La peroxydation lipidique lysosomale régule l’immunité tumorale

L'inhibition lysosomale provoquée par les inhibiteurs de la palmitoyl-protéine thioestérase 1 (PPT1) tels que le DC661 peut provoquer la mort cellulaire, mais le mécanisme à l'origine de cela n'est pas complètement compris. Les voies de mort cellulaire programmées (autophagie, apoptose, nécroptose, ferroptose et pyroptose) n'étaient pas nécessaires pour obtenir l'effet cytotoxique du DC661. L'inhibition des cathepsines, ou la chélation du fer ou du calcium, n'a pas sauvé la cytotoxicité induite par les DC661-. L'inhibition de la PPT1 a induit une peroxydation lipidique lysosomale (LLP), qui a conduit à une perméabilisation de la membrane lysosomale et à la mort cellulaire qui pourrait être inversée par l'antioxydant N-acétylcystéine (NAC), mais pas par d'autres antioxydants de peroxydation lipidique. Le transporteur de cystéine lysosomale MFSD12 était nécessaire pour le transport intralysosomal de la NAC et le sauvetage du LLP. L'inhibition de PPT1 a produit une immunogénicité intrinsèque aux cellules avec une expression de surface de la calréticuline qui ne pouvait être inversée qu'avec la NAC. Les cellules traitées par DC661- ont amorcé les cellules T naïves et ont amélioré la toxicité médiée par les cellules T. Les souris vaccinées avec des cellules traitées par DC661- ont engendré une immunité adaptative et un rejet de tumeur dans les tumeurs « immunes chaudes », mais pas dans les tumeurs « immunes froides ». Ces résultats démontrent que la LLP entraîne la mort cellulaire lysosomale, une forme immunogène unique de mort cellulaire, ouvrant la voie à des combinaisons rationnelles d’immunothérapie et d’inhibition lysosomale qui peuvent être testées dans des essais cliniques.

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Introduction

Avec une activité encourageante dans les essais cliniques impliquant l'inhibiteur lysosomal hydroxychloroquine (HCQ) (1), l'identification de la palmitoyl-protéine thioestérase 1 (PPT1) comme cible moléculaire des dérivés de la chloroquine (2) et le lancement de nouveaux inhibiteurs de la PPT1 en clinique (3, 4), il est nécessaire de comprendre le mécanisme par lequel les inhibiteurs lysosomals induisent la mort cellulaire et l'effet de l'inhibition lysosomale sur l'immunité tumorale. Le mécanisme canonique de la mort des cellules lysosomales décrit pour l'HCQ implique la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP), la fuite de cathepsines et l'activation de l'apoptose médiée par les caspases (5, 6). Nous avons précédemment montré que l'inhibiteur lysosomal DC661 pénètre dans les cellules du microenvironnement acide de la tumeur et se localise dans le lysosome plus efficacement que l'HCQ (2, 7). DC661 produit une mort cellulaire puissante dans de nombreuses lignées de cellules cancéreuses (2). DC661 se lie et inhibe PPT1, désacidifie le lysosome et inhibe l'autophagie. DC661 induit également du LMP et augmente les niveaux de caspase 3 clivée (2, 7). Ces dernières années, de nouveaux mécanismes de mort cellulaire ayant des conséquences immunogènes ont été définis, notamment la nécroptose, la ferroptose et la pyroptose (8). Il a été démontré que l'autophagie dépendante du lysosome dégrade le CMH de classe I (9), ainsi que les composants de l'immunoprotéasome (10), ce qui suggère que l'inhibition de l'autophagie peut améliorer le traitement des antigènes. Cependant, les effets immunogènes de l’inhibition lysosomale et de la mort cellulaire qui en résulte n’ont pas été entièrement caractérisés. Pour combler ce manque de connaissances, nous avons étudié les effets du DC661 sur les mécanismes canoniques de mort cellulaire afin de déterminer si la mort cellulaire lysosomale est sa forme de mort cellulaire ou simplement un précurseur de l'un des autres mécanismes établis. Nous avons constaté que HCQ et DC661 induisaient une augmentation significative d'un petit nombre seulement de protéines dans le protéome du mélanome et que la plupart d'entre elles étaient des protéines liées à l'autophagie et à l'apoptose. Les inhibiteurs de la mort cellulaire programmée (apoptose, nécroptose, ferroptose et pyroptose) n'ont pas atténué les effets cytotoxiques après une altération lysosomale par DC661. La peroxydation lipidique lysosomale (LLP) est un facteur majeur de la mort cellulaire induite par la LMP associée à l'expression de la calréticuline (CALR) à la surface cellulaire. Cette forme de mort cellulaire ne peut être inversée qu’en utilisant l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). L'activité de la NAC était altérée par l'inhibition de l'importateur de cystéine lysosomale MFSD12. La LLP a suscité des phénotypes immunogènes favorisant la destruction médiée par les lymphocytes T. Ces résultats démontrent que la mort cellulaire lysosomale est une forme potentiellement unique de mort cellulaire immunogène.

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Résultats

L'inhibition lysosomale induit des changements significatifs dans le protéome associés à l'autophagie et à l'apoptose. Pour établir les effets cytotoxiques des inhibiteurs lysosomal, nous avons évalué la viabilité du mélanome A375P, du carcinome du côlon RKO et des lignées cellulaires de cancer du pancréas MIA PaCa-2 traitées avec l'inhibiteur vacuolaire de la H+-ATPase, la bafilomycine-A1 (1 00 nM ); Inhibiteurs PPT1 DC661 (3 μM) ou HCQ (10 μM ou 30 μM) ; fluorure d'hexadécylsulfonyle mimétique palmitate (HDSF ; 60 μM ); les inhibiteurs de la cathepsine, la pepstatine A (PepA ; 10 ug/mL), l'E64 (PepA ; 10 ug/mL) ou PepA+E64 ; et le perturbateur de la membrane lysosomale Leu-Leu méthylester hydrobromure (20 μM) pendant 48 heures. Seules la bafilomycine-A1 et le DC661 ont provoqué une diminution significative de la viabilité cellulaire dans les lignées cellulaires cancéreuses (Figure 1A et Figure 1A supplémentaire ; matériel supplémentaire disponible en ligne avec cet article ; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), le DC661 produisant une réduction plus profonde de la viabilité cellulaire que la bafilomycine-A1. Sur la base de ces données et des propriétés pharmacologiques des dérivés de la chloroquine, nous avons concentré notre étude sur les dérivés de la chloroquine en tant qu'outils permettant de comprendre la mort cellulaire lysosomale. Une analyse globale impartiale du protéome a été appliquée aux cellules de mélanome A375P traitées avec du DC661 (3 μM) ou du HCQ le moins puissant (10 μM ou 30 μM) pendant 24 heures. Sur les 4 264 protéines quantifiées avec un niveau de confiance élevé, seules 87 et 55 protéines présentaient une augmentation significative avec DC661 (3 μM) et HCQ (30 μM), respectivement ; de plus, 14 et 15 protéines ont été significativement diminuées avec DC661 (3 μM) et HCQ (30 μM), respectivement (changement absolu supérieur à 2 ; q < 0,05) avec DC661 (3 μM) ou HCQ (30 μM), respectivement , par rapport au contrôle du véhicule. La dose plus faible de HCQ (10 μM) n’a montré aucun changement protéique significatif par rapport au véhicule témoin. Les 50 principales protéines qui ont augmenté de manière significative après le traitement par DC661 étaient principalement associées à l'autophagie et à l'apoptose, et des changements similaires ont été observés pour la dose plus élevée de HCQ (Figure 1B). Pour ces raisons, nous avons choisi de concentrer nos études plus approfondies sur le DC661, plus puissant. Des exemples de certains des changements protéiques les plus importants associés à l'autophagie et à l'apoptose étaient la protéine de liaison à la taxe 1 (TAX1BP1 ; augmentée de 15- fois) ; BCL2-protéine d'interaction 3 (BNIP3 ; augmentée de 6-fois ); voisin de la protéine du gène 1 BRCA1 (NBR1 ; augmenté de 12- fois ); séquestosome-1 (SQSTM1/p62 ; augmenté 5- fois ); coactivateur du récepteur nucléaire 4 (NCOA4 ; augmenté 3- fois ); et LC3B (MAP1LC3B ; augmenté de 3- fois). L'apolipoprotéine B-100 (APOB ; augmentée de 66- fois) était dérivée du sérum de veau fœtal et n'a pas été étudiée davantage. L'immunotransfert a confirmé que le traitement avec DC661 ou des concentrations plus élevées de HCQ produisait une augmentation marquée de l'expression des récepteurs cargo de l'autophagie NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 et NCOA4 en fonction de la dose et du temps (Figure 1 supplémentaire, B et C). CRISPR/Cas9 KO de PPT1 dans les cellules A375P phénocopié les effets du DC661 sur ces protéines par rapport à leurs homologues WT (Figure 1D supplémentaire). Cependant, l'expression des récepteurs cargo de l'autophagie et les augmentations relatives induites par le traitement par DC661 étaient variables selon le cancer du côlon, le cancer du pancréas et d'autres lignées cellulaires de mélanome dans lesquelles DC661 démontre une cytotoxicité (Figure 1E supplémentaire). Cela suggère que les récepteurs cargo de l'autophagie eux-mêmes, bien qu'ils soient augmentés au niveau protéique, sont peu susceptibles d'être responsables de la mort cellulaire après le traitement par DC661. Pour confirmer cela, nous nous sommes concentrés sur les récepteurs cargo de l'autophagie TAX1BP1 et BNIP3 car ils ont des effets pro-apoptotiques connus sur les cellules cancéreuses (Figure 1C). TAX1BP1 est un adaptateur de cargo pour l'autophagie (11) et régule également l'apoptose induite par des inhibiteurs de la synthèse des protéines ou des agents endommageant l'ADN dans les cellules cancéreuses (12). L'inactivation de TAX1BP1 par siRNA (Figure 1D) n'a pas affecté la cytotoxicité induite par les DC 661- dans les tests de viabilité à court terme (Figure 1E) et à long terme (Figure 1F). Ces résultats ont démontré que TAX1BP1 ne joue pas de rôle essentiel dans la cytotoxicité médiée par les DC661-. BNIP3 est une protéine pro-apoptotique qui altère la bioénergétique mitochondriale et régule la mitophagie (13). L'inactivation efficace de BNIP3 (Figure 1G) n'a pas affecté la cytotoxicité induite par les DC 661- (Figures 1, H et I). Ces résultats ont montré que les effets cytotoxiques du DC661 sont indépendants de l'expression de BNIP3. Ensuite, nous avons étudié les effets de l'épuisement des cellules des gènes canoniques de l'autophagie nécessaires à la production de l'autophagie sur l'efficacité du DC661 en éliminant unc-51 comme la kinase activant l'autophagie 1 (ULK1) et le gène 7 lié à l'autophagie (ATG7). L'inactivation efficace de ULK1 ou d'ATG7 (Figure 2 supplémentaire, A et B) a inhibé le flux autophagique (Figure 2C supplémentaire) mais n'a pas affecté la cytotoxicité induite par les DC 661- (Figure 1, J – M). Ces résultats ont montré que l’absence de la machinerie essentielle de l’autophagie n’abroge pas les effets cytotoxiques du DC661. L'inhibition lysosomale par DC661 induit plusieurs voies programmées de mort cellulaire. Le point de vue canonique est que la mort des cellules lysosomales est due à l'apoptose (5). L'immunotransfert a révélé que le traitement par DC661 entraînait l'activation des caspases -3, -7 et -9 et le clivage de PARP -1, confirmant que DC661 activait l'apoptose (Figure 2A). L'inhibiteur de pan-caspase Z-VAD-FMK a empêché l'activation de la caspase par DC661 mais n'a pas inhibé l'accumulation de LC3B et de p62, démontrant que l'activation de l'apoptose et le blocage de l'autophagie sont séparables après l'inhibition lysosomale (Figure 2B). Le blocage de l'apoptose avec ZVAD-FMK n'a pas amélioré ni limité la cytotoxicité du DC661, ce qui suggère que l'apoptose est indispensable à la mort des cellules lysosomales (Figure 2, C et D). Les effets cytotoxiques du DC661 étaient similaires dans les cellules primaires de moelle osseuse Bax/Bak double-KO incapables de subir l'apoptose et dans les cellules WT (Figure 2E). Le blocage de l'apoptose n'a pas non plus affecté la cytotoxicité induite par les DC 661- dans les cellules du cancer du côlon et du cancer du pancréas (Figure 2 supplémentaire, D – F). Parce que nous avons constaté que l'apoptose était inutile pour la mort cellulaire induite par les DC661-, nous avons étudié si le DC661 induisait la nécroptose, une autre forme de mort cellulaire programmée régulée par la protéine kinase interagissant avec le récepteur (RIPK) et la protéine de type domaine kinase de lignée mixte ( MLKL). Les niveaux des formes phosphorylées et activées de RIPK et MLKL ont augmenté après le traitement au DC661, passant de 0,1 à 1 μM (Figure 2F). À 3 μM de DC661, il y avait une absence de RIPK1 phosphorylé mais un MLKL phosphorylé persistant, ce qui suggère que, à cette concentration plus élevée, des formes supplémentaires de mort cellulaire pourraient être engagées. Le prétraitement avec la nécrostatine-1 ou la nécrostatine-1 des inhibiteurs de RIPK1 ou le nécrosulfonamide, inhibiteur de MLKL, a empêché la phosphorylation de RIPK1 après le traitement par DC661 (1 μM) dans les cellules de mélanome (Figure 2G), mais n'a pas réussi à sauver la DC{{192. }} cytotoxicité induite dans les cellules de mélanome (Figure 2H) ou dans les cellules de cancer du côlon ou de cancer du pancréas (Figure 2G supplémentaire). Ces résultats suggèrent que la nécroptose est activée mais inutile pour la mort cellulaire médiée par les DC661-.

Figure 1. L'inhibition de l'autophagie lysosomale induit des changements significatifs dans les protéines de l'apoptose et de l'autophagie. (UN)

Les lysosomes sont l'un des principaux sites de stockage du fer. Un métabolisme intracellulaire dérégulé du fer, associé à une diminution de la capacité réductrice, peut déclencher une mort cellulaire non apoptotique appelée ferroptose. Une caractéristique de la ferroptose est la régulation positive de la prostaglandine-endoperoxyde synthétase 2 (PTGS2), de l'homologue 1 du régulateur de transport de cations (CHAC1) et de la cystéinyl-ARNt synthétase (CARS) (14). Ces trois marqueurs de ferroptose ont été régulés positivement sur le plan transcriptionnel par le traitement DC661 (Figure 3A), ce qui suggère que l'inhibition lysosomale induit la ferroptose. DC661 a induit un changement de fluorescence dans les cellules A375P traitées au C11 – BODIPY, indiquant une peroxydation lipidique, caractéristique de la ferroptose. Ce changement induit par les DC661-a été significativement inversé en présence d'inhibiteurs de la ferroptose, la ferrostatine-1 ou la roxstatine pour les lèvres-1, administrés à une concentration efficace (Figure 3B et Figure supplémentaire 3A), indiquant en outre que DC661 ferroptose induite. Cependant, l'inhibition de la ferroptose n'a pas sauvé la cytotoxicité associée au DC661 (Figure 3, C et D). Le co-traitement des cellules cancéreuses avec le chélateur du fer déféroxamine (DFO) et le DC661 n'a pas sauvé la cytotoxicité du DC661 (Figure 3E). Le traitement par la ferrostatine-1, la lip roxstatine-1 ou le DFO n'a pas sauvé l'inhibition par DC661 de la viabilité à court terme ou de la croissance clonogénique à long terme dans les cellules cancéreuses du mélanome, du côlon et du pancréas (Figure 3 supplémentaire, B –E et Figure supplémentaire 4, A –D). Ces données démontrent que la ferroptose est activée mais indispensable pour la mort cellulaire médiée par les DC661-. Une pyroptose est une forme de mort cellulaire programmée associée à une réponse inflammatoire qui implique l'activation des caspases qui traitent la gastrine (GSDM), permettant la formation de pores sur la membrane plasmique et la libération ultérieure de modèles moléculaires associés aux dommages, tels qu'une mobilité élevée. zone de groupe 1 (HMGB1). Le traitement par DC661 dans plusieurs lignées cellulaires de mélanome (A375P, A375, WM35 et WM793) a entraîné l'activation de la caspase initiatrice-8 et de la -9 et de la caspase bourreau-7, typiques de la pyroptose, et a produit clivage du GSDME complet, d'étendue similaire à celle des inducteurs de pyroptose connus PLX4720 et PD0325901 (Figure 5A supplémentaire). DC661 a produit une libération extracellulaire plus forte de HMGB1 que l'inducteur de pyroptose connu, BRAF et l'inhibition de MEK dans 1% de FBS (15), reflétant la conséquence fonctionnelle de la pyroptose activée. Ensuite, nous avons testé si l'inhibition de la pyroptose par GSDME KO améliorerait les effets cytotoxiques du DC661. Le traitement par DC661 a induit l'accumulation de LC3II et SQSTM1/p62 et l'activation de la caspase, mais la libération de HMGB1 a été presque complètement supprimée dans les cellules humaines GSDME-KO WM35, démontrant que la conséquence fonctionnelle de l'inhibition de la pyroptose a été obtenue (Figure 3F). Cependant, le traitement DC661 a produit une cytotoxicité égale dans les cellules YUMM1.7 WT, à vecteur vide (EV) et Gsdme KO1 et KO2 dans des conditions de 10 % et 1 % de FBS (Figure 3G et Figure supplémentaire 5B). Un résultat courant de plusieurs formes de mort cellulaire est la libération de LDH. DC661 a produit une augmentation significative de la libération de LDH, qui n'a pas pu être inversée par l'apoptose, la nécroptose ou l'inhibition de la ferroptose (Figure 5C supplémentaire). Ces résultats ont montré que le DC661 induit plusieurs modes de mort cellulaire, notamment l'apoptose et la pyroptose ainsi que la nécroptose et la ferroptose, mais aucun de ces modes de mort cellulaire n'est requis pour la mort cellulaire induite par les DC661-. L'inhibition de la cathepsine ou la chélation du calcium n'empêche pas la mort cellulaire due à la perméabilisation de la membrane lysosomale. Après avoir démontré que l'activation de la caspase (qui est nécessaire à l'apoptose et à la pyroptose) est indispensable à la mort cellulaire induite par les DC 661-, nous avons émis l'hypothèse que la libération de cathepsine par les lysosomes pourrait provoquer la mort cellulaire dépendante de la caspase. L'inhibition chimique (DC661) ou génétique (ARNsi PPT1 [siPPT1]) de PPT1 a produit une perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP), tandis que le HDSF, un inhibiteur irréversible moins puissant de PPT1 qui s'épuise rapidement en culture cellulaire, ne pouvait pas induire de LMP, comme mesuré. par galectine -3 – puncta positif (Figure 4A). La LMP entraîne la libération de cathepsines et d'autres contenus lysosomal dans le cytoplasme et est considérée comme une caractéristique proximale clé de la mort cellulaire basée sur les lysosomes. La LMP induite par DC661 était associée à une augmentation significative de l'activité de la cathepsine-L cytoplasmique, qui était significativement bloquée par un inhibiteur de la cystéine protéase E64 (Figure 4B). Des rapports antérieurs suggéraient que la libération de cathepsine par les lysosomes fracturés favorisait l'activation de la caspase, conduisant à la mort cellulaire par apoptotique (16-18). L'inhibition complète de la cathepsine n'a pas empêché le clivage de la caspase (Figure 4C) et n'a pas sauvé la cytotoxicité induite par les DC661- dans les tests de viabilité à court et à long terme dans le mélanome (Figure 4, D et E), le cancer du côlon et le cancer du pancréas. cellules cancéreuses (Figure 6 supplémentaire, A – C). Ces résultats contredisent la vision canonique de la mort cellulaire lysosomale provoquée par la mort cellulaire médiée par la cathepsine. Outre la libération de cathepsine par les lysosomes qui fuient, la libération de calcium par les lysosomes a été impliquée dans un dysfonctionnement cellulaire lorsque PPT1 est altéré (19). Le traitement au DC661 a entraîné une libération importante de calcium, qui a été annulée par un prétraitement du chélateur cellulaire permanent du calcium (Ca2+), BAPTA-AM. (Figure 4F). Notamment, BAPTA-AM n'a pas empêché le clivage de la LMP (Figure 4G) ou de la caspase induit par les DC 661- (Figure 6 supplémentaire, D et E) et, plus important encore, n'a pas sauvé la cytotoxicité induite par les DC 661- ( Figure 4H). Ces résultats ont également été observés dans les lignées cellulaires RKO et MIA PaCa-2, dans lesquelles aucune différence significative dans les valeurs IC50 n'a été observée avec BAPTA-AM et DC661 (Figure 6F supplémentaire), ce qui suggère que la mort cellulaire associée à la LMP est ne dépend pas du calcium ou des cathepsines.

Figure 2. Apoptose et nécroptose induites par DC661-. (UN)

Figure 3. Ferroptose et pyroptose induites par DC661-. (UN)

Le LLP stimule le LMP. Ayant établi que les inhibiteurs des principales voies de mort cellulaire (apoptose, nécroptose, ferroptose et pyroptose), les cathepsines (PepA et E64) et les chélateurs d'ions (BAPTA-AM [Ca2+] et DFO [Fe{{3} }]) n'a pas empêché la mort cellulaire par DC661 et trouvant des preuves de peroxydation lipidique par C-11-BODIPY, nous avons effectué une analyse globale du lipidome 2 et 4 heures après le traitement par DC661. DC661 a induit des augmentations précoces et soutenues de 3- à 10- fois dans chaque classe de lysophospholipides (Figure 5A). En revanche, des changements minimes ou nuls ont été observés dans les classes de phospholipides, notamment la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, le phosphatidylglycérol et l'acide phosphatidique (Figure 7A supplémentaire). Les espèces lysophospholipides peuvent être générées par les ROS, qui oxydent la chaîne d'acides gras saturés qui est ensuite clivée par les phospholipases (20). Pour déterminer si les antioxydants pouvaient prévenir les dommages lipidiques médiés par les ROS, nous avons étudié la cytotoxicité induite par les DC 661- en présence du piégeur pan-ROS N-acétylcystéine (NAC) (21, 22) et des inhibiteurs putatifs de la peroxydation lipidique Trolox (23). ) et de la vitamine C (acide ascorbique) (24, 25). Contrairement à tous les autres agents testés jusqu'à présent, le co-traitement avec la NAC a sauvé la cytotoxicité associée aux DC 661- sur plusieurs lignées cellulaires (Figure 5B et Figure supplémentaire 7B). Les tests CFU à long terme ont montré que la NAC, contrairement à tous les inhibiteurs de la mort cellulaire, chélateurs d'ions et inhibiteurs de la cathepsine testés ici, empêchait les effets cytotoxiques du DC661 dans les cellules A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 et MC38 ( Figure 5C et Figure supplémentaire 7C). Il est intéressant de noter que Trolox et la vitamine C n'ont pas sauvé la cytotoxicité du DC661 dans le mélanome humain, le cancer colorectal, les cellules cancéreuses du pancréas, le mélanome murin et les cellules cancéreuses colorectales (Figure 5D et Figure supplémentaire 7, D – H). Cette disparité nous a incité à tester si la NAC, le Trolox et la vitamine C affectaient la LMP. Nos résultats ont montré que la NAC était le seul antioxydant qui réduisait de manière significative les LMP induites par les DC 661- (Figure 5E). Nous avons émis l'hypothèse que la LLP pilote la production de LMP par DC661, qui pourrait être inversée par la NAC mais pas par le Trolox et la vitamine C. Pour étudier le processus de la LLP, nous avons utilisé la sonde fluorescente FOAM-LPO (26), qui se localise spécifiquement dans le lysosome et produit un décalage spectral de 586 à 512 nm (du rouge au vert) lorsqu'il est exposé à des peroxydes lipidiques. Nous avons constaté que le DC661 induisait une LLP par rapport au contrôle (Figure 5F). La NAC a réduit la peroxydation lipidique dans les lysosomes des cellules de mélanome traitées par DC661-, tandis que le Trolox et la vitamine C n'ont pas réussi à réduire la LLP (Figure 5F). La NAC, le Trolox et la vitamine C, à eux seuls, n’ont eu aucun effet significatif sur la peroxydation lipidique. L'inactivation de PPT1 (Figure 8A supplémentaire) ou un traitement avec des concentrations élevées de HCQ (Figure 8B supplémentaire) ont également induit une LMP qui pourrait être inversée par la NAC, alors que l'inhibition chimique de ULK1 n'a pas induit de LMP (Figure 8C supplémentaire). Il est important de noter que l'inactivation de siPPT1 incluait également la LLP qui pourrait être inversée avec la NAC (Figure 8D supplémentaire). Ces résultats ont montré que l'inhibition de PPT1 induit une LLP qui peut être sauvée par la NAC et est probablement la cause de la LMP induite par l'inhibition de la PPT 1-. De plus, ces résultats suggèrent que la LLP est essentielle à la mort des cellules lysosomales.

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L'importation de cystéine dans les lysosomes par MFSD12 atténue la mort des cellules lysosomales. Parmi les 3 inhibiteurs de la peroxydation lipidique, seule la NAC a empêché la LLP. Un rapport récent a montré que le domaine majeur de la superfamille des facilitateurs contenant 12 (MFSD12) est un composant essentiel de l'importateur de cystéine pour les lysosomes et les mélanosomes (27). Nous avons estimé que la NAC, ou son métabolite cystéine, est transportée dans le lysosome via MFSD12, où la cystéine est oxydée en son disulfure, la cystéine. Pour tester cette hypothèse, nous avons comparé la capacité de la NAC à sauver la cytotoxicité du DC661 dans les cellules siNT et siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Nos résultats ont montré que la NAC a sauvé la LMP induite par les DC 661- dans les cellules siNT mais n'a pas sauvé la LMP dans les cellules siMFSD12 (Figure 6A). La NAC a réduit la LLP des cellules siNT-A375P traitées par DC661-, mais pas des cellules siMFSD12. Les cellules siMFSD12 traitées avec du DMSO ou de la NAC présentaient une augmentation de la LLP basale (Figure 6B) par rapport aux cellules siNT. Alors que la NAC a sauvé la cytotoxicité du DC661 dans les cellules siNT, la capacité de la NAC à sauver la cytotoxicité du DC661 a été complètement supprimée dans les cellules siMSFD12 (Figure 6C). Cela a montré que l’inactivation de MFSD12 bloque les effets cytoprotecteurs de la NAC contre DC661. La NAC est désacétylée par l'acylase dans le cytosol (28). Pour déterminer si le traitement par NAC produit une accumulation de cystéine ou de cystine dans les lysosomes, nous avons utilisé la technique d'immunoprécipitation lysosomale (Lyso-IP) (29) pour purifier les lysosomes des cellules A375P traitées au DMSO et à la NAC (Figure 6D et Figure supplémentaire 9A) et effectué métabolomique ciblée pour quantifier la NAC et les métabolites associés. Comme prévu, la NAC a été détectée dans le lysat de cellules entières traité avec la NAC et dans les fractions non liées associées. Les niveaux de L-cystéine étaient considérablement augmentés dans les lysosomes traités par NAC. La L-cystine n'était détectable que dans les lysosomes traités avec la NAC. De manière frappante, nous n’avons pas trouvé d’augmentation significative du glutathion (réduit) dans les groupes traités par NAC (Figure 6E) ; cela était surprenant car il est communément admis que le traitement par NAC induit une production accrue de glutathion, corrigeant ainsi l’équilibre redox. Ces résultats suggèrent que la cystéine importée dans les lysosomes via l'importateur MFSD12 est essentielle pour sauver les LLP, LMP et la mort des cellules lysosomales. La LLP est immunogène. Certaines formes de mort cellulaire régulée induite par DC661 (pyroptose, nécroptose, ferroptose) ont été identifiées comme immunogènes. Auparavant, la mort cellulaire immunogène a été décrite pour les médicaments de chimiothérapie sur la base de caractéristiques, notamment l'affichage de modèles moléculaires associés aux dommages, notamment l'expression de CALR à la surface cellulaire et la libération de la protéine HMGB1 et de l'adénosine triphosphate (ATP) (30). CALR agit comme un signal « mangez-moi » lorsqu'il est exposé à la surface des cellules pendant un stress cellulaire. La libération extracellulaire de HMGB1 et d'ATP agit comme un signal « Trouvez-moi » reconnu par les cellules phagocytaires. Nous avons comparé deux modèles : les cellules B16F10, qui dans les modèles de tumeurs syngéniques sont presque totalement dépourvues de lymphocytes infiltrant la tumeur, et les cellules MC38, qui, dans les modèles de tumeurs syngéniques, possèdent des lymphocytes infiltrant la tumeur. Tout d’abord, nous avons démontré que le traitement DC661 ou siPpt1 induit de manière significative l’expression de CALR en surface qui peut être complètement abrogée par le co-traitement NAC dans les cellules MC38 (Figures 7, A et B). Des résultats similaires ont été observés dans les cellules B16F10 (Figure 7C). Les inhibiteurs des principales voies de mort cellulaire (apoptose, nécroptose, ferroptose et pyroptose) n'ont pas réussi à empêcher l'expression en surface de CALR (Figure 7D). Pour déterminer si la mort cellulaire immunogène induite par DC661 est due à une régulation positive du CMH de classe I, les cellules B16F10 et MC38 ont été traitées avec DC661 (3 μM) ou DMSO pendant 24 heures. Nous avons constaté que le traitement par DC661 n'augmentait pas l'expression du CMH de classe I et la régulation positive de l'immunoprotéasome (Figure 7E et Figure supplémentaire 9, B et C).

Figure 4. L'inhibition de la cathepsine ou la chélation du calcium n'empêche pas la mort cellulaire induite par les DC661-. (UN)

Pour comprendre les effets de l'inhibition de l'autophagie sur l'amorçage des lymphocytes T, nous avons réalisé une expérience d'amorçage et de coculture in vitro en utilisant des splénocytes C57BL6/J comme décrit précédemment (31). Pour l'amorçage, nous avons exposé les splénocytes à des cellules B16F10 ou MC38 traitées au DC661- ou au DMSO. Ensuite, ces splénocytes amorcés ont été cultivés avec des cellules vivantes B16F10 ou MC38 et la cytotoxicité a été mesurée (Figure 8A). Les splénocytes amorcés avec des cellules B16F10 traitées au DC661- ont produit une augmentation significative de l'IFN- par rapport aux splénocytes exposés aux cellules B16F10 traitées au DMSO. La destruction médiée par les lymphocytes T amorcés des cellules B16F10 en prolifération était significativement augmentée dans les splénocytes amorcés par DC 661- par rapport aux splénocytes amorcés par le DMSO (Figure 8, B et C). Les cellules MC38 traitées avec DC661 ont produit encore plus de cytotoxicité des lymphocytes T amorcés et IFN par rapport aux cellules B16F10 (Figure 8, D et E). Le co-traitement NAC avec DC661 a permis d'abroger complètement la libération d'IFN par les splénocytes et la cytotoxicité des lymphocytes T amorcés (Figure 8, F et G). L'inactivation de la calréticuline par siCalr dans les cellules MC38 (Figure 9D supplémentaire) a annulé l'efficacité d'amorçage du traitement DC661 et a considérablement réduit la cytotoxicité des lymphocytes T amorcés (Figure 8, H et I). Prises ensemble, ces données soutiennent le rôle mécaniste de la régulation positive du CALR associée au LLP dans la promotion de l’immunité des lymphocytes T antitumoraux. Ensuite, nous avons étendu ces résultats in vitro à une étude de vaccination antitumorale in vivo chez des modèles de souris immunocompétentes et immunodéficientes. Pour cet essai, des cellules B16F10 ou MC38 in vitro décongelées ou traitées par DC661- ont été injectées sous-cutanées sur le flanc gauche pour protéger les souris immunocompétentes C57BL/6 ou NOD/SCID contre une nouvelle provocation avec des cellules tumorales vivantes du même type injectées. 7 jours plus tard dans le flanc droit (Figure 9A). Les cellules B16F10 traitées par DC661- n'ont pas réussi à empêcher le rejet de la tumeur malgré des tests in vitro, ce qui suggère que le DC661 a induit la mort cellulaire immunogène (Figure 9B et Figure supplémentaire 9E). En revanche, l'inoculation d'un flanc avec des cellules MC38 traitées par DC661- a favorisé le rejet complet des cellules MC38 vivantes implantées sur le flanc opposé (Figure 9C et Figure supplémentaire 9F). Pour déterminer si l’immunité adaptative était essentielle à l’effet vaccinal que le DC661 semblait avoir sur les tumeurs MC38, nous avons répété l’expérience sur des souris NOD/SCID. De manière frappante, nous avons constaté que les cellules MC38 traitées par DC661- n'induisaient pas le rejet des tumeurs de rechallenge chez les souris NOD/SCID immunodéficientes (Figure 9D et Figure supplémentaire 9G), ce qui indique qu'une immunité adaptative était nécessaire pour l'effet vaccinal observé. Pour tester la robustesse de cette découverte, nous avons sélectionné une autre lignée cellulaire immunogène de cancer de souris bien connue, CT26, et réalisé l'expérience de vaccination comme ci-dessus. Comme prévu, l'implantation de cellules CT26 traitées par DC661- dans un flanc de la souris a produit un effet semblable à celui d'un vaccin et a empêché la croissance de cellules CT26 vivantes implantées sur l'autre flanc (Figure 9E et Figure supplémentaire 9H). Nos résultats suggèrent que la LLP induite par les DC 661- est essentielle à la mort cellulaire immunogène médiée par la LMP, qui est inversée par l'importation de cystéine dans le lysosome par le transporteur lysosomal MFSD12 (Figure 9F).

Discussion

L'inhibition lysosomale semble être une approche thérapeutique prometteuse dans les études précliniques, et les essais cliniques sur l'HCQ ont produit des résultats encourageants mais mitigés (1, 32). PPT1 est la cible moléculaire de l'HCQ, et des inhibiteurs de PPT1 plus puissants, tels que DC661 (2) et GNS561 (3), induisent la mort cellulaire médiée par la LMP in vitro. Le mécanisme précis de la mort des cellules lysosomales et son rôle dans l’immunogénicité tumorale n’ont pas été entièrement élucidés. L'immunité antitumorale est renforcée lorsque l'inhibition de l'autophagie est associée à l'immunothérapie (9, 10, 31). Les mécanismes proposés pour l'immunogénicité intrinsèque des cellules après l'inhibition de l'autophagie comprennent le CMH de classe I et la régulation positive de l'immunoprotéasome, qui soutiennent tous deux un traitement et une présentation améliorés des antigènes. De plus, la perte de protéines de l'autophagie ou l'inhibition de l'autophagie par la chloroquine a augmenté la réponse des lymphocytes T CD8+ en augmentant les niveaux de surface du CMH de classe I dans les cellules dendritiques (33). Nous avons précédemment montré que l'inhibition systémique de la PPT1 peut repolariser les macrophages d'un phénotype M2 à M1. Les inhibiteurs de PPT1 peuvent augmenter les niveaux de STING, conduisant à la libération d’IFN et à l’augmentation de la destruction médiée par les lymphocytes T dans les modèles de mélanome (31). Ici, nous avons démontré que la LLP elle-même produit une forme immunogène intrinsèque de mort cellulaire des cellules tumorales. Nous avons constaté que l'inhibition lysosomale induisait très peu de modifications protéiques dans les cellules cancéreuses, et que les protéines les plus significativement élevées incluaient les récepteurs cargo de l'autophagie et les régulateurs de l'apoptose. Notre approche ciblant certains de ces gènes à travers leurs fonctions a démontré que les protéines induites par les médicaments n'étaient probablement pas les principaux régulateurs de la mort cellulaire. L'inhibition génétique de ULK1 ou d'ATG7 n'a pas non plus sauvé la cytotoxicité du DC661. Nous avons démontré que l'inhibition lysosomale active plusieurs formes de mort cellulaire programmée, notamment l'apoptose, la nécroptose, la ferroptose et la pyroptose, mais chacune d'entre elles était inutile en raison de la cytotoxicité induite par les médicaments. Il convient de noter que les mécanismes programmés de mort cellulaire peuvent se chevaucher et que le co-ciblage de plusieurs mécanismes de mort cellulaire pourrait fournir une cytoprotection contre la mort cellulaire après la perméabilisation de la membrane lysosomale. Nos travaux ont exclu les mécanismes dépendants de la cathepsine et du calcium pour la mort cellulaire lysosomale et ont souligné l'importance de la LLP en tant que déterminant essentiel de la mort cellulaire. Nous avons trouvé des preuves de LLP réversible par un antioxydant transporté dans le lysosome, le NAC, et essentiel à la perméabilisation et à la cytotoxicité de la membrane lysosomale. La NAC était le seul agent capable d'atténuer ou d'inverser la mort cellulaire induite par les DC661-, et cette capacité dépendait de la présence du transporteur de cystéine lysosomale MFSD12. Un manque de pénétration lysosomale explique probablement pourquoi d’autres inhibiteurs putatifs de la peroxydation lipidique, Trolox et la vitamine C, n’ont pas pu prévenir la cytotoxicité du DC661. La NAC est convertie en cystéine, qui est importée dans les lysosomes et s'oxyde en sa forme disulfure, la cystine. La cystine est exportée vers le cytosol par un autre transporteur lysosomal, la cystinose, où elle est réduite en cystéine qui remobilise les sources de nutriments internes, réactive la cible du complexe 1 de la rapamycine et favorise l'autophagie (34). Ce cycle d'oxydo-réduction de la cystéine en cystine (lysosomes) et retour à la cystéine (cytosol) pourrait être un mécanisme de sauvetage possible de la NAC contre la cytotoxicité du DC661 ou une lésion lysosomale plus générale dans d'autres contextes pathologiques où la NAC s'est avérée utile sur le plan thérapeutique (35). . La NAC a non seulement inversé la LLP et la LMP induites par les DC661-, mais également une expression de surface du marqueur de mort cellulaire immunogène, la calréticuline. L'expression à la surface cellulaire de la protéine CALR était nécessaire pour la cytotoxicité accrue médiée par les lymphocytes T induite par les splénocytes amorcés par DC 661-, démontrant que l'inhibition lysosomale produit une forme spécifique d'immunogénicité intrinsèque aux cellules.

Alors que des études antérieures ont démontré que l'inhibition lysosomale peut améliorer l'activité antitumorale de l'inhibition du point de contrôle immunitaire dans les tumeurs du flanc établies (9, 31), notre étude est la première à notre connaissance à démontrer un effet de type vaccin pour les tumeurs MC38 mais pas pour les tumeurs B16. cellules tumorales prétraitées avec DC661 avant l'implantation. Cela démontre que la mort des cellules lysosomales peut induire une immunogénicité cellulaire intrinsèque, mais que ces changements à eux seuls ne sont probablement pas suffisants pour inverser un microenvironnement tumoral « immunisé froid » en un microenvironnement tumoral « immunisé chaud ». Nos études précédentes sur les modèles de microenvironnement tumoral « froid immunitaire » B16 et BRafCA PtenloxP Tyr : modèles de souris génétiquement modifiées CreERT2 (31) ont démontré que l'inhibition lysosomale systémique produisait des effets sur les macrophages associés à la tumeur et les cellules suppressives dérivées de cellules myéloïdes qui étaient suffisants pour améliorer l'efficacité de l'immunothérapie. Il se peut que l’immunogénicité intrinsèque des cellules joue également un rôle dans ces tumeurs immunitaires froides qui deviennent plus sensibles à l’ICD suite à l’inhibition lysosomale. L'effet vaccinal de l'inhibition lysosomale observé dans un environnement de laboratoire contrôlé peut ou non se traduire en clinique, mais il pourrait expliquer pourquoi certains patients traités par dabrafenib, trametinib et HCQ dans un mélanome mutant BRAF précédemment traité présentaient un syndrome si profond et durable. réponse à ce régime (32). Des études plus approfondies sont nécessaires pour comprendre comment l'inhibition de PPT1 produit des ROS lysosomales et une peroxydation lipidique. La régulation dépendante du PPT1- de la V-ATPase et de l'acidification lysosomale n'est pas une explication suffisante car la bafilomycine inhibe l'acidification lysosomale mais ne produit pas de LMP (données non présentées). Les implications de ces résultats suggèrent que les inhibiteurs lysosomal qui améliorent l’immunogénicité intrinsèque des cellules tumorales peuvent être combinés de manière rationnelle avec des thérapies qui améliorent l’activation des lymphocytes T ou leur infiltration dans le microenvironnement tumoral, produisant potentiellement des effets synergiques.

Figure 5. La N-acétylcystéine empêche la mort cellulaire induite par les DC661-. (UN)

Méthodes

Culture de cellules. A375P humain (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) et les lignées cellulaires de souris B16F10 (CRL-6475) ont été achetées auprès de l'ATCC. Les lignées humaines A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 et ​​souris YUMM1.7 (WT, Gsdme EV et Gsdme KO1 et KO2) ont été obtenues en interne. Les cellules de souris MC38 et CT26 ont été fournies par Andy Minn, Université de Pennsylvanie. Des cellules de moelle osseuse primaires Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) dépendantes de FL5.12 et IL-3 ont été obtenues auprès de Kathryn E. Wellen, Université de Pennsylvanie. La lignée cellulaire humaine Panc-1 (CRL-1469, ATCC) a été fournie par Ben Z. Stanger, Université de Pennsylvanie. La lignée cellulaire de souris YUMMER 1.7 a été obtenue auprès de Xiaowei (George) Xu, Université de Pennsylvanie. Toutes les lignées cellulaires ont été testées pour les mycoplasmes tous les deux ans par les installations principales de l'Université de Pennsylvanie et authentifiées à l'aide d'empreintes digitales répétées en tandem court par le noyau Genomics du Wistar Institute. Les lignées cellulaires A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 et Bax/Bak DKO ont été cultivées dans RPMI 1640 (Invitrogen, 11875) ; Les lignées cellulaires A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 et MC38 ont été cultivées dans du DMEM (Invitrogen, 11995); et les cellules YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV et Gsdme KO1 et KO2) (15) ont été cultivées dans DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Les milieux de culture ont été complétés avec 10 % de sérum de veau fœtal (12306C, MilliporeSigma) et une solution antibiotique antimycotique 1 × (Gibco, 15140-122). Les lignées cellulaires FL5.12 et Bax/Bak DKO ont été maintenues dans un milieu RPMI complet complété par 50 μM de -mercaptoéthanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM d'HEPES (H3537, MilliporeSigma) et 0,35 ng/mL et 3,5 ng. /mL IL-3, respectivement. Les lignées cellulaires YUMMER1.7 et YUMM1.7 (WT, Gsdme EV et Gsdme KO) ont été conservées dans un milieu complet complété par 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Les cellules WM35 et WM793 ont été cultivées dans un milieu MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), contenant 10 % de FBS dans un milieu 1 × Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5 % p/v de bicarbonate de sodium ( Corning, 25-035- CI), 1 × solution antibiotique antimycotique (Gibco, 15140-122) et 5 ug/mL d'insuline (MilliporeSigma, I0516). Les cellules ont été cultivées à 37 degrés en présence de 5 % de CO2. Produits chimiques et réactifs. Les produits chimiques achetés comprenaient le sulfate HCQ (Spectrum Chemicals, 747-36-4) et le DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) a été utilisé pour colorer les cellules pour le calcium conformément aux instructions du fabricant. Une liste d’anticorps et d’inhibiteurs est fournie dans le tableau supplémentaire 1 et le tableau supplémentaire 2.

Figure 6. NAC inverse le LLP de manière dépendante du MFSD12-. (A-C)

Extraction et digestion de protéines pour la chromatographie liquide – analyse par spectrométrie de masse en tandem pour la protéomique. {{0}},7 × 106 cellules de mélanome A375P ont été cultivées dans des boîtes de culture de 60 mm. Les cellules ont été traitées avec du DMSO (contrôle), du DC661 (3 μM), du HCQ (10 μM) ou du HCQ (3{{70}} μM) pendant 24 heures à environ 5{{ 112}}% de confluence. Les culots cellulaires congelés ont été lysés avec du Tris 50 mM pH 7,4, du SDS à 1 %, du NaCl 150 mM, de l'EDTA 1 mM, du PMSF 0, 15 mM, 1 ug/mL de pepstatine, et 1 ug/mL de leupeptine. Les lysats clarifiés (1 0 µg chacun) ont été soumis à une électrophorèse sur 0, 5 cm dans un gel de bis-tris, suivi d'une fixation et d'une coloration avec du Coomassie colloïdal. Chaque piste de gel de 0, 5 cm a été excisée, décolorée, réduite avec de la tris (2- carboxyéthyl) phosphine, alkylée avec de l'iodoacétamide et digérée avec de la trypsine comme décrit précédemment (36). Les digestats (1 µg) ont été analysés par chromatographie liquide – spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) sur un spectromètre de masse Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) en ligne avec un nanoAQUITY UPLC (Waters). La séparation analytique a été réalisée sur une colonne Peptide BEH C18 de 1,7 µm × 250 mm (Waters, 186003546) en utilisant un gradient de 245-minutes avec 0,1 % d'acide formique dans l'eau (phase mobile A) et de l'acétonitrile (phase mobile B) comme suit. : 5 % à 30 % B sur 225 minutes, 30 % à 80 % B sur 5 minutes, 15- minute de maintien à 80 % B et retour aux conditions initiales. Les spectres MS complets ont été acquis à une résolution de 70,000, avec une plage de balayage de 400–2,000 m/z, une cible de contrôle automatique du gain de 3 × 106 ions et un temps d'injection maximal de 50 millisecondes. Des spectres MS2 dépendants des données ont été acquis pour les 20 ions les plus abondants à une résolution de 17 500, avec une largeur d'isolement de 1,5 m/z, un objectif de contrôle automatique du gain de 5 × 104 ions et un temps d'injection maximal de 50 millisecondes. La correspondance peptidique a été définie comme préférée et les ions non attribués et chargés une seule fois ont été rejetés (37). Les données brutes de SEP ont été analysées à l'aide de MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) avec une base de données de séquences humaines Uniprot (consultée le 10 octobre 2019) et une base de données de contaminants courants, notamment la trypsine, les kératines, les protéines bovines, et mycoplasme (38). La spécificité du peptide tryptique avec un maximum de 2 clivages manqués, une modification fixe de la cystéine (carbamidométhylation) et une oxydation variable de la méthionine ou une acétylation N-terminale ont été utilisées dans la recherche (39). Un seuil de 1 % de FDR a été utilisé pour les peptides et les protéines. La correspondance entre les exécutions a été activée ; les protéines ont été quantifiées à l'aide d'une quantification sans étiquette (40). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Les protéines devaient être identifiées par au moins 3 peptides uniques et avoir 3 valeurs valides (quantification non nulle) au sein d'un groupe d'échantillons, et les contaminants et les protéines inverses étaient filtrés de l'ensemble de données. Les valeurs manquantes ont été imputées à partir d'une distribution normale. Des comparaisons par paires entre les conditions ont été effectuées au niveau des protéines à l'aide d'un test t de Student 2-queue avec FDR basé sur la permutation avec s0=0,1 et 250 randomisations. Les changements significatifs ont été définis comme un FDR inférieur à 5 % et un changement de facteur absolu supérieur à 1,5 ou 2,0, comme spécifié. Lyso-IP. Les cellules A375P ont été infectées par le lentivirus pLJC5-Tmem192-3xHA et sélectionnées en utilisant 1 mg/mL de puromycine (MilliporeSigma, P4512). Environ 3 x 106 cellules A375P marquées HA ont été traitées avec 10 mM de NAC ou un véhicule témoin aqueux pendant 24 heures dans les conditions de culture décrites précédemment. Après le traitement, les cellules ont été lavées dans du PBS, récoltées dans 0,5 ml de KPBS froid et doucement homogénéisées en utilisant 20 passages dans un homogénéisateur Dounce de 2 ml. Environ 2,5 % de l'homogénat a été réservé à l'analyse du lysat de cellules entières, et le reste a été centrifugé à 3,000g pendant 2 minutes à 4 degrés pour éliminer les débris de membrane cellulaire. Le surnageant de l'homogénat a ensuite été transféré dans un tube propre de 1,5 ml et incubé avec 50 µL de billes anti-HA (Pierce, 88836) ou de billes anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) pendant 15 minutes à 4 degrés. Les échantillons ont ensuite été précipités en plaçant des tubes sur DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) et secoués doucement pendant 2 minutes à température ambiante. Le surnageant était réservé à l’analyse des fractions non liées. IP a été lavé 3 fois avec du KPBS contenant 8 mM de CaCl2. Le Lyso-IP a été extrait dans 80% de MeOH pour l'analyse métabolomique. Extraction et analyse des lipides par LC-MS/MS pour le lipidome global. Les cellules de mélanome A375P ont été ensemencées dans des boîtes de 60 mm à raison de 0, 7 × 106 cellules par boîte. Lorsque les cellules étaient à environ 50 % de confluence, elles ont été traitées avec du DMSO (témoin), du DC661 (3 μM) ou du HCQ (30 μM) pendant 24 heures. Les cellules ont été lavées 2 fois avec du HBSS, grattées dans du méthanol glacé et transférées dans des tubes en verre pour l'extraction des lipides avec du chloroforme/méthanol/NaCl à 0,88 % (2 : 1 : 1) contenant un étalon lipidique interne EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Les échantillons ont été vortexés puis soniqués au bain-marie pendant 5 minutes sur de la glace. Après centrifugation à 500 g pendant 15 minutes à 40 degrés, la phase inférieure a été transférée dans un autre tube en verre. La phase supérieure a été réextraite à l'aide d'une phase inférieure synthétique. Après sonication et centrifugation, la phase inférieure a été combinée avec la première collecte de phase inférieure. Les échantillons ont été séchés sous azote, remis en suspension dans 10 % de chloroforme/90 % de méthanol et transférés dans des flacons en verre LTQ. Les échantillons de lipides ont été analysés sur un spectromètre de masse Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X et un système Vanquish Horizon UHPLC. La séparation analytique a utilisé une colonne Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) avec un rapport 50:50 acétonitrile/eau et 88:10:2 isopropanol/acétonitrile/eau, chacun contenant 5 mM de formiate d'ammonium et 0,1 % d'acide formique. Les données LC-MS/MS ont été acquises séparément dans les polarités positives et négatives avec les paramètres d'instrument suivants : MS1 scan 120, résolution 000 ; MS2 dépendant des données sur les 20 ions les plus abondants à une résolution de 15 000 ; largeur d'isolement de 0,4 m/z ; et une énergie de collision normalisée échelonnée de 20:30:40 (43).

Figure 7. La N-acétylcystéine empêche l'expression de surface de la calréticuline induite par les DC661-. (ANNONCE)

Les lipides ont été identifiés et quantifiés à l'aide de LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Les espèces lipidiques identifiées ont été filtrées par adduits attendus et par grade d'identification en fonction de la classe. Les zones de pic ont été normalisées selon les normes EquiSPLASH pour les classes prises en charge, puis normalisées en fonction de la surface totale de chaque échantillon afin de corriger la variation du nombre de cellules. L'analyse statistique a été réalisée sur des données transformées en log à l'aide de Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extraction et analyse des métabolites par LC-MS/MS pour le métabalone. Les métabolites polaires ont été extraits de cellules entières, de fractions non liées au Lyso-IP et d'échantillons liés au Lyso-IP en utilisant 8 0 % de méthanol et ont été stockés à –8 {{30}} degrés avant la chromatographie liquide. –analyse par spectrométrie de masse (LC-MS). Les extraits ont été analysés par LC-MS à l'aide d'un spectromètre de masse Thermo Scientific Q-Exactive HF-X avec une sonde HESI II en ligne avec un système UHPLC Thermo Vanquish Horizon. La séparation LC a été réalisée à l'aide d'une colonne ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, granulométrie de 5 µm, EMD Millipore) avec une colonne de garde ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) maintenue à 45 degrés avec un débit. de 0,2 ml/min. La chromatographie a été réalisée dans des conditions acides pour réduire la réactivité des groupes thiol. La phase mobile A était de l'eau et B était de l'acétonitrile, toutes deux contenant 0,1 % d'acide formique. Le gradient LC était de 85 % de B pendant 2 minutes, de 85 % de B à 20 % de B sur 15 minutes, de 20 % de B à 85 % de B sur 0,1 minute et de 85 % de B pendant 8,9 minutes. L'échantillonneur automatique a été maintenu à 4 degrés et 4 µL de chaque échantillon ont été injectés par analyse. Les paramètres MS suivants ont été utilisés : débit de gaz gainant, 40 UA ; débit de gaz auxiliaire, 10 AU ; débit de gaz de balayage, 2 AU ; température du chauffage auxiliaire au gaz, 350 degrés ; tension de pulvérisation, 3,75 kV pour le mode positif et 3,5 kV pour le mode négatif ; température capillaire, 375 degrés ; et niveau RF de l'entonnoir, 40 %. Tous les échantillons ont été analysés par MS complète avec commutation de polarité. Des analyses MS complètes ont été acquises de 65 à 975 m/z à une résolution de 120,000 avec une cible de contrôle automatique du gain de 1 × 106 ions et un temps d'injection maximum de 100 millisecondes. Les données brutes ont été analysées à l'aide de TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Les métabolites ciblés ont été identifiés par leur masse et leur temps de rétention précis dans leur polarité préférée sur la base de normes analytiques. La détection des pics a utilisé l'algorithme ICIS avec un lissage de 1. La quantification relative a été effectuée à l'aide d'une zone de pic intégrée et ces valeurs ont été corrigées par rapport à la quantité totale par échantillon (définie comme la zone de pic totale). Édition PPT1-CRISPR/Cas9. Des cellules A375P PPT 1- non cibles et KO ont été préparées comme décrit précédemment (44). pSpCas9 (BB) -2 A-Puro (PX459) était un cadeau de Feng Zhang (plasmide Addgene, 48139). Les oligos d'ARN guide (IDT) ont été annelés, phosphorylés, puis ligaturés dans le plasmide pX459 digéré et déphosphorylé par BbsI selon les protocoles du laboratoire Zhang, disponibles via Addgene. Les plasmides ligaturés ont été transformés dans des cellules Stbl3 (Invitrogen). Le séquençage des préparations plasmidiques a confirmé la présence des séquences d’ARN guide souhaitées. Les cellules A375P ont été transfectées en utilisant de la Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), suivie d'une sélection de puromycine. Les tests des enquêteurs ont confirmé l'édition du gène PPT1 par CRISPR/Cas9, et l'inactivation de PPT1 a été confirmée par Western blot avec l'anticorps PPT1 (Origene). Les séquences pour les oligos d'ARN guide sont les suivantes : ARN guide non cible vers l'avant (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ARN guide non cible inverse (AAACGCGCCGGACACGTTCGCTAC), ARN guide PPT1 humain 1 avant (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), ARN guide PPT1 humain 1 inverse (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), ARN guide PPT1 humain 3 en avant (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) et l'ARN guide PPT1 humain 3 inverse (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Les clones cultivés à partir de cellules uniques utilisés dans cet article sont les suivants : le clone C8 est le guide humain 1 et le clone B5 est le guide humain 3. Immunoblot. Un million de cellules ont été étalées dans une boîte de 10 cm et les traitements ont été administrés le lendemain ; les cellules ont été collectées par grattage. Des lysats de cellules entières ont été préparés en utilisant un tampon de lyse SDS. La concentration en protéines a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage de protéines Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30 à 50 µg de protéine ont été utilisés pour SDS-PAGE et transférés sur une membrane PVDF (Bio-Rad, 1620177). La membrane a été bloquée avec 5 % de BSA ou 5 % de lait écrémé, selon des conditions optimisées, et incubée avec un anticorps primaire pendant la nuit à 4 degrés. Les membranes PVDF ont été lavées avec 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS -9997) et incubées pendant 1 heure à température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP spécifique à l'espèce. Les membranes ont ensuite été lavées et développées à l'aide d'un substrat Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) et de films d'autoradiographie (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Pour les études de pyroptose, les lysats de protéines ont été séparés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF. Après blocage dans 5 % de BSA, les membranes de PVDF ont été incubées avec les anticorps primaires indiqués pendant une nuit à 4 degrés, lavées dans du PBS/Tween et incubées avec des anticorps secondaires couplés à la peroxydase. L'immunoréactivité a été détectée à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à la HRP (CalBioTech), d'un substrat de chimiluminescence (Thermo Fisher Scientific) et d'un système d'imagerie ChemicDoc MP (Bio-Rad). Pour les expériences impliquant du surnageant, les cellules ont été cultivées dans un milieu sans FBS pour éviter la distorsion du SDS-PAGE. Les surnageants cellulaires ont été récoltés et centrifugés pendant 10 minutes à 500 g à 4 degrés pour éliminer les débris cellulaires. Les surnageants résultants ont été concentrés 10 fois en utilisant Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) par centrifugation pendant 30 minutes à 4 500 g à 4 degrés. Les concentrés ont été mélangés avec un tampon d'échantillon et analysés par Western blot comme décrit ci-dessus. La coloration sur gel protéique a été réalisée en utilisant la coloration au rouge Ponceau. Test d'activité LMP et cathepsine L. Le plasmide humain pEGFP-hGal3 était un cadeau de Tamotsu Yoshimori (plasmide Addgene, 73080) et a été utilisé pour créer la lignée A375P-Galectin-3. Le squelette du vecteur plasmidique de contrôle pEGFP-C1 a été acheté (novo prolabs, V012024). Les plasmides ont été transfectés (1 µg/mL) dans des cellules A375P en utilisant de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) selon le protocole du fabricant ; les cellules transfectées ont été sélectionnées de manière stable en utilisant G418 (Gibco, 10131035). Pour le LMP, un total de 25 cellules poncta-positives pour l'A375P-galectine -3 dans plusieurs champs d'image ont été comptées. Le pourcentage de cellules poncta-positives a été calculé séparément dans chaque champ et un pourcentage moyen a été calculé pour chaque groupe. Le kit de test Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) a été utilisé conformément au protocole du fabricant. Les cellules ont été imagées sous un microscope inversé Zeiss Axio Observer 7. L'intensité intégrée brute de Magic Red a été calculée à l'aide du logiciel Fiji - ImageJ (NIH). Test de viabilité cellulaire MTT (3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, bromure de 5 diphényltétrazolium). 2 000 cellules ont été étalées en triple dans chaque puits d'une plaque à puits 96-, et des tests MTT de 3- jours ont été effectués à l'aide du kit de viabilité cellulaire (Roche, 11465007001) selon le protocole du fabricant. Un prétraitement par inhibiteur a été administré pendant 1 heure, suivi d'un co-traitement des cellules avec des inhibiteurs avec ou sans DC661. La méthode de régression non linéaire (ajustement de courbe) a été utilisée pour calculer la CI50.

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Test de formation de colonies. 2,000 cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque à 6-puits et ont été traitées le lendemain ; les cellules ont été maintenues sous traitement pendant un total de 8 jours. Les colonies formées dans chaque puits ont été lavées avec du PBS, fixées avec du méthanol froid à –2 0 degrés pendant 20 minutes et colorées avec une solution aqueuse à 0, 5% de Crystal violet (V5265; MilliporeSigma).

Test d’exclusion du colorant bleu trypan. Le mélange réactionnel pour le test au bleu Trypan a été préparé en mélangeant 1 partie de 0,4 % de bleu Trypan (25- 900-CI, Corning) et 1 partie d'échantillons de cellules dilués. Le mélange a été incubé pendant 1 minute et les cellules ont été comptées sur Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Figure 8. L'expression de surface de la calréticuline induite par DC661- amorce les cellules T contre les cellules tumorales. (UN)

Figure 9. L'inoculation de cellules traitées par DC661- produit un rejet de tumeur dans des contextes spécifiques. (UN)

MOUSSE-LPO. LLP a été étudiée à l’aide d’une sonde fluorescente, FOAMLPO. FOAM-LPO a été synthétisé comme décrit précédemment (26). Les cellules ont été cultivées sur une lame à 8 puits (ibid, 80807) et traitées avec des inhibiteurs et avec ou sans DC661. Les cellules ont été incubées avec un milieu contenant du FOAM-LPO (1 M) dans une atmosphère de 5 % de CO2 et 95 % d'air pendant 5 minutes à 37 degrés. Les cellules ont été lavées deux fois avec un milieu, puis les cellules ont été observées au microscope (microscope inversé Zeiss Axio Observer 7) pour détecter le déplacement de la fluorescence de 586 à 512 nm en réponse au LLP. qRT-PCR et amorces. Les cellules A375P (3 x 105 ) ont été cultivées dans des boîtes de 60 mm et ont été traitées avec du DMSO ou du DC661 (3 µM) pendant 24 heures. L'ARN total a été isolé avec un kit d'isolement d'ARN (QIAGEN, 74134) selon le protocole du fabricant. L'ADNc a été synthétisé à l'aide d'un kit iScript Reverse Transcriptase avec 500 ng d'ARN purifié conformément au protocole du fabricant (Thermo Scientific, K1642). La réaction qPCR a été mise en place à l'aide du SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) contenant 1 µL d'ADNc. Toutes les mesures ont été effectuées en triple et BACTIN a été utilisé comme étalon interne pour les calculs ΔCT. L'analyse de l'expression génique a été réalisée à l'aide des amorces suivantes : PTGS2/COX-2 forward (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 reverse (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS forward (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS reverse (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 forward (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 inverse (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN forward (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) et BACTIN reverse (CCAGAGGCGTACAGGATAGCAC).

Transfection d'ARNsi. Des études d'inactivation génétique pour ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 et MFSD12 humains ont été réalisées dans des lignées cellulaires A375P. Des études d'inhibition génétique pour la Ppt1 et la Calréticuline de souris ont été réalisées dans des cellules MC38. siRNA non cible (sc{{10}}), ULK1 humain (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), Ppt1/Cln1 de souris (sc-142398) et Calréticuline Les siARN /Calregulin (sc-29895) ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology. Ces siARN sont constitués de pools de 3 à 5 siARN spécifiques à une cible. Cytométrie en flux. L'induction de la ferroptose a été mesurée à l'aide de C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Les cellules A375P ont été ensemencées dans une plaque à puits 6- et traitées avec du DMSO, de la ferrostatine {{40}} (10 μM), de la roxstatine pour les lèvres -1 (2 μM), de l'élastine (5 μM ), DC661 (3 μM) ou une combinaison pendant 24 heures. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 300 g pendant 5 minutes. Les cellules ont été remises en suspension dans 500 μL de HBSS 1X (Corning, 21-023-CV) contenant 1 μM de C11-BODIPY et incubées à 37 degrés pendant 15 minutes. Les cellules ont été mises en pellets et remises en suspension dans 500 μL de HBSS 1X, et l'intensité de la fluorescence a été mesurée sur un cytomètre BD LSRII en utilisant du bleu 530/30 (Flow Core Facility de l'Université de Pennsylvanie). La quantification de l'expression de la calréticuline à la surface cellulaire pour la mort cellulaire immunogène a été réalisée comme décrit précédemment (45) par cytométrie en flux. Les cellules B16F10 ou MC38 ont été cultivées et traitées avec NAC (10 mM) ou DC661 (3 µM) pendant 24 heures. Les cellules MC38 ont été traitées avec siPpt1 ou siNT pendant 48 heures en présence ou en absence de 10 mM de NAC pendant 24 heures. Les cellules ont été colorées avec l'anticorps CALR (Cell Signaling Technology, 12238), le deuxième anticorps de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 647 (Invitrogen) et l'iodure de propidium (PI) (Biolegend, 421301). Les échantillons colorés ont été acquis sur un cytomètre en flux BD LSRII en utilisant 710/50 Blue et 670/30 Red pour capturer respectivement la fluorescence PI et CALR (installation Flow Core de l'Université de Pennsylvanie), et l'analyse a été limitée aux cellules CALR-positives et PI-négatives. pour éviter les événements faussement positifs. Amorçage des lymphocytes T et pourcentage de cytotoxicité. Les cellules tumorales B16 ou MC38 (5 × 104) ont été cultivées et traitées avec NAC (10 mM) ou DC661 (1 μM ou 3 μM), respectivement pendant 24 heures. Pour l'inhibition génétique de Calr, les cellules MC38 ont été traitées avec du siARN Calr ou du siARN non cible (siNT) pendant 48 heures, suivi d'un traitement avec du DMSO ou du DC661 à 3 μM pendant 24 heures. Les splénocytes ont ensuite été cultivés avec DC661 avec ou sans cellules B16 ou MC38 en présence d'IL-2 (5 UI/mL) et co-cultivés pendant 72 heures. L'amorçage a été confirmé par IFN-ELISA (Biolegend, 430815) du surnageant. Les splénocytes amorcés ont ensuite été co-cultivés avec des cellules B16 ou MC38 fraîchement cultivées avec des rapports cible/effecteur (B16 ou MC38 par rapport aux splénocytes) de 1:20 et 1:50 pour les cellules B16 et MC38, respectivement. La libération de LDH associée à la mort des cellules B16 ou MC38, puis le pourcentage de cytotoxicité ont été mesurés selon le protocole du fabricant (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Tests de vaccination antitumorale et études de chimiothérapie avec des modèles de cancer établis. Des souris femelles WT C57BL/6, NOD/SCID et BALB/c âgées de six à huit semaines ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory. Pour les expériences de vaccination antitumorale, les cellules WT B16F10, MC38 et CT26 ont été traitées avec du DC661 (3 µM) pendant 36 heures dans des flacons de 175 cm2. Ensuite, les surnageants et les cellules détachées ont été collectés dans un tube Falcon de 50 ml. Les cellules ont été centrifugées et lavées avec du PBS glacé. Pour la vaccination, 150 µL de suspension cellulaire ont été injectés par voie sous-cutanée dans le flanc gauche de souris immunocompétentes C57BL/6, de souris immunodéficientes NOD/SCID (1,8 × 104 cellules B16F10, 1,5 × 106 cellules MC38 par souris) ou de souris syngéniques BALB/c (3,0 × 106 cellules CT26 par souris). Les cellules décongelées remises en suspension dans du PBS ont été injectées comme contrôle négatif. Une semaine plus tard, des cellules cancéreuses vivantes du même type (3 × 104 cellules B16F10, 2 × 105 cellules MC38 ou 5 × 105 cellules CT26 par souris) avec un volume égal de Matrigel (Corning, 354248) ont été injectées dans le flanc droit. de souris vaccinées. Les tumeurs ont été mesurées à l'aide d'un pied à coulisse électronique et le volume a été calculé comme suit : L × W2 × 0,5. La croissance tumorale a été régulièrement surveillée pendant les jours suivants et l'absence de tumeurs a été considérée comme une indication d'une vaccination antitumorale efficace. Des études de vaccination DC661-MC38 ont été répétées chez des souris NOD/SCID. Statistiques. La signification statistique a été déterminée en utilisant le test t non apparié 2-queue de Student lors de la comparaison de 2 groupes. La 1- manière dont le test ANOVA a été utilisé lorsque plus de deux groupes ont été comparés. Une hypothèse nulle était significativement rejetée si la valeur de P était inférieure à 0,05. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Approbation de l’étude. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.

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