245, Abcam, USA). Les anticorps secondaires comprennent les IgG anti-lapin de chèvre HRP (Cat : 7074, Cell Signaling Technology, USA) et les IgG anti-souris de chèvre HRP (Cat : 7076, Cell Signaling Technology, USA). Test de destruction des cellules cancéreuses à médiation lymphocytaire T et test de coculture : des échantillons de sang ont été prélevés auprès de 10 donneurs sains dans notre hôpital. Conformément aux instructions du fabricant, une centrifugation en gradient a été utilisée pour extraire les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par Lymphoprep (Cat : 07851, StemCell Technologies, USA). De plus, du tampon de lyse des globules rouges (Solarbio, Chine) a été utilisé pour éliminer les globules rouges mélangés aux PBMC. Afin d'activer les cellules T, les PBMC ont été cultivées dans du milieu DMEM (Gibco, USA), en complément de l'IL humaine recombinante - 2 (10 ng mL−1, Cat : 202-1L-050, R&D , USA) et activateur de lymphocytes T CD3/CD28/CD2 humain ImmunoCult (25 μL mL−1, Cat : 10970 ; STEMCELL Technologies, USA) pendant 1 semaine. Au rapport de 1:5, des cellules cancéreuses de la vessie humaine (BCAT2-OE, BCAT2-KD et leurs contrôles négatifs) ont été co-cultivées avec des cellules T activées dans un milieu DMEM avec un anticorps anti-CD3 (100 ng mL−1, Thermo Scientific, USA) et IL-2 (10 ng mL−1) d'un donneur dans une plaque à puits 12- pendant 72 h. Ensuite, les lymphocytes T ont été collectés pour une analyse par cytométrie en flux. La stratégie de porte détaillée de l'analyse de flux est présentée dans la figure S28 (informations de support). Les cellules cancéreuses restantes ont été colorées au cristal violet et la valeur de DO mesurée à 570 nm par un lecteur de microplaques. Les anticorps pour l'analyse par cytométrie en flux comprennent le kit Zombie Aqua Fixable Viability (Cat: 423101, Biolegend, USA), l'anticorps anti-CD45 humain APC/Cy7 (Cat: 368516, Biolegend, USA), l'anticorps anti-CD3 humain Pacific Blue (Cat: 300329, Biolegend, USA), anticorps PerCP/Cy5.5 anti-CD4 humain (Cat : 317427, Biolegend, USA), anticorps FITC anti-CD8a humain (Cat : 301006, Biolegend, USA), PE/Dazzle 594 anti-TNF-humain 𝛼 Anticorps (Cat : 502946, Biolegend, USA) et Brilliant Violet 711 anti-IFN-humain 𝛾 Anticorps (Cat : 502540, Biolegend, USA). Test de chimiotaxie : le test de chimiotaxie a été mis en œuvre dans une plaque transwell 24-puits avec un diamètre de noyau de 3 μm (Corning, États-Unis). Un kit d'isolement de cellules CD8+T humaines (Cat : 480012, Biolegend, USA) a été utilisé pour extraire les cellules CD8+T des PBMC. 1 × 105 cellules isolées dans un volume de 200 μL ont été ajoutées dans la chambre supérieure et 600 μL de surnageants de différentes lignées cellulaires de transfection stables ont été ajoutées dans la chambre inférieure. Après 6 heures d'incubation à 37 degrés, les cellules ont migré dans la chambre inférieure et ont été récoltées et comptées par cytométrie en flux. Tests de prolifération cellulaire, de migration et d’invasion : Un test de formation de colonies en plaques a été utilisé pour évaluer la capacité de prolifération cellulaire. Des cellules de cancer de la vessie humaine BCAT2-OE, BCAT2-KD et témoins négatifs ont été cultivées dans des plaques de 6-puits par puits. Après incubation dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés pendant 2 semaines, les colonies ont été fixées et teintes respectivement avec du paraformaldéhyde et du cristal violet. Des chambres Transwell avec des inserts de membrane en polycarbonate à pores de 8,0 µm (Corning, USA) ont été utilisées pour évaluer la capacité de migration cellulaire et d'invasion in vitro. 1 x 105 cellules transfectées stables ont été suspendues dans un milieu sans sérum et ensemencées dans la chambre supérieure avec ou sans Matrigel (Corning, USA), pour les tests d'invasion et de migration séparément. Après 24 h d'incubation (test de migration) et 48 h (test d'invasion), les cellules adhérant à la surface inférieure de la membrane ont été fixées et colorées. Les cellules restées dans la chambre supérieure ont été retirées par écouvillons. Cinq champs aléatoires ont été sélectionnés au microscope pour calculer le nombre de cellules. Immunofluorescence (IF) et immunohistochimie (IHC) : L'IF multicolore sur les TMA de la cohorte Xiangya BLCA et de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA a été mise en œuvre à l'aide d'un kit de coloration immunohistochimique fluorescente multiple (Absin, Chine). En bref, après déparaffinage, réhydratation et rénovation antigénique, le TMA a été incubé avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires, ce qui provoque la liaison de différentes luciférines par amplification du signal tyramide (TSA). Après avoir éliminé les anticorps non liés avec un tampon citrate, le processus d'incubation a été répété deux fois. Le DAPI a été utilisé pour contre-colorer les noyaux cellulaires et les images ont été numérisées par la plateforme Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Hongrie). Les anticorps primaires sur la TMA de la cohorte Xiangya BLCA comprennent les anti-BCAT2 (Cat : ab95976, Abcam, USA), les anti-cytokératine 19 (CK19) (Cat : ab52625, Abcam, USA), les anti-CD8 (Cat : ab237709, Abcam, USA). ) et DAPI (Invitrogen, États-Unis). Les anticorps secondaires et le fluorochrome sur la TMA de la cohorte Xiangya BLCA incluent HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Les anticorps primaires sur la TMA de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA comprennent les anti-BCAT2 (Cat : ab95976, Abcam, USA), les anti-PD-L1 (Cat : ab213524, Abcam, USA) et le DAPI (Invitrogen, USA). Les anticorps secondaires et le fluorochrome sur la TMA de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA comprennent HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus et Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). L'IF sur les tissus tumoraux murins a été incubé avec un anticorps primaire - anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, USA) - et un anticorps secondaire - un conjugué de colorant Alexa Fluor 488 anti-souris (Invitrogen, USA) de manière séquentielle. Le DAPI a été appliqué au noyau cellulaire visualisé. Cinq champs aléatoires ont été sélectionnés au microscope pour calculer le nombre de cellules à coloration positive. L'IHC sur les TMA de la cohorte Xiangya BLCA et de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA a été réalisée par le kit SP -9000 (ZSGB-BIO, Chine). Après la récupération et le blocage de l’antigène, les anticorps primaires et les anticorps secondaires ont été incubés tour à tour avec les tissus tumoraux. Ensuite, de la diaminobenzidine (DAB) a été appliquée pour colorer les antigènes cibles. Le signal brun a été considéré comme une coloration positive. Score d'intensité de coloration (absent=0, faible=1, modéré=2 et fort=3) multipliant le score de pourcentage positif (pas de coloration=0, coloration des cellules moins de 25 %=1, 25 % à 50 % de cellules colorées=2, 50 % à 75 % de cellules colorées=3 et une coloration cellulaire supérieure à 75 %=4) était score IHC ultime des échantillons. Les scores de BCAT2/CD8/PD-L1 inférieurs à six points ont été classés comme expression faible, leurs scores supérieurs ou égaux à six points ont été classés comme expression élevée. Pour juger du statut d'un individu sur le ROR, tous les échantillons de la cohorte d'immunothérapie Xiangya BLCA ont été évalués sur la base des résultats de coloration de quatre gènes marqueurs MMR (MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2). Comme le montrent des études précédentes[56], lorsque les quatre gènes marqueurs présentaient une coloration positive, l'individu était marqué comme ROR. Lorsque l’un des quatre gènes marqueurs présentait une coloration négative, l’individu était marqué comme dMMR. Deux pathologistes indépendants ont été invités à réaliser l'évaluation. Les anticorps comprennent : anti-BCAT2 (Cat : ab95976, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat : ab4055, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat : ab213524, Abcam, USA), anti-MLH1 (Cat : A4858, Abcolonal, Chine), anti-MSH2 (Cat : A22177, Abcolonal, Chine), anti-MSH6 (Cat : A16381, Abcolonal, Chine), anti-PMS2 (Cat : A4577, Abcolonal, Chine) et HRP Goat Anti -IgG de lapin/souris (ZSGB-BIO, Chine). Analyses panoramiques TissueFAXS de l'interaction spatiale dans TME : Pour évaluer l'interaction spatiale des cellules malignes BCAT2+ et des cellules T effectrices, la plate-forme panoramique TissueFAXS (Tissue Gnostics, Autriche) a été utilisée pour numériser et analyser semi-automatiquement les cellules objectives colorées par IF multicolore sur TMA de la cohorte Xiangya BLCA. La TMA était constituée de biopsies de 1,5 mm provenant d'échantillons de tissus tumoraux inclus en paraffine. En détail, les cellules BCAT2+, les cellules malignes et les cellules CD8+T ont été colorées par des anticorps primaires spécifiques et des anticorps secondaires. Le DAPI (Invitrogen, USA) a été utilisé pour colorer le noyau cellulaire. Des étapes détaillées ont été décrites dans l'étude de Makarevic et al.[57] En bref, selon les intensités de fluorescence de différents indicateurs et propriétés physiques des cellules, les cellules positives ont été marquées et quantifiées. Plus important encore, les distributions spatiales des cellules CD8+T autour des cellules BCAT2+CK19+ ont été représentées par des nuages ​​de points sur la base de la distance spatiale (0–25, 25–50, 50– 100 et 100-150 μm). Deux pathologistes expérimentés ont été invités à vérifier le résultat de la décision de la plateforme panoramique TissueFAXS. Expériences sur les animaux : Des souris femelles C57BL/6 (6 à 7 semaines) ont été obtenues auprès du Département des animaux de laboratoire de la Central South University. Toutes les opérations sur les souris ont été vérifiées et approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'hôpital Xiangya, Université Central South (numéro d'article : 2021101175). Surtout, pour étudier le rôle de BCAT2 sur la croissance tumorale in vivo, des cellules BCAT2 KD MB49 (5 × 105) et ses cellules témoins dans un volume moyen de 100 μL ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris. De plus, après avoir construit avec succès un modèle de tumeur sous-cutanée (volume tumoral jusqu'à 100 mm3), 100 ug d'InVivomAb anti-souris PD-1 (Cat : BE0146, Bioxcell, USA) et un contrôle isotype IgG2a (Cat : BE0089, Bioxcell, USA) ont été injectés par voie intrapéritonéale à chaque souris, pour évaluer l'effet synergique de la perte de BCAT2 et du traitement anti-PD-1. Un traitement anti-PD-1 a été mis en œuvre sur des souris tous les 3 jours et a duré jusqu'à cinq cours. De plus, pour juger si l'effet coopératif du co-traitement dépendait des lymphocytes T CD8+. En accompagnement de la thérapie combinée, 100 ug d'InVivoPlus anti-souris CD8𝛼 (Cat : BP0117, Bioxcell, USA) et un contrôle isotype IgG2b (Cat : BP0090, Bioxcell, USA) ont été utilisés pour épuiser les lymphocytes T CD8+ chez la souris. Le poids corporel des souris a été enregistré tous les trois jours. À la date prévue, les tumeurs ont été récoltées, mesurées et préparées pour l’analyse par cytométrie en flux, la coloration IF et la qRT-PCR. Pour explorer l'interaction entre le niveau d'expression de BCAT2 sur les lymphocytes T CD8+ et l'activité des lymphocytes T CD8+, les rates de souris femelles C57BL/6 (6 à 7 semaines) sans tumeur ont été dissocié et préparé pour une suspension unicellulaire pour une analyse plus approfondie. Analyse par cytométrie en flux : les tumeurs murines ont été broyées et digérées en suspension unicellulaire par la collagénase IV (Cat : C5138, Sigma, USA), la hyaluronidase (Cat : H3506, Sigma, USA) et la DNase I (Cat : DN25, Sigma, USA). ). Des tamis cellulaires de 70 µm (BIOFIL, Chine) ont été utilisés pour filtrer les impuretés et un compteur cellulaire (Countstar, Chine) a été utilisé pour gagner (3 à 5) × 106 cellules dans chaque échantillon. Après avoir identifié les cellules vivantes à l'aide du kit Zombie Aqua Fixable Viability (Cat : 423101, Biolegend, USA) et bloqué le récepteur Fc avec l'anticorps anti-souris CD16/32 (Cat : 156603, Biolegend, USA), les antigènes de la membrane cellulaire ont été colorés par APC-Cy7. anti-souris CD45 (Cat : 103116, Biolegend, USA), BV421 anti-souris CD3 (Cat : 100341, Biolegend, USA), BV605 anti-souris CD8a (Cat : 100744, Biolegend, USA) et PerCPCy5.5 anti-souris CD4 (Cat : 100540, Biolegend, États-Unis). Ensuite, l’ensemble de tampons de coloration Foxp3 / Transcription Factor de bioscience (Cat: 2400632, Invitrogen, USA) a été utilisé pour fixer et perméabiliser la membrane cellulaire et nucléaire. Les antigènes liés à l'effet cytotoxique ont été colorés par PE anti-humain/souris Granzyme B (Cat : 372208, Biolegend, USA), PE-Cy7 anti-souris TNF-𝛼 (Cat : 506324, Biolegend, USA), PE-Dazzle 594 anti- IFN-𝛾 de souris (Cat : 505846, Biolegend, USA), APC anti-souris Perforin (Cat : 154304, Biolegend, USA). La stratégie de déclenchement de l'analyse par cytométrie en flux est présentée à la figure S29 (informations complémentaires). Le BCAT2 anti-humain/souris (Cat : A7426, Abclonal, Chine) a été incubé avec le kit de marquage d'anticorps Flexible 488 (Cat : KFA001, Proteintech, USA) pour synthétiser un anticorps fluorescent BCAT2 personnalisé pour une analyse par cytométrie en flux. Ensuite, l'anticorps BCAT2 et les anticorps liés aux lymphocytes T ont été mélangés et ajoutés à une suspension unicellulaire de rate murine pour explorer l'interaction entre le niveau d'expression de BCAT2 sur les lymphocytes T CD8+ et l'activité du CD{{357}. } Cellule T. La stratégie de déclenchement de l'analyse par cytométrie en flux est présentée à la figure S30 (informations complémentaires). Les échantillons colorés ont été détectés par cytométrie en flux Cytek DxpAthena (Cytek Biosciences, USA) et les données ont été analysées par le logiciel Flowjo (BD Biosciences, USA). Analyse statistique : Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Un test t avec ou sans correction de Welch a été utilisé pour comparer les variables continues entre deux groupes. Une analyse ANOVA unidirectionnelle avec ou sans tests de Brown – Forsythe et Welch a été utilisée pour comparer des variables continues entre plusieurs groupes. Le test du chi carré ou le test exact de Fisher a été appliqué pour comparer les variables dichotomiques. Le test des coefficients de corrélation de Pearson ou Spearman a été utilisé pour estimer l'intensité de la corrélation entre différentes variables. La courbe de survie de Kaplan – Meier a été utilisée pour montrer les analyses pronostiques de variables dichotomiques, et le test du log-rank a été utilisé pour juger des différences statistiques. P < 0,05 bilatéral a été défini comme seuil de signification. Le logiciel R (version 4.0) et GraphPad Prism8 ont été appliqués pour traiter les données de l'étude.

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